張應(yīng)力刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質(zhì)細胞Runx2表達調(diào)控的體外研究

李書琴 楊珊 任嬡姝 戴紅衛(wèi)

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 401147

牙齒移動過程中，牙根受力會發(fā)生一定程度的吸收及修復(fù)。成牙骨質(zhì)細胞是力學(xué)敏感細胞，與牙根部牙骨質(zhì)吸收后的修復(fù)密切相關(guān)。Wnt/β-catenin是與力學(xué)刺激和成骨效應(yīng)都有相關(guān)的信號通路，力學(xué)刺激能夠激活成骨細胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號通路，促進成骨細胞Runx2的表達。目前力學(xué)刺激下Wnt/β-catenin信號通路對成牙骨質(zhì)細胞Runx2表達的調(diào)控作用尚未可知。本研究通過張應(yīng)力刺激以及特異性阻斷劑的干預(yù)，以Runx2為切入點，研究張應(yīng)力刺激對成牙骨質(zhì)樣細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活效應(yīng)以及該通路對Runx2的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

成牙骨質(zhì)細胞株OCCM30（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院白丁教授惠贈）。BioFlex加力板（Flexcellint公司，美國）。阻斷劑Dikkopf-1（DKK1）（Sino biological公司，美國，目錄號：10170-H08H）。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本）；FX4000T加載裝置（Flexcellint公司，美國），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（尼康公司，日本），F(xiàn)TC2000型RT-PCR基因擴增儀、FTC2000型聚合酶鏈反應(yīng)合成儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司），高速低溫離心機（Heraeus公司，德國），凝膠成像及圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。本實驗?zāi)康幕騌unx2以及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，其序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2 研究方法

1.2.1 OCCM30的培養(yǎng) 將同一批傳代的細胞按每毫升1×105個細胞的密度接種于BioFlex加力板上，每板加入培養(yǎng)液（90%體積分數(shù)DMΕM，10%小牛血清，1%青霉素+鏈霉素）2 mL，于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)（37 ℃；5%CO2，95%空氣），每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 應(yīng)力加載下Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達 待細胞生長鋪滿培養(yǎng)板底80%～90%時，將加力板置于FX4000T加力系統(tǒng)的孵箱中進行應(yīng)力加載（加載參數(shù)為12%形變，1 Hz，1/2正弦波）。實驗分為4個組，3個實驗組分別加載3、6、12 h，對照組在相同孵箱內(nèi)培養(yǎng)但不加力。力學(xué)加載結(jié)束后收集細胞樣本，采用RT-PCR法半定量分析Runx2 mRNA的表達，Western blot法檢測β-catenin蛋白的表達。

1.2.3 阻斷劑對Runx2 mRNA和β-catenin蛋白表達的影響 將同一批傳代的細胞按每毫升1×105個細胞的密度接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待生長到60%～70%時，將質(zhì)量濃度分別為20、50、80、100、150 ng·mL-1的DKK1分別加入培養(yǎng)板中，對照組加入PBS液，繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集樣本，檢測Runx2 mRNA和βcatenin蛋白的表達。根據(jù)檢測結(jié)果選擇信號通路阻斷效果最佳的DKK1質(zhì)量濃度用于后續(xù)實驗。

1.2.4 應(yīng)力加載以及阻斷劑處理對Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達的影響 將實驗分為A、B、C、D共4組，A組不加力不加阻斷劑，B組加力并加阻斷劑，C組加力不加阻斷劑，D組不加力加阻斷劑。同一批傳代的細胞按每毫升1×105個細胞的密度分別接種于A、B、C、D四組加力板中，生長至60%～70%時，B、D組加入150 ng·mL-1DKK1，其余兩組加入PBS液，48 h后，加力組即B、C組放入加力系統(tǒng)（12%形變，1 Hz，1/2正弦波）的孵箱加力12 h，A、D組放入相同孵箱但不加力。培養(yǎng)12 h后檢測4組細胞Runx2 mRNA和β-catenin蛋白表達的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

以上實驗均重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用LSD檢驗進行組間多重比較，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)力加載對成牙骨質(zhì)細胞Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達的影響

張應(yīng)力加載3、6、12 h后，成牙骨質(zhì)細胞內(nèi)Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達情況見圖1、2。與對照組相比，加力后Runx2 mRNA和β-catenin蛋白的表達均增強（P＜0.05）。隨著加力時間延長，β-catenin表達水平及Runx2 mRNA表達活性均呈上升趨勢。

圖1 應(yīng)力加載0、3、6、12 h后Runx2 mRNA的相對表達量Fig 1 Relative expression of Runx2 mRNA loaded by stress for 0,3,6,12 h

圖2 應(yīng)力加載0、3、6、12 h后β-catenin蛋白的相對表達量Fig 2 Relative expression of β-catenin protein loaded by stress for 0,3,6,12 h

