山羊卵巢維持基因FOXL2啟動(dòng)子活性及調(diào)控區(qū)域分析

耿立英，張 宇，李祥龍*，周榮艷，李蘭會(huì)，王志剛

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000)

山羊卵巢維持基因FOXL2啟動(dòng)子活性及調(diào)控區(qū)域分析

耿立英1，2，張 宇1，2，李祥龍1，2*，周榮艷2，李蘭會(huì)2，王志剛2

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 066600； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000)

旨在研究山羊卵巢維持基因FOXL2啟動(dòng)子活性以及探究該基因的調(diào)控機(jī)理。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取FOXL2基因啟動(dòng)子序列，用生物信息學(xué)軟件對(duì)其核心啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。使用 PCR技術(shù)克隆FOXL2基因啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建一系列缺失載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T和A375細(xì)胞，利用雙熒光素酶基因檢測(cè)儀測(cè)定相對(duì)熒光素酶活性值。結(jié)果表明，該基因啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)典型的CpG島，分別位于(-920/+51(972 bp))和(+125/+555(430 bp))區(qū)域；經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定表明，重組載體質(zhì)粒構(gòu)建正確；在細(xì)胞中插入不同長(zhǎng)度的FOXL2基因啟動(dòng)子片段，隨著啟動(dòng)子5′端截短，熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性先升高再逐漸降低。(-934/+324)區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄活性，(-32/+324)區(qū)段包含了轉(zhuǎn)錄的基本元件；(-934/-456)區(qū)域在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中對(duì)FOXL2基因起負(fù)調(diào)控作用，(-456/-192)區(qū)域?yàn)檎{(diào)控區(qū)域。

山羊；FOXL2基因；啟動(dòng)子；活性

FOXL2(Forkhead box L2)屬于FOX叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族，在體細(xì)胞中廣泛表達(dá)。該基因在人類、鼠和山羊等物種中高度保守，人同源序列缺失則導(dǎo)致眼裂狹小綜合癥(BPES)[1]，突變后FOXL2生物學(xué)結(jié)構(gòu)與功能的改變，可能是小瞼裂綜合征的致病原因[2]。FOXL2被認(rèn)為在性別分化中起到重要作用[3-5]，是雌性的性別決定基因[6-7]，對(duì)卵巢發(fā)育調(diào)控起關(guān)鍵作用[8-11]，在小鼠和山羊的早期卵巢分化中，均發(fā)現(xiàn)了FOXL2基因的表達(dá)[12]，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致性別反轉(zhuǎn)[13-14]。FOXL2基因從正常山羊胚胎發(fā)育的初期開(kāi)始表達(dá)，并且36 dpc表達(dá)呈上升趨勢(shì)，成年后表達(dá)消失[15]。山羊FOXL2基因受無(wú)角間性綜合癥(Polled intersex syndrome，PIS)區(qū)域調(diào)控表達(dá)，并與山羊間性形成具有緊密聯(lián)系[16]。山羊FOXL2基因上游長(zhǎng)度為1 055 bp的啟動(dòng)子區(qū)域曾被作為PIS區(qū)域調(diào)控重要元件被首度克隆，并插入到熒光素酶Luc報(bào)告基因載體，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)驗(yàn)證了該啟動(dòng)子活性[17]。據(jù)報(bào)道FOXL2基因啟動(dòng)子為典型的GC-rich啟動(dòng)子，并且包含Sp1結(jié)合位點(diǎn)[17]。通常來(lái)說(shuō)，這種類型的啟動(dòng)子應(yīng)該含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，且轉(zhuǎn)錄起始元件分布在100 bp范圍內(nèi)[18]。除受啟動(dòng)子元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，山羊基因接受位于1q23無(wú)角綜合癥(PIS)區(qū)域的調(diào)控。到目前為止，雖然已驗(yàn)證了山羊FOXL2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，但對(duì)于山羊FOXL2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的正負(fù)調(diào)控區(qū)域尚不明確。

