硼酸對非洲雛鴕鳥肺組織形態(tài)學(xué)的影響

唐 娟，肖 珂，鄭昕婷，朱黛云，王 為，王 靜，楊 智，孫鵬鵬，王艷紅，王曉藝，彭克美*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.河南金鷺特種養(yǎng)殖股份有限公司，鄭州 450008)

硼酸對非洲雛鴕鳥肺組織形態(tài)學(xué)的影響

唐 娟1，肖 珂1，鄭昕婷1，朱黛云1，王 為1，王 靜1，楊 智1，孫鵬鵬1，王艷紅2，王曉藝2，彭克美1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.河南金鷺特種養(yǎng)殖股份有限公司，鄭州 450008)

旨在探明飲水中添加不同劑量硼酸對 45 d非洲雛鴕鳥肺組織形態(tài)學(xué)的影響。1 d非洲雛鴕鳥 24 羽，隨機(jī)分為 6 組，分別在飲水中添加 0(A 組，對照組)、40(B 組)、80(C 組)、160(D 組)、320(E 組)、640 mg·L-1(F 組)劑量的硼酸。飼喂至45 d 取肺組織進(jìn)行石蠟包埋，切片，通過 HE 染色，MASSON 染色和TUNEL 技術(shù)進(jìn)行分析。與對照組相比，HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)，添加40和80 mg·L-1硼酸劑量組，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，發(fā)育良好，無明顯病變，而從160 mg·L-1劑量開始，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病變，異嗜性粒細(xì)胞增多，炎癥反應(yīng)加重，細(xì)胞間質(zhì)增厚；MASSON 染色觀察發(fā)現(xiàn)，320和640 mg·L-1劑量組肺組織膠原纖維沉淀明顯增加；運(yùn)用 IPP 軟件對 TUNEL試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯示，添加硼酸劑量 40 mg·L-1時(shí)可減少雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡，劑量高于320 mg·L-1時(shí)增加肺組織細(xì)胞凋亡。綜合上述結(jié)果，在飲水中添加硼酸，40 mg·L-1時(shí)可減少雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡，劑量高于160 mg·L-1時(shí)能促進(jìn)肺組織中發(fā)生炎癥反應(yīng)，劑量高于 320 mg·L-1時(shí)能增加肺組織細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)肺纖維化。

肺纖維化；細(xì)胞凋亡；硼酸；肺；鴕鳥

非洲鴕鳥(Struthiocamelus)是現(xiàn)存最大的鳥綱動(dòng)物，不會(huì)飛行但善于奔跑。鴕鳥是原始?xì)埓骧B類，有重要的進(jìn)化地位。1973年，非洲鴕鳥就已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》中，至今數(shù)量仍在減少。目前國內(nèi)外對鴕鳥的研究主要集中在鴕鳥神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、骨骼結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、內(nèi)分泌腺和激素分泌規(guī)律等方面，而對鴕鳥呼吸系統(tǒng)的研究相對薄弱。

呼吸系統(tǒng)是機(jī)體相對開放的系統(tǒng)，肺通過氣管與外界相通，發(fā)生氣體交換。雛鴕鳥肺組織并未發(fā)育完善，且雛鴕鳥是呼吸道疾病的易感動(dòng)物群，很容易受到流行病，傳染病等的侵害，導(dǎo)致了很高的死亡率，尤其是前三個(gè)月的雛鴕鳥[1]。

近年來不斷有研究者提出硼是人和多種動(dòng)物維持多項(xiàng)正常生物學(xué)功能的必需微量元素[2，3]。硼在人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)參與骨代謝、底物能量代謝及多種微量元素代謝進(jìn)程，能影響血細(xì)胞、免疫相關(guān)細(xì)胞(主要是T、B淋巴細(xì)胞)和生殖細(xì)胞的增殖與分化，調(diào)節(jié)血液生化指標(biāo)和激素水平，改變動(dòng)物生長性能、腦功能和免疫功能，且在胚胎發(fā)育中不可或缺，低硼或無硼飲食都會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生不利影響[4]。然而硼對呼吸系統(tǒng)的影響卻無報(bào)道。本研究從形態(tài)學(xué)角度觀察不同劑量的飲水硼酸對雛鴕鳥肺組織結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步研究硼酸對鴕鳥肺組織發(fā)育的作用機(jī)制以及預(yù)防鴕鳥呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