2.2 阻斷劑處理對成牙骨質(zhì)細胞Runx2 mRNA和βcatenin蛋白表達的影響

阻斷劑處理后Runx2 mRNA的表達情況見圖3，β-catenin表達情況見圖4：經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DKK1處理后，細胞內(nèi)Runx2 mRNA和β-catenin的表達總體上均有下降趨勢。DKK1質(zhì)量濃度為20、50 ng·mL-1時，Runx2 mRNA表達量與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），經(jīng)80、100、150 ng·mL-1的DKK1處理后，Runx2 mRNA表達量下降，與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。經(jīng)5種質(zhì)量濃度的DKK1處理后，β-catenin蛋白的表達量較對照組均明顯下降（P＜0.05）（圖4）。DKK1的質(zhì)量濃度達到150 ng·mL-1時，β-catenin蛋白的表達量減少最明顯，說明150 ng·mL-1的DKK1能有效抑制成牙骨質(zhì)細胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達活性。由此可見，不同質(zhì)量濃度的阻斷劑阻斷效應(yīng)不一樣，隨著質(zhì)量濃度的增大，阻斷效應(yīng)也越強，對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的抑制作用也越強。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性在150 ng·mL-1的DKK1作用下活性最低，可被有效抑制，因此作為本研究后續(xù)使用DKK1的最佳濃度。

圖3 不同質(zhì)量濃度DKK-1處理后Runx2 mRNA的相對表達量Fig 3 Relative expression of Runx2 mRNA proceed by DKK-1 of different concentrations

圖4 不同質(zhì)量濃度DKK-1處理后β-catenin蛋白的相對表達量Fig 4 Relative expression of β-catenin protein proceed by DKK-1 of different concentrations

2.3 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后β-catenin蛋白以及Runx2 mRNA的表達

應(yīng)力加載及阻斷劑處理后β-catenin蛋白的表達情況見圖5：A、D組比較，未加載張應(yīng)力的情況下，DKK1明顯抑制了β-catenin蛋白的表達，Wnt/β-catenin通路被抑制；B、C組比較，加載張應(yīng)力的情況下，DKK1處理組β-catenin蛋白表達明顯低于未加DKK1處理組；A、C組比較，不加阻斷劑時，張應(yīng)力刺激增強了β-catenin蛋白的表達；B、D組比較，阻斷劑作用后，應(yīng)力刺激組β-catenin蛋白表達相對較高。

圖5 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后各組β-catenin蛋白的相對表達量Fig 5 Relative expression of β-catenin protein proceed by DKK-1 of different concentrations and loaded by stress

應(yīng)力加載及阻斷劑處理后Runx2 mRNA的表達情況見圖6：B、C組比較，張應(yīng)力刺激下，C組Wnt/β-catenin通路活性較高，此時Runx2基因的表達也表現(xiàn)為C組高于B組；B、D組比較，Wnt/β-catenin通路同時被抑制的狀態(tài)下，加力組細胞通路活性仍高于不加力組，即B組活性高于D組，此狀態(tài)下B組Runx2基因的表達也高于D組；而未加載張應(yīng)力的A、D組結(jié)果與本研究前述結(jié)果一致，抑制Wnt/β-catenin通路后，Runx2基因的表達相對未抑制組降低。

圖6 應(yīng)力加載及阻斷劑處理后各組Runx2 mRNA的相對表達量Fig 6 Relative expression of Runx2 mRNA proceed by DKK-1 of different concentrations and loaded by stress

3 討論

Runx2是一個力學(xué)相關(guān)因子，應(yīng)力刺激可促進其在細胞內(nèi)的表達。應(yīng)力環(huán)境下，牙周組織中的牙周膜細胞、成骨細胞均被證實為Runx2的靶細胞[1-3]。成牙骨質(zhì)細胞位于牙周膜中牙骨質(zhì)表面。本研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，張應(yīng)力刺激促進了Runx2 mRNA在成牙骨質(zhì)細胞中的表達。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的第二信使，細胞核內(nèi)β-catenin水平直接反映了該信號通路的活化水平[4]。本研究結(jié)果表明，張應(yīng)力加載后，OCCM30細胞核內(nèi)β-catenin的水平與對照組相比都增高，證實張應(yīng)力刺激激活了OCCM30內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路，在加載的12 h內(nèi)細胞核內(nèi)積聚的β-catenin量逐漸增多，說明在加載的12 h作用時間內(nèi)，Wnt信號通路都處于激活狀態(tài)，且隨著加力時間的延長活性增強。