本試驗(yàn)克隆了山羊FOXL2基因啟動(dòng)子序列，并通過(guò)生物信息學(xué)分析構(gòu)建了啟動(dòng)子系列缺失報(bào)告基因載體，分析并探討該基因的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，為進(jìn)一步研究FOXL2基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

健康、體況良好的唐山奶山羊血液樣品(正常64個(gè)，間性34個(gè))；DH5α菌種和綠色熒光蛋白質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室保存；pMD?19-T載體為寶生物工程有限公司產(chǎn)品；pGL3-Basic、pGL3-Control和PRL-TK載體均由北京原平皓生物技術(shù)有限公司贈(zèng)送。TransStartTaqDNA Polymerase、dNTPs和T4 DNA連接酶為全式金(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ購(gòu)自Thermo公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；雙熒光素酶Luc報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒為北京原平皓生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；1640固體培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和小牛血清購(gòu)自GIBCO公司。

1.2 啟動(dòng)子序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取山羊FOXL2基因啟動(dòng)子序列(AY112725.2)，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該區(qū)域序列并送至測(cè)序公司測(cè)序。利用在線Methprimer程序?qū)ι窖騀OXL2基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè)(http：//www.urogene.org/methprimer/)；使用在線程序Neural Network Promoter Prediction(NNPP)(http：//promotor.biosino.org/)和Promoter Scan(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)進(jìn)行核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)及轉(zhuǎn)錄因子分析[19]。

1.3 引物設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，以FOXL2基因-1 000～+350區(qū)域(AY112725.2)為模板，對(duì)其5′端進(jìn)行不同長(zhǎng)度的缺失，并命名為P1(-934/+324)、P2(-456/+324)、P3(-192/+324)、P4(-104/+324)和P5(-32/+324)(圖1)，引物序列設(shè)計(jì)了KpnⅠ和Hind Ⅲ兩種酶切位點(diǎn)(表1)。PCR擴(kuò)增5個(gè)啟動(dòng)子缺失片段并切膠純化回收，連接到pMD?19-T載體，利用引物兩端酶切位點(diǎn)，再將目的片段從克隆載體上切割下來(lái)，并連接到表達(dá)載體pGL3-Basic上。酶切鑒定篩選的陽(yáng)性克隆送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.4 山羊FOXL2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè)

293T和A375細(xì)胞均使用添加10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d以1.5×105個(gè)·孔-1的密度接種于24孔培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，用于轉(zhuǎn)染。293T和A375細(xì)胞脂質(zhì)體與質(zhì)粒總量比分別為1∶0.5和1∶0.25。設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照組為pGL3-promoter質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組為pGL3-Basic質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，試驗(yàn)組為pGL3-Basic/Px質(zhì)粒與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶檢測(cè)熒光值步驟參照熒光素酶檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將所測(cè)得螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白表達(dá)量檢測(cè)值F除以內(nèi)參海參熒光素酶蛋白表達(dá)量檢測(cè)值R，所得即為螢火蟲(chóng)熒光素表達(dá)量的相對(duì)值F/R，再除以陰性對(duì)照pGL3-Basic的相對(duì)熒光素酶檢測(cè)的背景值，以消除不同轉(zhuǎn)染批次的系統(tǒng)誤差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖1 山羊FOXL2基因啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度片段擴(kuò)增示意圖Fig.1 Amplifying schematic diagram of different length fragments in goat FOXL2 promoter region

