甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究進(jìn)展

譚 偉，謝芝勛

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

流感病毒屬于正黏病毒科，是單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA 病毒。流感病毒基因組約為13kb，含有8個(gè)基因節(jié)段，分別編碼血凝素（haemagglutinin，HA）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）、M1 基質(zhì)蛋白（matrix protein 1，M1）、M2 離子通道蛋白（M2ion－channel protein，M2）、NP核蛋白（nucleoprotein，NP）、NS 非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteins，NS1、NS2）及RNA 聚合酶復(fù)合體（PB1蛋白、PB2蛋白、PA 蛋白）［1－3］。按照甲型流感病毒基因的大小，可將它們分為8個(gè)基因節(jié)段，即節(jié)段1（PB2基因）、節(jié)段2（PB1 基因）、節(jié)段3（PA 基因）、節(jié)段4（HA 基因）、節(jié)段5（NP 基因）、節(jié)段6（NA 基因）、節(jié)段7（M 基因）和節(jié)段8（NS基因）［1］。

目前的研究發(fā)現(xiàn)流感病毒至少可編碼15種病毒蛋白［4］，其中PB2基因、HA 基因、NP基因和NA基因只能分別編碼1種蛋白，它們分別是PB2、HA、NP及NA 蛋白。而PB1基因、PA 基因、M 基因和NS基因則能分別編碼2種或2種以上的病毒蛋白，如PB1基因可以編碼PB1、PB1－F2及PB1－N40 3種蛋白；PA 基因能編碼PA、PA－X、PA－N155 和PAN182 4種蛋白；M 基因可以編碼M1、M2和M42 3種蛋白；而NS 基因則能編碼NS1 和NS2 2 種蛋白［4］。

M 基因在未經(jīng)剪接的情況下產(chǎn)生mRNA1 轉(zhuǎn)錄體，只編碼M1 基質(zhì)蛋白。2012 年Wise H M等［4－5］發(fā) 現(xiàn) 流 感 病 毒M 基 因 經(jīng)mRNA 選 擇 性 剪 接后可產(chǎn)生3 種不同結(jié)構(gòu)的mRNAs，即mRNA2、mRNA3和mRNA4。mRNA2可編碼由97個(gè)氨基酸（amino acid，aa）組成的M2離子通道蛋白；mRNA3可能會(huì)編碼由9 個(gè)aa 組成的一個(gè)短肽；而mRNA4則編碼一個(gè)新的流感病毒蛋白，即M42蛋白，由99個(gè)aa所組成［5］。本文將對(duì)流感病毒M 基因所編碼的M1、M2及M42蛋白進(jìn)行深入介紹。

1 M1基質(zhì)蛋白

流感病毒M 基因含1 027 個(gè)核苷酸（nucleotides，nt），編碼由252個(gè)aa組成的、分子質(zhì)量約為28ku的M1蛋白［1］。M1蛋白在流感病毒顆粒中的含量最高，每個(gè)病毒顆粒大約含有3 000 個(gè)M1 蛋白［1］。M1蛋白位于病毒囊膜下，起到連接病毒囊膜和核衣殼的作用，并可影響病毒的形態(tài)及構(gòu)型。M1蛋白在病毒感染細(xì)胞的后期才被合成，能與病毒核糖核蛋白體（viral ribonucleoproteins，vRNPs）相互作用，抑制病毒mRNA 的轉(zhuǎn)錄，并協(xié)助vRNPs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿［6］。M1蛋白與流感病毒復(fù)制有關(guān)，能與HA 及NA 蛋白相互作用，并參與病毒子粒的裝配及釋放［6－7］。

