瘤胃微生物多樣性與定量

馬 濤 刁其玉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京100081)

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瘤胃微生物多樣性與定量

馬 濤 刁其玉*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京100081)

反芻動物由于瘤胃微生物的存在能夠分解并利用飼料中的纖維素來提供能量和蛋白質(zhì)。瘤胃微生物主要包括細菌、真菌和原蟲，三者在消化飼料過程中分工明確，共同實現(xiàn)碳水化合物和蛋白質(zhì)的分解。本文綜述了定量瘤胃微生物群落多樣性的新方法，尤其是分子生物學(xué)的應(yīng)用，進一步提高人們對于瘤胃功能的認識水平。

瘤胃微生物；細菌；古細菌；厭氧真菌；原蟲

瘤胃具有復(fù)雜的微生物區(qū)系，主要包括細菌、原蟲和真菌這3大類，由于微生物的功能使得反芻動物能夠利用飼料中的營養(yǎng)成分生成揮發(fā)性脂肪酸以及微生物蛋白質(zhì)[1]，因此瘤胃微生物的研究是反芻動物營養(yǎng)領(lǐng)域一個永恒的課題，直到20世紀80年代16S rRNA基因序列分析技術(shù)出現(xiàn)之前，研究人員廣泛應(yīng)用培養(yǎng)基的方法對微生物進行研究，涉及到分離、計數(shù)以及功能鑒定等技術(shù)步驟，應(yīng)用該方法目前已經(jīng)完成了200多種細菌和100多種原蟲及真菌的鑒定。事實上，雖然培養(yǎng)基技術(shù)能夠有效地分離有代表性的瘤胃微生物，但其并不能反映瘤胃微生物的整體多樣性，因為能被培養(yǎng)的瘤胃微生物數(shù)量僅占總微生物數(shù)量的不到20%[2]。過去的10年間，高通量測序技術(shù)的發(fā)展為研究瘤胃微生物多樣性提供了極大的便利。利用實時定量PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)一些不可培養(yǎng)的細菌數(shù)量甚至與大多數(shù)能夠培養(yǎng)的細菌數(shù)目一樣豐富，由此可能證明前者同樣在瘤胃發(fā)酵中起著重要作用[3]。此外，微生物多樣性不僅僅受到飼糧組成的影響[4]，同時也受到宿主遺傳背景[5]和環(huán)境因素[6]的影響。

1 瘤胃細菌

1.1 瘤胃細菌多樣性定量研究

每克瘤胃內(nèi)容物中的瘤胃細菌數(shù)量通常能夠達到1010～1011個[7]，Kim等[3]利用16S rRNA基因測序技術(shù)系統(tǒng)研究了反芻家畜瘤胃中占主導(dǎo)地位的13 478種細菌和3 516種古細菌的序列，發(fā)現(xiàn)瘤胃中存在著7 000種細菌和1 500種古細菌，這7 000種細菌歸屬于19個門，其中硬壁菌門(Firmicutes,57.8%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,26.7%)和變形菌門(Proteobacteria,6.9%)在數(shù)量上占據(jù)主導(dǎo)地位。硬壁菌門中，梭菌綱(Clostridia)占90%以上，另外包括桿菌(Bacilli)、產(chǎn)芽胞菌(Erypsipelotrichi)和其他未分類的細菌。梭菌綱中，毛螺科菌(Lachnospiraceae,23.8%)、瘤胃菌(Ruminococcaceae,25.8%)和韋榮球菌(Veillonellaceae,7.7%)是最大的科，包含丁酸弧菌(Butyrivibrio,4.8%)、醋酸弧菌(Acetivibrio,4.5%)、瘤胃球菌(Ruminococcus,4.1%)、琥珀酸菌(Succiniclasticum,3.7%)、假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio,2.3%)和Mogibacterium(2.3%)等主要的屬；擬桿菌門中，絕大多數(shù)細菌屬于擬桿菌綱(Bacteroidia,88.5%)，此外還有鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,1.0%)和未分類的擬桿菌(10.5%)。擬桿菌綱包含15個屬，其中普氏菌(Prevotella)為主要的屬(41.5%)，鞘脂桿菌綱則只包含2個屬。Bekele等[8]同樣通過16S rRNA基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)綿羊瘤胃中大部分普氏菌(87.8%)的序列與已知普氏菌序列的相似度低于97%，表明不可培養(yǎng)的普氏菌數(shù)量遠超過已知的普氏菌，其特定的生理功能也有待于探索。變形菌門共包括5個綱，其中α變形菌綱(Alphaproteobacteria)中數(shù)量最多的為苯基桿菌屬(Phenylobacterium,32.8%)；β變形菌綱(Betaproteobacteria)中數(shù)量最多的為水桿菌屬(Aquabacterium,32.4%)；γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)中數(shù)量最多的為嗜冷桿菌(Psychrobacter,>58%)，然而嗜冷桿菌是嚴格的好氧嗜冷菌[9]，考慮到瘤胃內(nèi)的無氧環(huán)境以及溫度(38.5～40.5 ℃)，嗜冷桿菌的存在還需要進一步證實；δ變形菌綱中數(shù)量最多的則為脫硫弧菌(Desulfovibrio)。