表1 山羊FOXL2 基因啟動(dòng)子擴(kuò)增引物

Table 1 Primers for promoter amplification of goatFOXL2 gene

引物Primer序列(5′?3′)Sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductssizeFOXL2?S1(KpnⅠ)GGGGTACCTATCATAGGTCCAGGAGCAGCG1039FOXL2?S2(KpnⅠ)GGGTACCCAAAGGGCAGAGCAAAGGAG780FOXL2?S3(KpnⅠ)GGGTACCCTTGGAGATGAACTCTCCCGTG514FOXL2?S4(KpnⅠ)GGGTACCGAATCAGAACAGAGCGAGGCTC425FOXL2?S5FOXL2?A5(KpnⅠ)GGGTACCGTCTCGGGAAACCGAAGGGT(HindⅢ)CCCAAGCTTAGCTGGCCATCATGACAAAGC353

2 結(jié) 果

2.1FOXL2基因啟動(dòng)子全長(zhǎng)片段的獲得

以正常唐山奶山羊基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序后，克隆得到的目的片段與NCBI提交的山羊FOXL2基因序列(AY112725.2)相似性為99%(圖2)，說(shuō)明擴(kuò)增片段來(lái)源正確，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2FOXL2基因啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到的FOXL2-SA序列2 149 bp(-1 537/+612)提交到Methprimer程序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(圖3)。該區(qū)段存在兩個(gè)典型的大小分別為972和430 bp的CpG島，分別位于616～1 588 bp(-920、+51)區(qū)段和1 662～2 092 bp(+125、+555)區(qū)段。因此可以確定，F(xiàn)OXL2基因啟動(dòng)區(qū)域通過(guò)CpG島招募重要轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄作用，而高甲基化狀態(tài)的CpG島反過(guò)來(lái)影響其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的招募，從而降低下游基因轉(zhuǎn)錄活性，即影響基因表達(dá)。

NNPP啟動(dòng)子程序的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示了3個(gè)閾值超過(guò)0.85的候選核心啟動(dòng)子區(qū)段，分別為-978～-929 bp、+257～+307 bp、+294～+444 bp，預(yù)測(cè)得分分別為0.85、0.86和0.86(表2)。

圖2 FOXL2基因在NCBI中的比對(duì)結(jié)果Fig.2 Result of blast in NCBI of FOXL2 gene

圖3 FOXL2基因CpG島預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Result of predicting for CpG island of FOXL2 gene

表2 Neural Network Promoter Prediction啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 2 The promoter prediction result by neural network promoter prediction

起始位置Startingposition終止位置Endposition得分Score啟動(dòng)子序列Promotersequence560(-978)610(-929)0．85TTACCCCATAAATATAAATCTCACATCTTATATCTGTGCATACCTGTTTC1794(+257)1844(+307)0．86CGGCGCCAGCGGAAAAGAGCAGGGACTGCCCGGCCGCGGCGCGCCGGCTT1931(+294)1981(+444)0．86GGCGCCGGCGCCGCCCAGCCCGGGCAAGGGCGGCGGCGGCGGTGCGGGGG

使用Promoter Scan程序預(yù)測(cè)FOXL2-SA啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示，+43～+293 bp區(qū)段的啟動(dòng)子分值最高達(dá)到了61.71(預(yù)測(cè)閾值為53.0)，并且在此區(qū)域預(yù)測(cè)出Sp1、EARLY-SEQ1、T-Ag、AP-2、UCE.2、KROX24、EGR-1、UCE.1、MT-I.6和GCF轉(zhuǎn)錄因子，其中Sp1和AP-2出現(xiàn)頻數(shù)最高，分別為7和4次。-276～-526 bp區(qū)段預(yù)測(cè)分值為54.06，也超出了閾值53.0分。此段區(qū)域中包括了GCF、UCE.2、AP-2、Sp1、T-Ag、H4TF1、JCV、EARLY-SEQ1、PuF和SIF轉(zhuǎn)錄因子，其中Sp1出現(xiàn)6次，AP-2出現(xiàn)5次(表3)。這些轉(zhuǎn)錄因子分布集中的區(qū)域，預(yù)示著對(duì)FOXL2基因表達(dá)起著重要調(diào)控作用，+43～+293 bp區(qū)域可能為FOXL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)。