1.1 M1蛋白含有細(xì)胞核定位信號(hào)及核外運(yùn)信號(hào)

在流感病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，大部分M1蛋白與鑲嵌于細(xì)胞膜中的HA 及NA 蛋白的C 末端相結(jié)合，而另一部分M1蛋白則可以進(jìn)入細(xì)胞核，這是因?yàn)镸1 蛋白含有核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）［6－7］。M1 蛋 白 可 分 為3 個(gè) 區(qū)，即N 末端區(qū)、中間區(qū)和C 末端區(qū)。N 末端區(qū)（aa1－aa86）含有 核 外 運(yùn) 信 號(hào)（nuclear export signal，NES）（59ILGFVFTLTV68）［8］；中間區(qū)（aa87－aa164）有一富含堿性氨基酸的區(qū)域，內(nèi)有1 個(gè) NLS（95KAVKLYRKLKR105）及與NS2蛋白結(jié)合的位點(diǎn)；C 末 端 區(qū)（aa165－aa252）能 與vRNPs 相 互 作用［6］。在成熟的病毒顆粒內(nèi)，M1蛋白以2種形式存在，與鋅結(jié)合和不與鋅結(jié)合的形式，提示鋅可能參與調(diào)節(jié)M1蛋白的功能［9］；另外，M1蛋白的磷酸化狀態(tài)也會(huì)影響M1蛋白的功能，從而影響流感病毒復(fù)制［10－11］。

1.2 M1蛋白和NS2蛋白共同參與vRNPs的核外運(yùn)過(guò)程

與大多數(shù)RNA 病毒不同，流感病毒是在被感染細(xì)胞的核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的［12］。在流感病毒感染細(xì)胞的早期階段，vRNPs需要從細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核；而在病毒感染的晚期階段，vRNPs則需要從細(xì)胞核被運(yùn)送到細(xì)胞漿，參與新的病毒顆粒的裝配。vRNPs的主要成分包括病毒RNA、NP 蛋白及RNA 聚合 酶 復(fù) 合 體（PB1、PB2、PA）［6－7］。據(jù) 報(bào) 道，M1蛋白、NS2 和NP 蛋白均參與將流感病毒的vRNPs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿的過(guò)程［8，13－15］。

M1蛋白的NES富含亮氨酸，在甲型流感病毒中很保守，但在乙型或丙型流感病毒的M1蛋白中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的NES［8］，提示乙型和丙型流感病毒的M1蛋白可能含有不同的NES，或與其他的蛋白相互作用被運(yùn)出細(xì)胞核。NS2蛋白又被稱作核外運(yùn)蛋白（nuclear export protein，NEP），其N 末端含有NES（11DILLRMSKMQLES23）［7］。在 細(xì) 胞 核 內(nèi)，當(dāng)M1蛋白的C末端與vRNPs結(jié)合后，M1蛋白的N 末端能與NS2蛋白的C 末端相結(jié)合。NS2蛋白N 末端的NES 可以和染色體區(qū)維持蛋白1（chromosome region maintenance protein 1，CRM1）結(jié)合，而CRM1通過(guò)與RanGTP 蛋白結(jié)合，就可以將vRNPs－M1－NS2－CRM1－RanGTP 復(fù) 合 體 運(yùn) 送 至 細(xì)胞漿［7，16］。目前還不清楚有多少M(fèi)1－NS2聚合體能與vRNPs結(jié)合。另外，M1－NS2只能與含流感病毒負(fù)鏈RNA 的vRNPs結(jié)合，而不能與含病毒正鏈RNA 的vRNPs結(jié)合，但M1－NS2聚合體是如何區(qū)分病毒的負(fù)鏈和正鏈RNA 的機(jī)制目前還不清楚。

2 M2離子通道蛋白

2.1 mRNA2轉(zhuǎn)錄體編碼M2蛋白

M2蛋白是Lamb等于1981年首次發(fā)現(xiàn)的，由mRNA2轉(zhuǎn)錄體所編碼，而此轉(zhuǎn)錄體是由編碼M1蛋白的mRNA1 經(jīng)過(guò)選擇性剪接而產(chǎn)生的。mRNA1含有3個(gè)剪接供位（splice donor site，SD），分別是SD1、SD2和SD3［5］。若將含有mRNA1 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則能檢測(cè)到mRNA3的表達(dá)，但很難測(cè)到mRNA2轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)；只有當(dāng)流感病毒感染細(xì)胞的時(shí)候，才能檢測(cè)到mRNA2的表達(dá)，這是由于流感病毒的聚合酶復(fù)合體可以封閉SD1，同時(shí)激活SD2，并啟動(dòng)mRNA2的表達(dá)［17］。