硼酸(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；多聚甲醛(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；磷鉬酸(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；麗春紅s(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；亮綠SF(上海源葉生物科技)；蘇木色精(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；伊紅Y(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；紅色氧化汞(北京金星)；中性樹膠(國藥)；多聚賴氨酸(武漢博士德)；TUNEL試劑盒(Roche，cat.No.11684817910，瑞士豪夫邁·羅氏公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組飼養(yǎng)管理

臨床健康1 d鴕鳥24羽隨機(jī)分為 6 組，每組 4 羽。各組飲水中硼酸質(zhì)量濃度分別為0(對照組)、40、80、160、320、640 mg·L-1，分別編號為A組(對照組)、B組、C組、D組、E組、F組。雛鴕鳥按河南鴕鳥養(yǎng)殖園企業(yè)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)管理，各組除飲水外，日糧及其他飼養(yǎng)條件完全相同。這些鴕鳥被安置在相同溫度、濕度和光控的房間，12 h光照，12 h黑暗。在前兩周，雛鴕鳥室溫保持在25 ℃的恒定溫度下。將室內(nèi)溫度每周降低1 ℃，直到45日齡取材[1]，將肺組織迅速投入4%多聚甲醛緩沖液固定48 h。

1.3 制備石蠟切片

4%多聚甲醛緩沖液固定的鴕鳥肺組織塊，梯度酒精脫水，二甲苯或水楊酸甲酯透明，60 ℃浸蠟后包埋，制作成4 μm厚的石蠟切片。

1.4 HE染色

切片脫蠟至水，蘇木素染色8 min，流水沖洗 5 min，1%鹽酸分化液稍分化，再?zèng)_洗返藍(lán)10 min 后鏡檢。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.5 MASSON染色

切片脫蠟至水，蒸餾水洗3次，每次5 min；蘇木素染色液7 min，流水沖洗1 min；1% 鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗10 min，蒸餾水洗3 min；MASSON麗春紅酸性復(fù)紅染液染色8 min，2% 冰醋酸水溶液浸洗2次，每次 30 s；1% 磷鉬酸水溶液分化4 min(避光操作)，不水洗直接用亮綠染液8 min；2% 冰醋酸水溶液浸洗1 min；梯度酒精脫水各3 min，二甲苯2次，各5 min，中性樹膠封片。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)(TUNEL法)

該工程主要工程量為全段河道斷面的擴(kuò)挖，土方工程量大，工期緊、任務(wù)重；全段邊坡的護(hù)砌采用C25（抗?jié)BW6、抗凍 F150、厚度 0.2 m）模袋混凝土護(hù)坡（在不斷航情況下施工），由于坡比大，給模袋混凝土護(hù)坡充灌增加了一定難度，需合理控制充灌壓力。

切片脫蠟至水，雙蒸水洗滌3次，每次5 min；滴加Proteinase K工作液(Proteinase K原液，1∶200 TBS稀釋)處理組織，37 ℃孵育30 min 。PBS 洗滌2次每次5 min；將切片上的液體甩凈，滴加 TUNEL反應(yīng)混合液(TdT 與熒光素標(biāo)記的dUTP 液 1∶9 混勻)，陰性對照組僅加熒光素標(biāo)記液(label solution)，置于濕盒中，37 ℃孵育1 h。PBS 洗滌 3 次每次5 min，濾紙吸干組織周圍液體；玻片干后加 converter-POD于組織上，37 ℃避光反應(yīng)30 min。PBS洗滌3次，每次5 min；滴加DAB工作液，室溫顯色3～5 min，鏡檢控制顯色深度。蒸餾水洗滌3次，每次5 min；蘇木素復(fù)染 5 min，流水沖洗7 min后1%鹽酸分化液稍分化，再?zèng)_洗返藍(lán)10 min 后；梯度酒精脫水各 1 min，二甲苯2次各3 min，中性樹膠封片。

