早期胚胎血管顯微注射慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因禽類的研究

張自富，趙 瑜，劉錦妮，李 洵，彭新亮，章 平，胡 靜，賀東陽(yáng)，常姣姣，谷夢(mèng)迪，金楠楠，王亞芳

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系 生物技術(shù)與動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室，信陽(yáng) 464000)

早期胚胎血管顯微注射慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因禽類的研究

張自富*，趙 瑜，劉錦妮，李 洵，彭新亮，章 平，胡 靜，賀東陽(yáng)，常姣姣，谷夢(mèng)迪，金楠楠，王亞芳

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系 生物技術(shù)與動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室，信陽(yáng) 464000)

根據(jù)禽類獨(dú)特的生殖生理特點(diǎn)及特殊的胚胎發(fā)育模式，把原始生殖細(xì)胞法、顯微注射法和慢病毒載體法3種轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以期探索出簡(jiǎn)便、高效的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因禽類新方法。在鵪鶉胚胎發(fā)育至第13～15期，血液循環(huán)中的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)數(shù)目達(dá)到最高值，血管顯微注射攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein，eGFP)的人類免疫缺陷病毒I型(Human immunodeficiency virus-1，HIV-1)慢病毒載體，每枚胚胎注入1 μL，滴度為1×109TU·mL-1。80枚鵪鶉種蛋，孵化出雛48只，孵化率為60%；對(duì)新生鵪鶉解剖后，在熒光顯微鏡下檢測(cè)，其喙部、羽毛、眼部、大腦、血管、心、肝、脾、肺、腎、腺胃、腸系膜、小腸、大腸、輸卵管、肌肉及爪上檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá)，特別是在性腺中觀察到綠色熒光蛋白廣泛性表達(dá)。G0代28只雄性鵪鶉中，成功采集到21只精液，其中5只個(gè)體精子基因組經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.8%(5/21)；在5只陽(yáng)性個(gè)體的G1代46只后代中，有6只經(jīng)PCR及印跡雜交(Southern blot)檢測(cè)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.0%(6/46)。利用胚胎發(fā)育至第13～15期血管顯微注射慢病毒載體能夠有效感染此時(shí)期遷移的PGCs，獲得性系嵌合體個(gè)體，最終成功獲得轉(zhuǎn)基因后代。該方法簡(jiǎn)便、高效的生產(chǎn)出轉(zhuǎn)基因禽類，必將為禽類轉(zhuǎn)基因研究提供一種新的思路和方法。

顯微注射；慢病毒載體；轉(zhuǎn)基因禽類；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白

禽類獨(dú)特的生殖生理特點(diǎn)以及禽類胚胎的體外發(fā)育方式與哺乳動(dòng)物有很大不同，禽類受精卵產(chǎn)出體外時(shí)已發(fā)育到囊胚期，傳統(tǒng)的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因方法不適合在家禽中應(yīng)用。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，不僅具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本特性，還具有廣泛感染各種非分裂期細(xì)胞的特性，克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)易沉默的缺陷，可以整合到宿主細(xì)胞的基因組上長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，宿主免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)對(duì)禽類胚胎的遺傳操作，無(wú)疑具有極大的優(yōu)勢(shì)。將包裝好的病毒顆粒導(dǎo)入禽類胚胎，使其感染原始生殖細(xì)胞或生殖干細(xì)胞，通過(guò)病毒感染將目的基因整合到其基因組中，孵出后獲得性系嵌合體，再將這些嵌合體家禽與同種野生型個(gè)體交配，在子代中就可能獲得攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，慢病毒載體法已成為制備轉(zhuǎn)基因禽類最有效和最成功的方法之一[5]。