2.2 M2蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其功能區(qū)

mRNA1與mRNA2 的5′末端所含的51 個(gè)核苷酸是相同的，但它們的3′末端序列則不同。M2是由97個(gè)氨基酸殘基組成的膜蛋白，分子質(zhì)量約為15ku，而28ku 的M1 蛋白則位于病毒囊膜之下［1，4］。M2與M1蛋白N 末端的9個(gè)氨基酸相同（MSLLTEVET），但C 末端的氨基酸序列卻不同［18］。M2蛋 白 可 分 為3 個(gè) 功 能 區(qū)［18］：①N 末 端區(qū)，含24個(gè)氨基酸，暴露于病毒囊膜表面；②跨膜區(qū)，由19個(gè)氨基酸組成；③胞漿區(qū)，由54個(gè)氨基酸組成。M2蛋白除了與病毒脫殼有關(guān)，還參與病毒子粒的裝配并影響病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)［5］。

2.3 M2蛋白具有質(zhì)子通道的功能

M2蛋白是除HA 及NA 蛋白之外的又一個(gè)病毒表面蛋白，但它并不是流感病毒復(fù)制所必需的［5］。雖然M2在病毒顆粒表面的數(shù)量有限，但很容易在流感病毒感染的細(xì)胞表面檢測(cè)到M2蛋白［19］。M2蛋白可形成由同源四聚體組成的陽(yáng)離子通道，此通道受pH 調(diào)節(jié)，能夠在酸性條件下被激活［20－22］，導(dǎo)致病毒顆粒內(nèi)部的pH 下降，促使M1蛋白構(gòu)像發(fā)生改變并與vRNPs分離，病毒脫殼后vRNPs被釋放到細(xì)胞漿中［7，23］。

2.4 M2蛋白外膜的氨基酸序列在甲型流感病毒中高度保守

M2蛋白與HA 蛋白的成熟有關(guān)，并能與M1蛋白相互作用參與新的病毒顆粒的裝配［4］。金剛烷胺（amantadine）是M2 蛋白的抑制劑，Davies等最先報(bào)道了金剛烷胺具有抗流感病毒的作用，隨后Hay A J等［24］證明金剛烷胺的作用靶位是M2蛋白。由于流感病毒容易突變，常產(chǎn)生對(duì)金剛烷胺的耐藥性，所以一般不首選金剛烷胺類藥物治療流感病人［25］。M2蛋白的N 末端含有24個(gè)氨基酸，暴露在病毒囊膜表面或存在于被流感病毒感染的細(xì)胞表面，這24個(gè)氨基酸被稱作M2e。M2e的氨基酸序列相對(duì)不易突變，在甲型流感病毒株中高度保守，尤其是其N末端的8個(gè)氨基酸（aa2～aa9：SLLTEVET）在幾乎所有亞型的甲型流感病毒中都是不變的，因此它也是研制流感通用疫苗的主要候選免疫原之一［26］。

3 M42蛋白

3.1 mRNA4轉(zhuǎn)錄體編碼M42蛋白

流感病毒M 基因經(jīng)細(xì)胞的mRNA 選擇性剪接后可以產(chǎn)生mRNA4轉(zhuǎn)錄體，它可以編碼一個(gè)與M2相關(guān)的蛋白，即M42 蛋白［5］。通過(guò)M 基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄體mRNA2、mRNA3及mRNA4含有相同的3′端剪接受位（splice acceptor site，SA），但它們5′端的剪接供位卻不盡相同［4－5］。M1與M2蛋白所使用的是同一個(gè)翻譯起始密碼子 AUG1（nt26 ～nt28）［5］，但此起始密碼子AUG1 附近的核苷酸與Kozak序列略有不同，即AUG1并非處于蛋白翻譯所需的最佳序列環(huán)境。距離AUG1起始密碼子－3位上的核苷酸雖是A，但＋4 位上的核苷酸卻不是G。根據(jù)蛋白質(zhì)合成的漏過(guò)掃描翻譯模式，位于AUG1下游的AUG 也有可能作為翻譯起始密碼子啟動(dòng)蛋白的合成，而M42蛋白正是使用了位于114位的AUG2（nt114～nt116）作為其蛋白翻譯的起始密碼子［5］。