1.7 顯微攝影及圖像分析

切片進(jìn)行 HE染色和MASSON染色，OLYMPUS DP2_BSW 顯微攝影系統(tǒng)明視野觀察組織顯微結(jié)構(gòu)變化，并進(jìn)行顯微攝影；TUNEL技術(shù)用熒光顯微鏡暗視野觀察熒光信號，并進(jìn)行顯微攝影；運(yùn)用IPP(Image-Pro Plus)軟件批量檢測MASSON染色圖片和TUNEL熒光圖片的膠原纖維和凋亡陽性信號的IOD(integral optical density，積分光密度)值，對各組的IOD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，輔助SPSS軟件用單因素分析法對IOD值進(jìn)行顯著差異性統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用作圖軟件Graphpad Prism。各試驗(yàn)組均與對照組比較并作差異顯著性分析：差異不顯著(P>0.05)；差異顯著(P<0.05)，用*表示；差異極顯著(P<0.01)，用**表示，n=4。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色觀察硼酸對非洲雛鴕鳥肺組織結(jié)構(gòu)的影響

通過制作石蠟切片，HE染色發(fā)現(xiàn)，與對照組(圖1A)相比，40、80 mg·L-1硼酸劑量組(圖1B、C)肺組織結(jié)構(gòu)無明顯變化，肺組織結(jié)構(gòu)清晰，三級支氣管、肺房及呼吸毛細(xì)管結(jié)構(gòu)完整，無明顯充血、出血或炎性浸潤等現(xiàn)象，上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，發(fā)育良好；160 mg·L-1硼酸劑量組(圖1D)有稍微的間質(zhì)增厚現(xiàn)象，異嗜性粒細(xì)胞較前幾組多，組織結(jié)構(gòu)沒有明顯的病理變化；320、640 mg·L-1硼酸劑量組(圖1E、F)肺組織已有明顯病變，組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，形態(tài)模糊不易辨認(rèn)，肺房被壓縮變形甚至塌陷，異嗜性粒細(xì)胞增多，局部炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞間質(zhì)增厚，細(xì)胞排列紊亂，局部肺實(shí)變，部分三級支氣管腔有脫落細(xì)胞，三級支氣管腔變小，呈彌散性肺纖維化(圖1)。

A.對照組，添加0 mg·L-1 硼酸；B.添加40 mg·L-1 硼酸組；C.添加80 mg·L-1 硼酸組；D.添加160 mg·L-1 硼酸組；E.添加320 mg·L-1 硼酸組；F.添加640 mg·L-1 硼酸組。箭頭所示異嗜性粒細(xì)胞A.Control group，0 mg·L-1 boric acid；B.40 mg·L-1 boric acid；C.80 mg·L-1 boric acid；D.160 mg·L-1 boric acid；E.320 mg·L-1 boric acid；F.640 mg·L-1 boric acid.Arrow.Heterophilic granulocyte圖1 45 d非洲雛鴕鳥肺組織結(jié)構(gòu)(HE染色，100 ×)Fig.1 The lung tissue structure of 45 d African ostrich chicks(HE staining，100 ×)

為了得到肺組織病理改變的量化標(biāo)準(zhǔn)，故將光鏡下肺組織病理改變程度人為分為無、輕度和重度3級進(jìn)行比較性研究，比較內(nèi)容包括毛細(xì)血管充血、肺泡腔纖維蛋白滲出、肺泡腔及其間隔異嗜性粒細(xì)胞滲出、管腔內(nèi)脫落上皮細(xì)胞和肺泡間隔增寬[4]。參考肺組織病理分級標(biāo)準(zhǔn)(表1)，對鴕鳥肺組織進(jìn)行了病理分級評分(表2)。

表1 肺組織病理改變分級標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Lung histopathology grading

分級指標(biāo)Classificationindex病變分級Histopathologygrading無None輕度Slight重度Severe毛細(xì)血管充血無有少許紅細(xì)胞紅細(xì)胞較多或幾乎充滿管腔肺泡腔纖維蛋白滲出無有少許纖維蛋白滲出滲出較多或幾乎充滿肺泡腔肺泡腔及間隔異嗜性粒細(xì)胞滲出無可疑中性粒細(xì)胞滲出散在或呈小灶狀滲出管腔內(nèi)脫落上皮細(xì)胞無可疑上皮細(xì)胞脫落管腔內(nèi)上皮細(xì)胞脫落肺泡間隔增寬無稍有增寬顯著增寬或失去正常肺泡結(jié)構(gòu)