目前報(bào)道的利用慢病毒載體介導(dǎo)制備轉(zhuǎn)基因禽類都是將慢病毒載體注射到發(fā)育第Ⅹ期的胚盤(pán)下腔中，通過(guò)感染胚盤(pán)中的原始生殖細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因禽類[6-15]。這種方法一般要通過(guò)3期培養(yǎng)體系對(duì)雞胚胎進(jìn)行孵化[7]，過(guò)程繁瑣，往往導(dǎo)致胚胎孵化率較低。為了獲得更多的個(gè)體不僅需要包被大量的高滴度慢病毒顆粒，而且由于胚盤(pán)上下胚層細(xì)胞間距離很近，注射時(shí)顯微注射玻璃針?lè)浅Ｈ菀状唐葡聦蛹?xì)胞，將液體注入卵黃中，致使病毒顆粒無(wú)法作用于胚盤(pán)原始生殖細(xì)胞而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗[16]。

在禽類胚胎血液循環(huán)系統(tǒng)建立后，其PGCs會(huì)進(jìn)入血管隨血液循環(huán)遷移至原始生殖嵴部位，而后穿過(guò)血管壁進(jìn)入原始生殖嵴中定居，并在其中生長(zhǎng)、分裂、分化成配子。有研究表明[17-18]，將脂質(zhì)體包裹的外源基因直接注射入第14期胚胎血液，轉(zhuǎn)染循環(huán)期的PGCs，在受體性腺區(qū)域可檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。在胚胎發(fā)育至13～15期對(duì)胚胎血管進(jìn)行顯微注射操作后，不僅不需要將胚胎換入代用蛋殼中培養(yǎng)，而且注射對(duì)胚胎生命力的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于胚盤(pán)期注射的影響，孵化率相對(duì)較高[19]。因此，本研究在胚胎發(fā)育至13～15期時(shí)將慢病毒載體通過(guò)血管微注射方法導(dǎo)入鵪鶉胚胎，以期感染血液循環(huán)中的正在遷移的PGCs，通過(guò)孵化得到性系嵌合體個(gè)體，經(jīng)過(guò)交配繁殖后代最終獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 種蛋及HIV-1型慢病毒載體 鵪鶉種蛋購(gòu)自宏達(dá)鵪鶉種場(chǎng)。所用HIV-1型慢病毒載體購(gòu)自紐恩(上海)生物科技有限公司。載體信息見(jiàn)圖1。

1.1.2 試劑盒、耗材及工具酶 PCR預(yù)混液購(gòu)自天澤生物技術(shù)有限公司，血液及精液基因組提取試劑盒、RNase A酶購(gòu)自天根生物科技有限公司，精子基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ購(gòu)自羅氏公司，Southern雜交膜(Amersham-XL尼龍膜)購(gòu)自GE公司，X光片購(gòu)自Kodak 公司，顯影濃縮液及定影濃縮液購(gòu)自樂(lè)凱公司，PCR引物的合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、PstⅠ購(gòu)自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 鵪鶉種蛋的處理 新鮮鵪鶉種蛋取回后，先用0.1%的新潔爾滅溶液清洗，除去表面污跡，然后用70%酒精噴灑消毒，待蛋殼表面晾干后放進(jìn)孵化器里進(jìn)行孵化，孵化溫度為37.5 ℃，相對(duì)濕度為55%～65%，每2 h 90°自動(dòng)翻蛋。1.2.2 胚胎血管顯微注射慢病毒 將發(fā)育至13～15期的鵪鶉種蛋取出，上下輕輕晃動(dòng)使胚胎脫離內(nèi)層殼膜，通過(guò)纖維光源照蛋確定胚胎所處位置并用鉛筆在蛋殼上做好標(biāo)記，用牙科鉆在記號(hào)附近打出一個(gè)直徑為4 mm左右的小孔；在解剖顯微鏡下用顯微注射器將1 μL(滴度為1×109TU·mL-1)慢病毒溶液緩慢注射到鵪鶉胚胎血管中，用parafilm膜封閉開(kāi)口，標(biāo)記后放回孵化器，繼續(xù)孵化至出雛。