本研究中，張應(yīng)力刺激下細胞內(nèi)β-catenin蛋白和Runx2 mRNA均增多，表明張應(yīng)力刺激既能激活Wnt/β-catenin信號通路又能上調(diào)Runx2基因的表達。Runx2的活性水平由許多因素調(diào)控，信號通路是其中之一。一些與成骨相關(guān)的細胞信號傳導(dǎo)通路可以通過激活輔助因子與Runx2的相互作用正向或負向調(diào)控其與DNA結(jié)合或轉(zhuǎn)錄活性，或者通過影響Runx2啟動子來實現(xiàn)對其表達的調(diào)控[5]。另外許多關(guān)于細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ΕRK）信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，該通路也能調(diào)節(jié)Runx2的表達。有學(xué)者[6]用敲除分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled-related proteins 1，SFRP1）后的小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路被激活后，Runx2 mRNA以及Runx2啟動子活性均增強，并且其下游骨鈣素基因表達上調(diào)形成新骨。這說明Runx2是Wnt信號通路中的一個效應(yīng)因子，Wnt/βcatenin信號通路調(diào)控成骨細胞分化至少部分是通過Runx2基因表達的活性實現(xiàn)的[7]。

本研究中，當Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路被抑制后，Runx2基因的表達也有減少，說明Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路對成骨效應(yīng)因子Runx2有調(diào)控作用，且抑制該通路Runx2 mRNA的表達表現(xiàn)為下調(diào)的趨勢，進一步說明Wnt/β-catenin信號通路可能通過影響Runx2基因表達進而影響成牙骨質(zhì)細胞的成骨效應(yīng)。正畸治療中，矯治力是影響牙根吸收后修復(fù)及牙周組織再生的關(guān)鍵因素，本研究僅僅證明了Wnt/β-catenin信號通路可以調(diào)控Runx2因子，對應(yīng)力促進成牙骨質(zhì)細胞成骨效應(yīng)機制還不能清楚說明，研究加載應(yīng)力模擬臨床正畸矯治力的情況下兩者關(guān)系是十分有必要的。

張應(yīng)力刺激作用能夠激活成牙骨質(zhì)細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路。無張應(yīng)力刺激作用時，阻斷該信號通路Runx2基因的表達減少；而張應(yīng)力刺激下，抑制Wnt/β-catenin通路活性，Runx2基因的表達也相應(yīng)減少。由此可見，張應(yīng)力刺激上調(diào)Runx2基因的表達機制中Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮了促進作用。應(yīng)力刺激后，成牙骨質(zhì)細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路被激活，Runx2基因表達水平也上調(diào)，說明在正畸治療過程中成牙骨質(zhì)細胞仍能發(fā)揮成骨分化的功能，促進牙根吸收后的修復(fù)。除了Wnt/β-catenin通路外，可能還存在其他調(diào)控因素影響Runx2基因的表達。類似對成骨細胞的研究[8]也表明，力學(xué)刺激能夠促進成骨細胞的成骨分化。還有學(xué)者[9-10]通過激活和阻斷成牙骨質(zhì)細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路可以抑制成牙骨質(zhì)細胞的分化但促進其增殖。但是，成牙骨質(zhì)細胞在正畸治療過程中的生物學(xué)功能還存在爭議，尚需要進一步研究。

[1]Ziros PG,Basdra ΕK,Papavassiliou AG.Runx2:of bone and stretch[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,40(9):1659-1663.

[2]Ziros PG,Gil AP,Georgakopoulos T,et al.The bone-specif ic transcriptional regulator Cbfa1 is a target of mechanical signals in osteoblastic cells[J].J Biol Chem,2002,277(26):23934-23941.

[3]Li J,Jiang L,Liao G,et al.Centrifugal forces within usuallyused magnitude elicited a transitory and reversible change in proliferation and gene expression of osteoblastic cells UMR-106[J].Mol Biol Rep,2009,36(2):299-305.

[4]Moon RT.Wnt/beta-catenin pathway[J].Sci STKΕ,2005(271):cm1.

[5]Guo Y,Zhang CQ,Zeng QC,et al.Mechanical strain promotes osteoblast ΕCM formation and improves its osteoinductive potential[J].Biomed Εng Online,2012,11:80.

[6]Pasold J,Osterberg A,Peters K,et al.Reduced expression of Sfrp1 during chondrogenesis and in articular chondrocytes correlates with osteoarthritis in STR/ort mice[J].Εxp Cell Res,2013,319(5):649-659.

[7]Ohazama A,Courtney JM,Sharpe PT.Opg,Rank,and Rankl in tooth development:co-ordination of odontogenesis and osteogenesis[J].J Dent Res,2004,83(3):241-244.

[8]Liedert A,Wagner L,Seefried L,et al.Εstrogen receptor and Wnt signaling interact to regulate early gene expression in response to mechanical strain in osteoblastic cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,394(3):755-759.

[9]Tamura M,Nemoto Ε,Sato MM,et al.Role of the Wnt signaling pathway in bone and tooth[J].Front Biosci:Εlite Εd,2010,2:1405-1413.

[10]Nemoto Ε,Koshikawa Y,Kanaya S,et al.Wnt signaling inhibits cementoblast differentiation and promotes proliferation[J].Bone,2009,44(5):805-812.