2.3 缺失啟動(dòng)子基因載體的構(gòu)建

依據(jù)上述生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取-934/+324區(qū)間作為最長(zhǎng)克隆片段，其他片段分別為對(duì)其5′端進(jìn)行不同長(zhǎng)度的缺失，構(gòu)建命名如下質(zhì)粒：pGL3-Basic/P1(-934/+324)、pGL3-Basic/P2(-456/+324)、pGL3-Basic/P3(-192/+324)、pGL3-Basic/P4(-104/+324)和pGL3-Basic/P5(-32/+324)。最長(zhǎng)片段pGL3-Basic/P1覆蓋了兩個(gè)CpG島和所有轉(zhuǎn)錄因子富集區(qū)域；pGL3-Basic/P2為第一個(gè)CpG島部分缺失片段，但包含Promoter Scan程序預(yù)測(cè)的兩個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)域；pGL3-Basic/P3(-192/+324)缺失了Promoter Scan程序預(yù)測(cè)的一個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū)域；pGL3-Basic/P4(-104/+324)保留了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前100 bp區(qū)域；pGL3-Basic/P5(-32/+324)缺失了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前所有片段。

將構(gòu)建完成的Luc報(bào)告基因載體使用限制性內(nèi)切酶KpnI和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，如圖4所示，所有正常長(zhǎng)度的目的基因片段均被切割下來(lái)，因此所構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒含有所克隆目的片段。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及活性分析

使用Luc報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T和A375細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后裂解并收獲細(xì)胞，細(xì)胞裂解液用于測(cè)定雙熒光素酶活性并且計(jì)算Luc報(bào)告基因相對(duì)活性值。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)校正后，綜合多次測(cè)定結(jié)果，用SPSS17.0軟件分析缺失啟動(dòng)子片段啟動(dòng)子活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所構(gòu)建的各個(gè)缺失啟動(dòng)子片段的載體與pGL3-Basic空載體相比都具有明顯的啟動(dòng)活性(P<0.01)。

表3 Promoter Scan預(yù)測(cè)啟動(dòng)子結(jié)果

Table 3 Promoter prediction by Promoter Scan

轉(zhuǎn)錄因子Transcriptionfactor正/反義鏈Sense/Antisensestrand位置/bpPosition權(quán)重Weight轉(zhuǎn)錄因子Transcriptionfactor正/反義鏈Sense/Antisensestrand位置/bpPosition權(quán)重WeightSp1+433．013GCF+-2762．284Sp1-483．061UCE．2--3151．278EARLY?SEQ1-505．795AP?2--3341．108Sp1-506．819Sp1--3503．292T?Ag+521．086AP?2--3501．355AP?2+901．355Sp1+-3553．361AP?2+921．108UCE．2+-3611．216Sp1+1182．755GCF+-3642．284Sp1-1232．772T?Ag--4701．086UCE．2+1241．278H4TF1--4921．679UCE．2-1271．216JCV--4941．427AP?2-1381．091AP?2+-4951．091AP?2-1401．672AP?2+-4951．064KROX24+1832．151AP?2+-4971．672Sp1+1873．013Sp1--4986．661EGR?1-1912．294Sp1--49810．681Sp1-1923．061Sp1--4993．013UCE．2+2231．278Sp1+-5043．061UCE．2-2261．216EARLY?SEQ1+-5065．795UCE．1-2361．700UCE．2--5161．278MT?I．6+2408．606PuF--5261．082GCF+2562．361SIF+-5261．161GCF-2622．284

P1～P5.Luc報(bào)告基因載體雙酶切產(chǎn)物；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL5000P1-P5.Luc reporter gene vector double enzyme products；M.DL5000 DNA marker圖4 重組質(zhì)粒酶切檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Result of recombinant plasmid by digestion