LTR.長(zhǎng)末端重復(fù)序列；Psi.包裝信號(hào)序列；RRE.呼長(zhǎng)孤病毒應(yīng)答元件；U6.U6啟動(dòng)子；CMV.巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子；eGFP.增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因序列；WRE.旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控原件；SinLTR.自我滅活長(zhǎng)末端重復(fù)序列。上面標(biāo)示為以綠色熒光蛋白基因序列做探針檢測(cè)DNA雜交的大致位置；下面標(biāo)示為限制性內(nèi)切酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ大致的酶切位點(diǎn)LTR.Long terminal repeat；Psi.Packaging signal；RRE.Rev responsive element；U6.U6 promoter；CMV.Cytomegalovirus promoter；eGFP.Enhanced green fluorescent protein gene；WRE.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element；SinLTR.Self-inactivating LTR.The approximate position of the probe for detecting the eGFP gene by Southern blotting analysis were indicated above the sequence.Restriction enzyme sites Pst Ⅰ and EcoR Ⅰ and locations of probe used for Southern blotting are depicted圖1 質(zhì)粒載體pGCL-eGFP原理結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Diagram of the relevant regions of the pGCL-eGFP vector

1.2.3 外源基因eGFP在鵪鶉體內(nèi)表達(dá)檢測(cè) 根據(jù)HIV-1慢病毒載體的表達(dá)特性，對(duì)胚胎血管顯微注射慢病毒后，分別在孵化第4天、剛孵化出3 d鵪鶉進(jìn)行解剖后，在熒光顯微鏡下對(duì)各個(gè)組織器官內(nèi)的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 PCR檢測(cè) 根據(jù)基因組提取試劑盒方法，對(duì)G0代雄性鵪鶉精液基因組及46只G1后代血液基因組提取后進(jìn)行PCR檢測(cè)。參照慢病毒載體pGCL-eGFP中eGFP序列信息，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物：5′-CGGCCACAAGTTCAGCGTGTC-3′；下游引物：5′-CGATGGGGGTGTTCTGCTGGT-3′；擴(kuò)增長(zhǎng)度為497 bp的eGFP基因內(nèi)部片段。PCR擴(kuò)增體系25 μL；基因組DNA 2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，PCR預(yù)混液 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，64 ℃45 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 Southern blot分析 對(duì)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的G1代個(gè)體及陰性對(duì)照個(gè)體，提取血液基因組10～20 μg，37 ℃水浴條件下，EcoR I和PstI雙酶切消化過(guò)夜，1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。根據(jù)質(zhì)粒載體pGCL-eGFP序列，隨機(jī)引物法標(biāo)記探針，PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)876 bp DNA 片段，作為Southern blot的探針。地高鋅核酸探針標(biāo)記Southern blot按羅氏公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ說(shuō)明操作。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎血管顯微注射慢病毒后孵化率統(tǒng)計(jì)

在進(jìn)行正式試驗(yàn)之前，對(duì)病毒載體進(jìn)行了濃度梯度注射試驗(yàn)，以便確定合適的劑量、滴度使試驗(yàn)達(dá)到預(yù)期最佳效果。從孵化率、發(fā)育到性成熟期的成活率及性腺中綠色熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱等指標(biāo)，確立孵化溫度為37.5 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，每隔2 h 90°自動(dòng)翻蛋，孵化46～48 h，注射劑量1 μL，病毒滴度 1×109TU·mL-1時(shí)試驗(yàn)綜合效果最佳。病毒滴度過(guò)高，孵化率及成活率低；病毒滴度過(guò)低，性腺中綠色熒光蛋白的信號(hào)很弱。在該試驗(yàn)中，胚盤(pán)下腔顯微注射體積1 μL、病毒滴度為1×109TU·mL-1鵪鶉種蛋80枚，孵化出雛48只，孵化率為60%。

2.2 血管顯微注射慢病毒早期綠色熒光蛋白基因表達(dá)的檢測(cè)