3.2 M42蛋白與M2蛋白的結(jié)構(gòu)相似

M2蛋白可以編碼97個(gè)氨基酸，而M42蛋白可以編碼99個(gè)氨基酸。由于M2和M42蛋白合成使用了不同的起始密碼子和不一樣的翻譯閱讀框架，所以這兩種蛋白的氨基酸序列有所不同。M2蛋白的外膜部分含有24個(gè)氨基酸，而M42蛋白的外膜部分則含有26個(gè)氨基酸。這兩個(gè)蛋白的外膜部分有15個(gè)氨基酸是相同的，而外膜的其余部分則不一樣，因此M42與M2蛋白的外膜部分的抗原性有所不同［5］。但從M2蛋白N 末端的第10個(gè)氨基酸（也就是從M42蛋白N 末端的第12 個(gè)氨基酸）開(kāi)始，M42蛋白與M2蛋白的序列是相同的，這可能就是為什么M42蛋白能夠替代M2蛋白，并具有M2蛋白的功能的主要原因［5］。

3.3 M42 蛋白參與流感病毒的復(fù)制并具有類似M2蛋白的功能

Wise H M 等［5］發(fā) 現(xiàn)，mRNA2 的 表 達(dá) 水 平 與mRNA4的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)mRNA2 表達(dá)量變低時(shí)，mRNA4的表達(dá)量會(huì)增高，而且mRNA4編碼的M42蛋白可在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中替代M2 蛋白的功能。mRNA4最初是在甲型流感病毒A／WSN／33（WSN）株中被發(fā)現(xiàn)，但卻未能在A／Udorn／72（Udorn）／（H3N2）株中檢測(cè)到［27］，說(shuō)明mRNA4的表達(dá)可能受到某些細(xì)胞因子的調(diào)控。M42蛋白不是流感病毒復(fù)制所必需的，因?yàn)镸42蛋白僅在一些流感病毒株中表達(dá)［5］。由于mRNA4 是通過(guò)mRNA選擇性剪接所產(chǎn)生的，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的mRNA選擇性剪接具有種屬和細(xì)胞特異性，因此mRNA4的表達(dá)可能僅限于被流感病毒感染的某些特定種屬的動(dòng)物或細(xì)胞類型。

M42蛋白與M2 蛋白具有相同的跨膜區(qū)，可M42蛋白是否具有依賴于pH 的陽(yáng)離子通道作用目前還不太清楚。Wise H M 等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的流感病毒株P(guān)R8 MUd能表達(dá)M42 蛋白，而不表達(dá)M2蛋白，但此毒株對(duì)藥物金剛烷胺敏感，提示M42蛋白可能也具有介導(dǎo)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。M42被認(rèn)為是流感病毒的輔助蛋白，但它可以提高流感病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的繁殖效率。M42蛋白在病毒囊膜外的抗原性與M2蛋白不同，但它在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均可表現(xiàn)出與M2蛋白類似的功能。M42蛋白和M2蛋白在感染細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的，M2蛋白鑲嵌在被感染細(xì)胞膜中，而M42蛋白則主要是位于高爾基氏體內(nèi)［5］。

4 小結(jié)與展望

目前研究人員已發(fā)現(xiàn)，流感病毒的PB2、HA、NP和NA 4個(gè)基因分別只能編碼一種病毒蛋白，而其余的4個(gè)基因（PB1、PA、M 和NS）則分別可編碼2種或2種以上的病毒蛋白，說(shuō)明流感病毒的一個(gè)基因并非總是編碼一個(gè)蛋白。通過(guò)利用細(xì)胞的mRNA 剪接機(jī)制，流感病毒M 基因至少可以產(chǎn)生3種不同形式的病毒mRNA，其中mRNA4編碼的M42蛋白是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的又一個(gè)流感病毒蛋白，很有可能流感病毒基因組編碼的某些蛋白至今仍未被發(fā)現(xiàn)。

由于細(xì)胞內(nèi)mRNA 剪接形式及蛋白翻譯機(jī)制的不同，僅僅依賴病毒基因組或mRNA 的信息仍不足以全面地了解流感病毒基因組所能編碼的全部蛋白。今后有望通過(guò)病毒的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)方法，發(fā)現(xiàn)更多的流感病毒相關(guān)基因節(jié)段所編碼的新蛋白成員，這對(duì)深入了解和揭示流感病毒的蛋白組成、功能、病毒蛋白與細(xì)胞之間的相互作用，對(duì)病毒的診斷、抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)將具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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