定量瘤胃微生物的方法包括熒光原位雜交(fluorenceinsituhybridization,FISH)、印跡雜交和16S/18S rRNA/rDNA(rrs)技術(shù)。纖維分解菌是反芻動物瘤胃中一類重要的細菌，隨著定量技術(shù)的發(fā)展，人們對于其認識逐步深入。通過印跡雜交方法得出的瘤胃主要纖維分解菌產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球(菌)只占總瘤胃細菌群落的10%以下[10]；應(yīng)用FISH技術(shù)進一步得出該3種菌占瘤胃總纖維分解菌的50%左右[11]；隨后通過實時定量PCR定量分析得到產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是最主要的纖維分解菌[12]。rrs技術(shù)是近年來最常用的微生物定量手段，Jami等[13]以16頭采食同一飼糧的奶牛為研究對象定量其瘤胃微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)雖然區(qū)系在個體間存在顯著差異，但幾乎所有奶牛的瘤胃中均存在共同的32個細菌屬，由此可見反芻動物瘤胃中存在著共享的核心菌群。Jami等[14]進一步對上述核心菌群進行分析并定量了13種關(guān)鍵功能菌的豐度，發(fā)現(xiàn)不同個體間核心菌群的豐度差異變化也極為顯著，例如反芻真桿菌(Eubacteriumruminantium)的豐度在不同個體間相當穩(wěn)定，而埃氏巨球菌(Megasphaeraelsdenii)的豐度在不同個體間差異幅度可達3倍；Pitta等[15]利用基于16S rRNA的擴增子測序技術(shù)，得出當肉牛由飼喂低蛋白質(zhì)高纖維的狗牙根(Bermudagrass)向高蛋白質(zhì)高可溶性營養(yǎng)物的冬小麥(Triticumaestivum)轉(zhuǎn)換時，普氏菌的比例由28%上升到56%，是瘤胃中比例最高的菌屬。對于瘤胃細菌群落變化的研究，可利用的手段包括限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析等。Jarvis等[16]利用RFLP研究了牛鏈球菌多樣性受飼糧精粗比例變化的影響情況；Kocherginskaya等[17]利用DGGE和TGGE手段研究表明高谷物飼糧飼喂的牛瘤胃細菌群落豐富度要顯著高于高粗料飼糧飼喂的肉牛。將不同分子生物學(xué)手段結(jié)合，有利于更好地反映瘤胃細菌受飼糧影響的變化情況。