在注射慢病毒后的96 h即胚胎孵化的第6天，對(duì)操作過(guò)的胚胎進(jìn)行了隨機(jī)解剖，在倒置熒光顯微鏡下對(duì)卵黃膜進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示：在隨機(jī)抽檢的胚胎中，全部生長(zhǎng)發(fā)育正常，且在胚胎卵黃膜血管上觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)(圖2A)，說(shuō)明在顯微注射體積1 μL、病毒滴度為1×109TU·mL-1，對(duì)早期胚胎發(fā)育沒(méi)有造成明顯的不良影響，且慢病毒載體攜帶的外源基因沒(méi)有出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。

A.6 d的胚胎卵黃膜；B.喙部；C.羽毛；D.肝；E.腎；F.腸系膜；G.腺胃；H.小腸；I.大腸；J.血管；K.胸??；L.脾；M.心；N.輸卵管；O.眼部；P.大腦；Q.卵泡；R.骨骼肌A.eGFP expression in the vitelline membrane of 6 day-old embryo；B.Beak；C.Feather;D.Liver;E.Kidney;F.Mesenterium;G.Glandular stomach;H.Small intestine;I.Large intestine;J.Blood vessel;K.Breast muscle;L.Spleen;M.Heart;N.Oviduct;O.Eye;P.Brain of newly hatched G0 quails；Q.The follicle of sexually matured G0 quail;R.The skeletal muscle of G0 progeny圖2 血管微注射慢病毒載體嵌合體鵪鶉各組織中綠色熒光蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of eGFP in tissues of hatched transgenic chimeric quail under the fluorescence microscopy.Lentiviral vector was injected into the blood vessels of embryos

2.3 新生鵪鶉不同內(nèi)臟組織器官中綠色熒光蛋白基因表達(dá)的檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證慢病毒載體攜帶的外源基因是否能夠持續(xù)表達(dá)，對(duì)試驗(yàn)組出雛3 d鵪鶉隨機(jī)解剖后，將各組織臟器置于熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示：在新生鵪鶉的喙部、羽毛、肝、腎、腸系膜、腺胃、小腸、大腸、血管、胸肌、脾、心、輸卵管、眼部、大腦、卵泡及骨骼肌均檢測(cè)到綠色熒光的表達(dá)(圖2 B～R)。其中在眼部、心中的綠色熒光表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)。另外，重點(diǎn)檢測(cè)了性腺中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，觀察到性腺(睪丸)中的綠色熒光蛋白廣泛性表達(dá)，說(shuō)明在胚胎發(fā)育至13～15期，血管顯微注射慢病毒顆粒感染了此時(shí)期血液循環(huán)中正在遷移的原始生殖細(xì)胞，并通過(guò)血液循環(huán)遷移到性腺，并在性腺中分裂、增殖(圖3)。

2.4 G0代雄性鵪鶉精液、G1代鵪鶉血液基因組的PCR及Southern blot檢測(cè)

80枚鵪鶉種蛋，孵化出雛48只，至性成熟階段，用按壓式采精法對(duì)雄性鵪鶉進(jìn)行采精，取21只雄性鵪鶉的精液，提取基因組后進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中5只個(gè)體精液基因組經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.8%(5/21)(圖4)，初步判定這5只雄性鵪鶉的部分精子中攜帶有外源目的基因。針對(duì)5只陽(yáng)性鵪鶉，每只配對(duì)3只野生型雌性鵪鶉，分單籠飼養(yǎng)，每天收集產(chǎn)出的種蛋，標(biāo)記后進(jìn)行孵化。對(duì)新出雛的G1代鵪鶉飼養(yǎng)一周后腿部靜脈采血10 μL，提取基因組后進(jìn)行PCR檢測(cè)，在5只雄性鵪鶉的46只G1后代中，有6只經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為13.0%(6/46)(圖5A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)6只陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行了Southern blot檢測(cè)，雜交結(jié)果顯示6只陽(yáng)性個(gè)體均為轉(zhuǎn)基因鵪鶉后代(圖5B)，說(shuō)明在胚胎發(fā)育至13～15期血管顯微注射慢病毒載體成功制備出轉(zhuǎn)基因鵪鶉。