由圖5可以看出，F(xiàn)OXL2基因啟動(dòng)子隨5′端截短，熒光素酶轉(zhuǎn)錄活性先升高再逐漸降低，并且在293T和A375細(xì)胞中的變化趨勢(shì)幾乎相同，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果具有可信度。缺失啟動(dòng)子片段在兩種細(xì)胞中表達(dá)的共同特點(diǎn)是：pGL3-Basic/P5區(qū)段的啟動(dòng)子活性均為5個(gè)區(qū)段中活性最低的片段，但是這個(gè)缺失片段在兩種細(xì)胞中與陰性對(duì)照相比仍然具有啟動(dòng)子活性，且統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著(P<0.01)；同時(shí)pGL3-Basic/P2與pGL3-Basic/P1片段相比，啟動(dòng)子活性極顯著升高(P<0.01)，其余缺失片段與pGL3-Basic/P2片段相比，啟動(dòng)子活性極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，pGL3-Basic/P5缺失片段具備轉(zhuǎn)錄的基本元件；pGL3-Basic/P1片段中的(-934/-456)區(qū)域在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能起了負(fù)調(diào)控的作用；pGL3-Basic/P2片段中的(-456/-192)區(qū)域?yàn)樯窖騀OXL2基因正調(diào)控區(qū)域。在A375細(xì)胞中各個(gè)缺失啟動(dòng)子片段熒光素酶的表達(dá)量均相應(yīng)高于293T細(xì)胞，因此與293T細(xì)胞相比，A375細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境更適合于FOXL2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

**.P<0.01圖5 FOXL2啟動(dòng)子缺失片段在293T和A375細(xì)胞中的活性比較Fig.5 Comparative activity of different promoters of FOXL2 in 293T and A375 cells

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò) 5′RACE從 1 個(gè)月的山羊卵巢中成功克隆了FOXL2基因啟動(dòng)子序列，并確定翻譯起始密碼子。對(duì)所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)域存在兩個(gè)典型的大小分別為972和430 bp的CpG島，分別位于(-920/+51)區(qū)段和(+125/+555)區(qū)段。該啟動(dòng)子為典型的GC-rich啟動(dòng)子，并且包含 Sp1 結(jié)合位點(diǎn)，與M.Pannetier等人研究結(jié)果一致[17]。FOXL2基因啟動(dòng)子是通過(guò)CpG島招募重要轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄作用[20]。CpG島通常存在于基因啟動(dòng)子區(qū)域，基因末端常存在一些富含“CG”雙核苷酸區(qū)域。CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，可通過(guò)CpG島甲基化來(lái)參與基因表達(dá)調(diào)控和影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[21]。FOXL2基因CpG島的范圍幾乎包含了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp和下游500 bp，暗示該區(qū)域存在較為廣泛的調(diào)控作用。

使用Promoter Scan程序預(yù)測(cè)FOXL2-SA啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果給出了2個(gè)候選核心啟動(dòng)子區(qū)域，并且(+43/+293)區(qū)段預(yù)測(cè)分值高于(-276/-526)區(qū)段。其中兩個(gè)區(qū)段中Sp1和AP-2轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)頻率最高，預(yù)示著這兩種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)FOXL2基因表達(dá)起著重要調(diào)控作用。+43～+293區(qū)域可能成為FOXL2基因核心啟動(dòng)子區(qū)。