1.2 瘤胃古細菌多樣性定量研究

反芻動物瘤胃中存在的古細菌基本為產(chǎn)甲烷菌[18]，每克瘤胃內(nèi)容物中的古細菌基因拷貝數(shù)量在108～1010之間[19]，絕大部分(99.6%)屬于廣古菌門(Euryarchaeota)，其中90%以上的序列與甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter,50%)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium,15%)和甲烷球形菌屬(Methanosphaera,13%)等產(chǎn)甲烷菌屬相關(guān)[3]。上述產(chǎn)甲烷菌的主導(dǎo)地位使其在利用氫氣(H2)和二氧化碳(CO2)等發(fā)酵產(chǎn)物時更具有競爭力，從而能夠迅速生長，與此對應(yīng)，反芻動物甲烷排放的降低也直接與產(chǎn)甲烷菌生長受抑制相關(guān)。雖然首次分離產(chǎn)甲烷菌至今已有50多年[20]，但相當長的一段時間以來對于其了解程度遠不如瘤胃細菌，而隨著微生物分析技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸開始探究產(chǎn)甲烷菌和其他瘤胃微生物之間，以及不同種屬產(chǎn)甲烷菌的相互影響作用。Yanagita等[21]利用FISH技術(shù)得出游動甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)占綿羊瘤胃總甲烷菌的54%左右；Soliva等[22]同樣通過FISH技術(shù)闡明了月桂酸和肉豆蔻酸共同作用抑制甲烷菌生長的機理；Ohene-Adjei等[23]通過分析古細菌16S rRNA基因克隆文庫，首次證明了瘤胃原蟲對古細菌的種類存在直接影響；Mosoni等[19]利用DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)盡量去原蟲能夠顯著降低甲烷排放量，但主要產(chǎn)甲烷菌的豐度和多樣性均不受去原蟲的影響；Leahy等[24]對甲烷短桿菌進行了全基因組測序，這也是首個得到完整序列的瘤胃古細菌，上述研究者發(fā)現(xiàn)其含有大量編碼表面黏附蛋白的基因，而這些蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可能有助于研究者更有針對性地開發(fā)相應(yīng)疫苗，從而抑制甲烷菌的產(chǎn)生以及甲烷的排放。自2006年以來，大氣甲烷的產(chǎn)生量以每年0.4%的速率增加[25]，甲烷減排日益成為研究熱點，應(yīng)用生物技術(shù)能夠針對反芻動物主要的甲烷來源--古細菌進行直接分析，有助于人們更好地闡明瘤胃甲烷產(chǎn)生或抑制的相關(guān)機理。

2 瘤胃原蟲

長期以來顯微技術(shù)是對原蟲進行鑒定和計數(shù)的理想方法，由此得到每克瘤胃內(nèi)容物中原蟲數(shù)量為105～106個，其中95%以上的為內(nèi)毛蟲(Entodinium)[26]。近年來，分子技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于原蟲種屬間差異的研究。Sylvester等[27]利用DNA指紋技術(shù)就飼糧對奶牛瘤胃和十二指腸原蟲多樣性展開研究，發(fā)現(xiàn)了尖尾內(nèi)毛蟲(Epidiniumcaudatum)、有尾內(nèi)毛蟲(Entodiniumcaudatum)和原口等毛蟲(Isotrichaprostoma)為主要的種類；Skillman等[28]采集了100只綿羊的瘤胃液樣品，通過18S rRNA基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同時間點同一個體的原蟲數(shù)量相對穩(wěn)定，但在不同個體間每克瘤胃內(nèi)容物中內(nèi)毛蟲的數(shù)量波動范圍在1～106之間，因此如果想獲得統(tǒng)計學(xué)上的差異顯著性，每個試驗處理須至少采集52個樣品；Tymensen等[29]利用末端限制性片段長度多樣性(T-RFLP)分析比較了飼喂干草的肉牛和飼喂青貯/谷物飼料的肉牛瘤胃原蟲區(qū)系，發(fā)現(xiàn)飼喂青貯/谷物飼料的肉牛瘤胃中內(nèi)毛屬原蟲(Entodiniumspp.)的豐度以及原蟲多樣性(香儂指數(shù))較飼喂干草的肉牛更高，此外同圈飼養(yǎng)的肉牛在瘤胃原蟲區(qū)系上更傾向于一致，該研究也是首次在瘤胃原蟲上應(yīng)用T-RFLP技術(shù)與傳統(tǒng)的顯微技術(shù)進行對比，從結(jié)果來看T-RFLP技術(shù)能夠很好地對顯微結(jié)果進行補充說明。

3 瘤胃真菌

瘤胃真菌只占到瘤胃總微生物量的10%左右，且受飼糧和個體顯著影響[2]。由于真菌18S rRNA序列具有高度保守性，因此無法利用該序列對其進行鑒定或比較[30]，而真菌rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(internal transcribed spacer sequence,ITS)具有高度可變性，為區(qū)分不同的真菌類型提供了依據(jù)[31]。隨后該技術(shù)不斷得到改進，Denman等[32]通過自動分析的方法能夠區(qū)分3個不同屬[根囊鞭菌屬(Orpinomyces)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)和新麗鞭毛菌(Neocallimastix)]的真菌品種；Griffith等[33]和Liggenstoffer等[34]通過分離包括反芻動物和單胃動物在內(nèi)的數(shù)種食草動物瘤胃及糞便中的厭氧真菌，并將其歸為新的門類——新美鞭菌門(Neocallimastigomycota)。在Liggenstoffer等[34]的研究中共獲得了267 286條能夠代表全部已知真菌屬的序列，其中梨囊鞭菌屬數(shù)量最多，占總序列的36%；枝梗鞭菌屬(Cyllamyces)和根囊鞭菌屬則最少，分別只占總序列的0.7%和1.1%，此外有多達38.3%的序列并不屬于已鑒定的6個屬，而是形成了8個在發(fā)育上差異顯著的新型譜系。Youssef等[35]利用高通量測序和單分子實時測序技術(shù)，闡明了根囊鞭菌屬中C1A菌株降解木質(zhì)纖維素的相關(guān)機制，但目前為止關(guān)于瘤胃真菌的研究報道仍然不多。