A.出雛3 d雄性鵪鶉左側(cè)睪丸的暗場(chǎng)；C.出雛3 d雄性鵪鶉右側(cè)睪丸的暗場(chǎng)；E.放大后雄性鵪鶉睪丸的暗場(chǎng)；B、D、F.3 d雄性鵪鶉睪丸對(duì)應(yīng)的明場(chǎng) A.Left testis of a 3 day-old male quail (Dark-field)；C.Right testis of 3 day-old male quail (Dark-field);E.Enlargement of part of the testis;B，D，F(xiàn).Bright-field images圖3 血管顯微注射慢病毒載體后性腺中綠色熒光蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of eGFP in the gonads.Lentiviral vector was injected into the blood vessels of embryos

1～5.PCR檢測(cè)陽(yáng)性個(gè)體；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P.陽(yáng)性對(duì)照； N.陰性對(duì)照1-5.PCR products of sexually matured G0 males produced by microinjection under the subgerminal cavity of the blastodermal embryo;M.DNA markers;P.Positive control;N.Negative control without microinjection of lentiviral vector圖4 G0代雄性鵪鶉精液基因組DNA的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR analysis of genomic DNA extracted from semen of transgenic germ line chimeric(G0) quail

A.PCR檢測(cè)。1～6.G1代的6只陽(yáng)性個(gè)體。M.DNA marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；B.6只陽(yáng)性個(gè)體G1代血液基因組DNA的Southern blot檢測(cè)，1～6.血液基因組DNA(10 μg)經(jīng)Pst I和EcoR I雙酶切后用引物做探針雜交；P.80 pg的pGCL-eGFP質(zhì)粒；N.未注射慢病毒鵪鶉血液基因組DNAA.PCR analysis.1-6.The transgenic quails；M.DNA markers；P.Positive control；N.Negative control.B.Southern blot results.1-6 indicate G1 transgenic quails 1-6(as in A).Genomic DNA(10 μg) was digested with Pst I and EcoR I and hybridized with the eGFP probe；P.80 pg of pGCL-eGFP vector；N.Negative control without injection of lentiviral vector圖5 G1代鵪鶉血液基因組DNA的PCR(A)及Southern blot(B)檢測(cè)Fig.5 PCR and Southern blot analysis of genomic DNA from the blood of G1 transgenic quails

3 討 論

為了驗(yàn)證胚胎早期血管顯微注射法的有效性，本試驗(yàn)選擇了eGFP作為報(bào)告基因，通過(guò)熒光顯微鏡下的觀察可以直觀、快速地檢測(cè)到外源基因是否在受體表達(dá)。本試驗(yàn)中，eGFP基因的表達(dá)是由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)，在G0代新生鵪鶉的喙部、羽毛、肝、腎、腸系膜、腺胃、小腸、大腸、血管、胸肌、脾、心、輸卵管、眼、大腦、卵泡及骨骼肌中都檢測(cè)到了eGFP的表達(dá)(圖2)。特別是在胸肌、心及眼部觀測(cè)到eGFP的廣泛性表達(dá)(圖2)。這與M.J.McGrew等[7]報(bào)道的結(jié)果不同：由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eGFP在胰腺中陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)，在其它組織中只檢測(cè)到很弱的陽(yáng)性信號(hào)。這種eGFP表達(dá)的組織差異及強(qiáng)度差異可能是由于試驗(yàn)所使用的慢病毒載體不同造成的，本試驗(yàn)所使用的慢病毒載體中包含了WRE調(diào)控元件，WRE是美洲旱獺肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，基因轉(zhuǎn)錄后WRE可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄物出核，還可以通過(guò)上調(diào)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的多聚腺苷化來(lái)增加胞內(nèi)信使核糖核酸的總量，最終提高外源基因的表達(dá)效率[20-21]。而M.J.McGrew等[7]所使用的慢病毒載體沒(méi)有此元件。