綜合對(duì)核心啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)出3個(gè)候選核心啟動(dòng)子區(qū)域分別是(+40/+300)區(qū)段、(-500/-200)區(qū)段和(-950/-900)區(qū)段。依據(jù)CpG島位置、核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)位置和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)位置設(shè)計(jì)不同的啟動(dòng)子缺失片段，并連接至熒光素酶Luc報(bào)告基因載體，所構(gòu)建的Luc報(bào)告基因載體分別為pGL3-Basic/P1(-934/+324)、pGL3-Basic/P2(-456/+324)、pGL3-Basic/P3(-192/+324)、pGL3-Basic/P4(-104/+324)和pGL3-Basic/P5(-32/+324)，利用綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T和A375細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的缺失啟動(dòng)子片段均具備啟動(dòng)子活性，該結(jié)論與CpG島存在范圍相一致。其中在細(xì)胞中插入FOXL2基因不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段，熒光素酶的轉(zhuǎn)錄活性有顯著差異：隨著5′端的截短，熒光素酶的轉(zhuǎn)錄活性先升高再逐漸降低。pGL3-Basic/P2片段與其他片段相比，啟動(dòng)子活性極顯著升高，說(shuō)明pGL3-Basic/P2片段中的(-456/-192)區(qū)域?yàn)樯窖騀OXL2基因正調(diào)控區(qū)域；pGL3-Basic/P5區(qū)段的啟動(dòng)子活性為5個(gè)區(qū)段中活性最低的片段，說(shuō)明缺失了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前所有片段的pGL3-Basic/P5片段為仍具備轉(zhuǎn)錄活性的基本元件，并且該結(jié)果與Promoter Scan程序的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。(-934/-456)區(qū)域的缺失使啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著上升，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起了負(fù)調(diào)控的作用，(-456/-192)區(qū)域的缺失使啟動(dòng)子活性顯著下降，可知該區(qū)域?yàn)镕OXL2基因正調(diào)控區(qū)域[22]。

本研究克隆了山羊FOXL2基因的啟動(dòng)子片段，并通過(guò)生物信息學(xué)分析構(gòu)建了啟動(dòng)子缺失報(bào)告基因載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T和A375細(xì)胞的體外嘗試分析并探討了該基因的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，為進(jìn)一步研究FOXL2基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。有關(guān)FOXL2基因啟動(dòng)子的活性功能驗(yàn)證還有待于在更多種類細(xì)胞中進(jìn)行試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

山羊FOXL2基因(-934/+324)區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄活性，(-934/-456)區(qū)域缺失使啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性顯著上升，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用，(-456/-192)區(qū)域缺失使啟動(dòng)子活性顯著下降，為FOXL2基因正調(diào)控區(qū)域。

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(編輯 郭云雁)

Activity and Regulation Region Analysis of Promoter of GoatFOXL2 Gene

GENG Li-ying1，2，ZHANG Yu1，2，LI Xiang-long1，2*，ZHOU Rong-yan2，LI Lan-hui2，WANG Zhi-gang2

(1.HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Qinhuangdao066600，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China)

The research was designed to study the activity of goat ovarian maintenance geneFOXL2 promoter and explore the gene’s regulation mechanism.FOXL2 promoter sequence was retrieved from the NCBI database，bioinformatics software was adopted to predict its core promoter and transcription factors.PCR technology was used to cloneFOXL2 gene promoter sequence and construct a series of deletion vectors，293T and A375 cells were transiently transfected，dual luciferase gene detector was used to measure the relative luciferase activity value.The results indicated that there were 2 typical CpG islands in the gene promoter region，which were located at (-920/+51(972 bp)) and (+125/+555(430 bp)) regions；the result ofKpnI andHind Ⅲ dual enzyme digestion test suggested that the recombinant plasmid was constructed correctly；FOXL2 gene promoter fragments with different lengths were inserted into the cells.When the promoter 5′was truncated，luciferase transcriptional activity firstly increased and then decreased.The result indicate that (-934/+324) region has transcriptional activity，(-32/+324) region contain the basic elements of transcription；(-934/-456) region negatively regulatesFOXL2 gene during the transcription process，(-456/-192) region is a positive regulatory region.

goat；FOXL2 gene；promoter；activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.005

2015-01-06

河北省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃(LJRC004)

耿立英(1974-)，女，山東平原人，副教授，博士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：rosegengly@126.com

*通信作者：李祥龍，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：lixianglongcn@yahoo.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2015)12-2153-08