4 瘤胃噬菌體

瘤胃中的噬菌體含量豐度，每毫升瘤胃內(nèi)容物中噬菌體數(shù)量為107～109個[36]，然而人們對其多樣性及功能作用仍知之甚少。Berg等[37]首次對牛瘤胃病毒組進行了全基因組分析，鑒定出28 000種不同的病毒基因型，然而其中高達78%的基因型與以知基因型并不匹配；前噬菌體的數(shù)量約為溶解性噬菌體的2倍，而絕大多數(shù)噬菌體和前噬菌體與瘤胃中占主導(dǎo)地位的門類(硬壁菌、擬桿菌和變形菌)密切相關(guān)。

5 瘤胃微生物區(qū)系的建立

在過去的20年時間里，法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究人員通過對無菌條件下出生的羔羊在不同條件下瘤胃微生物生長情況開展了一系列研究[38-40]。近年來Jami等[41]應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對1日齡～2歲的反芻動物瘤胃細菌組成開展了研究，表明瘤胃微生物區(qū)系在出生后迅速建立，一致出現(xiàn)好氧和兼性厭氧微生物數(shù)量的下降，以及厭氧微生物數(shù)量的上升；一些瘤胃細菌在動物出生第1天就具備功能，且在采食固體飼料前其功能已相當完備。出生后的反芻動物瘤胃微生物區(qū)系可通過接觸母體的產(chǎn)道、乳頭、皮膚和唾液等建立，這種微生物區(qū)系的建立有利于瘤胃上皮的正常發(fā)育，從而能夠保證正常的瘤胃發(fā)酵和消化功能，維持動物健康生長。

6 小 結(jié)

瘤胃微生物群落是反芻動物獨有的生物平衡體系，是反芻動物的生命和生產(chǎn)基礎(chǔ)，是一個需要無止境探索和研究的發(fā)酵實體，而基于核酸的分離鑒定技術(shù)逐漸成為研究瘤胃微生物種類及其在瘤胃中扮演角色的重要手段。2011年，瘤胃微生物組織(新西蘭)開啟了“Hungate 1000”項目，旨在建立1 000種可培養(yǎng)的瘤胃細菌、古細菌、厭氧真菌和纖毛蟲的全基因組序列，能夠代表瘤胃中最主要的微生物多樣性。該項目的啟動與實施具有重要意義，例如通過發(fā)現(xiàn)編碼降解纖維活性的新基因用于提高動物生產(chǎn)性能、飼料原料解聚、生產(chǎn)生物燃料，或通過對古細菌全基因組序列的測定更有效地降低甲烷排放。隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展，瘤胃微生物的奧妙正在逐步被發(fā)現(xiàn)，其活動原理也在逐層被揭示，瘤胃微生物發(fā)生發(fā)展是微觀也是宏觀的，正期待人們用更進一步的手段去發(fā)現(xiàn)和解密。

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*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

(責任編輯 王智航)

Rumial Microbes: Diversity and Quantification

MA Tao DIAO Qiyu*

(FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyoftheMinistryofAgriculture,Beijing100081,China)

Ruminants are able to utilize fibrous feed as a source of energy and nutrients due to the ruminal microbes, composed mainly of bacteria, fungi, and ciliate protozoa. Ruminal microbes play different roles in feed digestion and act synergistically to ferment dietary carbohydrates and proteins. This review reported the latest methods for assessment of ruminal microbial diversity, particularly molecular techniques, which allows people to gain new insights into rumen functions. [ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3649-3654]

ruminal microbes; bacteria; archaea; anaerobic fungi; protozoa

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.001

2015-07-02

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“南方地區(qū)幼齡草食畜禽飼養(yǎng)技術(shù)研究”(201303143)；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-39)

馬 濤(1986—)，男，山東青島人，博士，從事反芻動物生理營養(yǎng)研究。E-mail： matao@caas.cn

*通信作者：刁其玉，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： diaoqiyu@caas.cn

S823;S826

A

1006-267X(2015)12-3649-06