本試驗(yàn)采取血管顯微注射法將慢病毒載體導(dǎo)入胚胎早期的血液循環(huán)系統(tǒng)，目的是使注入的慢病毒顆粒感染此時(shí)期在血液中正在遷移的PGCs。這種方法需要操作精細(xì)，技術(shù)條件要求較高。由于在注射時(shí)必須在蛋殼上開(kāi)一個(gè)小孔并剪開(kāi)蛋殼膜，破壞了胚胎發(fā)育的正常結(jié)構(gòu)，改變了蛋殼內(nèi)外的壓力平衡，容易造成胚胎血管與蛋殼的黏連，從而影響胚胎的正常發(fā)育。所以操作時(shí)需要顯微注射操作熟練，盡量減少開(kāi)口種蛋停放時(shí)間；另外在蛋殼上打孔面積越小越好，盡量降低對(duì)種蛋完整性的破壞，才能保證注射過(guò)種蛋孵化率達(dá)到60%以上，遠(yuǎn)高于周振明[19]的胚胎血管注射試驗(yàn)的孵化率。目前報(bào)道較多的是通過(guò)胚盤(pán)下腔注射法導(dǎo)入病毒載體[6-7，22-24]，其胚胎孵化率為10%～40%，僅有一組研究人員報(bào)道了使用胚胎期血管微注射的方法制備轉(zhuǎn)基因禽類，其孵化率最高組可達(dá)89%，平均孵化率為63%[25]。在本試驗(yàn)結(jié)果中，孵化率顯然高于胚盤(pán)下腔注射法，相比M.Kamihira等[26]血管注射法孵化率相近，結(jié)果是一致的。另外，有可能與eGFP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的毒性作用影響孵化率有關(guān)[27]，M.S.Kwon等[6]胚盤(pán)下腔顯微注射攜帶eGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，雞胚孵化率僅為注射不含病毒液體組孵化率的1/3左右。從試驗(yàn)結(jié)果看，胚胎血管顯微注射法與胚盤(pán)顯微注射法相比對(duì)胚胎發(fā)育的影響更小，胚胎孵化率高，在操作同樣數(shù)量的種蛋時(shí)，能夠獲得更多的G0個(gè)體。

在本試驗(yàn)中，首先檢測(cè)了G0代雄性鵪鶉精液基因組eGFP的陽(yáng)性率，在21只雄性鵪鶉中5只個(gè)體的精子基因組DNA經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.8%(5/21)，與一些報(bào)道[7，28-29]中的陽(yáng)性率相比稍低，這可能與注射方式的不同以及慢病毒載體種類的不同有關(guān)。對(duì)5只陽(yáng)性雄性鵪鶉測(cè)交46只后代檢測(cè)，有6只經(jīng)PCR及Southern blot檢測(cè)為陽(yáng)性，G1代轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性率為13%(6/46)(圖5)。根據(jù)L.Pardanaud等[30]研究表明，鵪鶉第X期胚盤(pán)中僅有幾個(gè)PGCs，發(fā)育至12～13期時(shí)PGCs增加到90個(gè)左右，14～15期胚胎血液中的PGCs數(shù)量達(dá)到最高值。說(shuō)明在胚胎發(fā)育不同時(shí)期，PGCs數(shù)目高低不同階段注射慢病毒感染PGCs可以獲取效果差異較大的轉(zhuǎn)染效率，從而最終影響轉(zhuǎn)基因效率。這也正是胚胎發(fā)育至13～15期血管顯微注射慢病毒載體后孵化出的G0代新生個(gè)體性腺中(圖3)eGFP基因廣泛性表達(dá)的主要原因。

4 結(jié) 論

本研究將慢病毒載體通過(guò)血管微注射方法導(dǎo)入發(fā)育至13～15期的鵪鶉胚胎，感染血液循環(huán)中正在遷移的PGCs，孵化后得到性系嵌合體，成功制備了轉(zhuǎn)基因鵪鶉后代。今后需進(jìn)一步完善血管微注射法導(dǎo)入慢病毒載體的方法，并通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因后代中外源基因表達(dá)情況，改進(jìn)并設(shè)計(jì)輸卵管特異性表達(dá)的慢病毒載體，為制備轉(zhuǎn)基因禽類生物反應(yīng)器提供新的方法。

[1] PFEIFER A，IKAWA M，DAYN Y，et al.Transgenesis by lentiviral vectors：lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(4)：2140-2145.

[2] KATZOURAKIS A，TRISTEM M，PYBUS O G，et al.Discovery and analysis of the first endogenous lentivirus[J].ProcNatlAcadSciUSA，2007，104(15)：6261-6265.

[3] CHAI N，CHANG H E，NICOLAS E，et al.Assembly of hepatitis B virus envelope proteins onto a lentivirus pseudotype that infects primary human hepatocytes[J].JVirol，2007，81(20)：10897-10904.

[4] PHILIPPE S，SARKIS C，BARKATS M，et al.Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expressioninvitroandinvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(47)：17684-17689.

[5] CLARK J，WHITELAW B.A future for transgenic livestock[J].NatRevGenet，2003，4(10)：825-833.

[6] KWON M S，KOO B C，CHOI B R，et al.Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein[J].BiochemBiophysResCommun，2004，320(2)：442-448..

[7] McGREW M J，SHERMAN A，ELLARD F M，et al.Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors[J].EMBORep，2004，5(7)：728-733.

[8] CHAPMAN S C，LAWSON A，MACARTHUR W C，et al.Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentiviral vector[J].Development，2005，132(5)：935-940.

[9] SCOTT B B，LOIS C.Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(45)：16443-16447.

[10] LILLICO S G，SHERMAN A，MCGREW M J，et al.Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens[J].ProcNatlAcadSciUSA，2007，104(6)：1771-1776.

[11] KWON S C，CHOI J W，JANG H J，et al.Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist(rhIL1RN) from transgenic quail egg white[J].BiolReprod，2010，82(6)：1057-1064.

[12] KALINA J，SENIG F，MICKOVA，et al.Retrovirus-mediatedinvitrogene transfer into chicken male germ line cells[J].Reproduction，2007，134(3)：445-453.

[13] MOTONO M，YAMADA Y，HATTORI Y，et al.Production of transgenic chickens from purified primordial germ cells infected with a lentiviral vector[J].JBiosciBioeng，2010，109(4)：315-321.

[14] LI H C，KANJI M，TAMAO O，et al.Population of circulating primordial germ cells in early Japanese quail embryos[J].JPoultSci，2001，38(2)：175-180.

[15] VAN DE LAVOIR M C，DIAMMOND J H，LEIGHTON P A，et al.Germline transmission of genetically modified primordial germ cells[J].Nature，2006，441(7094)：766-769.

[16] TOBA M，EBARA F，F(xiàn)URUTA H，et al.Introduction of DT40 cells into chick embryos[J].AsianJAndrol，2001，3(1)：49-53.

[17] WATANABE M，NAITO M，SASAKI E，et al.Liposome-mediated DNA transfer into chicken primordial germ cellsinvivo[J].MolReprodDev，1994，38(3)：268-274.

[18] ONO T，MUTO S，MATSUMOTO T，et al.Gene transfer into circulating primordial germ cells of quail embryos[J].ExpAnim，1995，44(4)：275-278.

[19] 周振明.采用轉(zhuǎn)染血液循環(huán)期原始生殖細(xì)胞方法和雞-兔異種動(dòng)物核移植方法制備轉(zhuǎn)基因雞[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004. ZHOU Z M.Production of transgenic chicken by transfection of circulating PGCs and chicken-rabbit interspecies nuclear transfer[D].Beijing：China Agricultural University，2004.(in Chinese)

[20] MORISE H，SHIMOMURA O，JOHNSON F H，et al.Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea[J].Biochemistry，1974，13(12)：2656-2662.

[21] DONELLO J E，LOEB J E，HOPE T J.Woodchuck hepatitis virus contains a tripartite posttranscriptional regulatory element[J].JVirol，1998，72(6)：5085-5092.[22] ZUFFEREY R，DONELLO J E，TRONO D，et al.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors[J].JVirol，1999，73(4)：2886-2892.

[23] HARVEY A J，SPEKSNIJDER G，BAUGH L R，et al.Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens[J].NatBiotechnol，2002， 20(4)：396-399 .

[24] MOZDZIAK P E，POPHAL S，BORWORNPINYO S，et al.Transgenic chickens expressing β-galactosidase hydrolyze lactose in the intestine[J].JNutr，2003，133(10)：3076-3079.

[25] KOO B C，KWON M S，CHOI B R，et al.Production of germline transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector[J].FASEBJ，2006，20(13)：2251-2260.[26] KAMIHIRA M，ONO K，ESAKA K，et al.High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector[J].JVirol，2005，79(17)：10864-10874.[27] PERRY A C，WAKAYAMA T，KISHIKAWA H，et al.Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection[J].Science，1999，284(5417)：1180-1183.[28] SWARTZ W J.Acid and alkaline phosphatase activity in migrating primordial germ cells of the early chick embryo[J].AnatRec，1982，202(3)：379-385.

[29] JALLAT S，PERRAUD F，DALEMANS M，et al.Characterization of recombinant human factor Ⅸ expressed in transgenic mice and in derived trans-immortalized hepatic cell lines[J].EMBOJ，1990，9(10)：3295-3301.

[30] PARDANAUD L，BUCK C，DIETERLEN-LIVRE F.Early germ cells segregation and distribution in the quail blastodisc[J].CellDiffer，1987，22(1)：47-59.

(編輯 程金華)

Producing Transgenic Avian by Microinjection of Lentiviral Vector into the Early Embryo Blood Vessels

ZHANG Zi-fu*，ZHAO Yu，LIU Jin-ni，LI Xun，PENG Xin-liang，ZHANG Ping，HU Jing，HE Dong-yang，CHANG Jiao-jiao，GU Meng-di，JIN Nan-nan，WANG Ya-fang

(LaboratoryofBiotechnologyandAnimalReproduction,DepartmentofAnimalScience，XinyangCollegeofAgriculturalandForestry，Xinyang464000，China)

This study was aimed to identify the availability of early embryo blood vessels microinjection of lentiviral vector as a new，effective way in making transgenic birds，here，we combined some of the transgenic technology such as primordial germ cells(PGCs)，microinjection and lentiviral vector together according to the characteristic of bird development.The number of PGCs in the bloodstream was maximal when the chicken embryoes developed to Hamburger-Hamilton stage 13-15(HH13-15)，1 μL lentiviral vector，containing an enhanced-green fluorescent protein(eGFP)，was microinjected into the blood vessels of quail embryos at stage HH13-15 with a titer of 1×109TU·mL-1.A total of 80 embryos were injected and 48 quails(60%) were successfully hatched.In newly hatched quails，eGFP expression was shown as the presence of green fluorescence in the beak，feather，eye，brain，blood vessels，heart，liver，spleen，lung，kidney，glandular stomach，mesenterium，small intestine，large intestine，oviduct，muscle and claws，especially in gonads.In 5 out of 21 mature G0 male quails，the semen waseGFP-positive(5/21，23.8%)，as detected by polymerase chain reaction(PCR).Southern blot and genetic analyses revealed that in the 46 G1 offspring produced by G0 quail，6 were transgenic(6/46，13.0%) according to the PCR and Southern blot results.In conclusion，transgenic germ line chimeras was successfully generated by injection of lentiviral vector into embryonic blood vessel at stage HH 13-15.It indicated that infection of PGCs with lentiviral vector via direct injection into blood vessels has the potential to provide a more convenient and efficient way to produce transgenic birds.

microinjection;lentiviral vector;transgenic birds;enhanced green fluorescent protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.009

2015-03-04

信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院博士基金項(xiàng)目(201201020)；河南省博士后研發(fā)基地項(xiàng)目(2014-69)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(B20143690)

張自富(1974-)，男，河南信陽(yáng)人，講師，博士，主要從事動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究

*通信作者：張自富，博士，E-mail：zzf5205@126.com

S814.8

A

0366-6964(2015)12-2185-07