表2 鴕鳥肺組織病理分級

Table 2 The grades of lung histopathology grading of ostrich

評分指標(biāo)Scoreindex組別GroupsA組(0mg·L-1)B組(40mg·L-1)C組(80mg·L-1)D組(160mg·L-1)E組(320mg·L-1)F組(640mg·L-1)毛細(xì)血管充血無無無輕度重度重度肺泡腔纖維蛋白滲出無無無輕度重度重度肺泡腔及間隔異嗜性粒細(xì)胞滲出無無輕度輕度重度重度管腔內(nèi)脫落上皮細(xì)胞無無無輕度輕度重度肺泡間隔增寬無無無輕度重度重度

2.2 MASSON 染色觀察硼酸對非洲雛鴕鳥肺纖維化的影響

鴕鳥肺組織石蠟切片經(jīng)MASSON染色后可清晰觀察到鴕鳥肺組織纖維化形成，對照組(圖2A)顯示的是正常鴕鳥肺組織MASSON染色結(jié)構(gòu)，膠原纖維呈綠色，肌纖維成褐紅色，紅細(xì)胞呈金黃色，細(xì)胞核呈黑色，鴕鳥肺組織含有少量的膠原纖維，為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，所以鴕鳥肺組織肺房周圍有一層被染成絲線狀淺綠色的膠原纖維。與對照組(圖2A)相比，40、80和160 mg·L-1硼酸劑量組(圖2B、C、D)肺組織結(jié)構(gòu)無顯著區(qū)別，甚至膠原纖維著色更淺一些；320和 640 mg·L-1硼酸劑量組(圖2E、F)肺組織中綠色的膠原纖維增多，平滑肌和肺間質(zhì)細(xì)胞中幾乎都有膠原纖維出現(xiàn)，尤其是640 mg·L-1硼酸劑量組(圖2F)最為明顯。

通過IPP軟件批量檢測MASSON染色圖片膠原纖維的IOD值，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，320和 640 mg·L-1硼酸劑量組(圖3)肺組織中膠原纖維IOD值顯著增多，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 TUNEL 技術(shù)觀察硼酸對非洲雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡的影響

鴕鳥肺組織石蠟切片經(jīng)TUNEL技術(shù)熒光顯色后可清晰觀察到鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡情況，對照組(圖4A)顯示的是正常鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡情況，圖中綠色熒光為陽性信號，即凋亡陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞主要分布于肺房和呼吸性毛細(xì)管周圍，平滑肌上幾乎沒有熒光信號，三級支氣管腔內(nèi)也無任何熒光信號。與對照組(圖4A)相比，40、80、160 mg·L-1硼酸劑量組(圖4 B、C、D)熒光信號減弱，320和 640 mg·L-1硼酸劑量組(圖4 E、F)熒光信號增強(qiáng)。

A.對照組，添加0 mg·L-1 硼酸；B.添加40 mg·L-1 硼酸組；C.添加80 mg·L-1 硼酸組；D.添加160 mg·L-1 硼酸組；E.添加320 mg·L-1 硼酸組；F.添加640 mg·L-1 硼酸組。原圖中被染成金黃色的是紅細(xì)胞，褐紅色的是平滑肌，綠色是膠原纖維，深藍(lán)色的是細(xì)胞核，黑白圖中未顯示A.Control group，0 mg·L-1 boric acid；B.40 mg·L-1 boric acid；C.80 mg·L-1 boric acid；D.160 mg·L-1 boric acid；E.320 mg·L-1 boric acid；F.640 mg·L-1 boric acid.The golden color.Red blood cells；Green color.Collagen fibers；The mazarine color.Nucleus，those can’t be displayed by black-and-white pictures圖2 45 d 非洲雛鴕鳥肺組織纖維分布(MASSON 染色，40×)Fig.2 The distribution of lung tissue fiber in 45 d African ostrich chicks(MASSON staining，40×)

與對照組相比，**.P<0.01，n=4Compared with control group，** showed highly significant difference (P<0.01)，n=4 per group圖3 45 d 鴕鳥肺組織膠原纖維IOD值測定Fig.3 The detection of ostrich lung tissue collagen fiber IOD values

通過IPP軟件檢測批量檢測TUNEL熒光圖片凋亡細(xì)胞的IOD值，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，40 mg·L-1硼酸劑量組肺組織凋亡細(xì)胞IOD值顯著減少，320和 640 mg·L-1硼酸劑量組肺組織中凋亡細(xì)胞IOD值顯著增多(圖5)，差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 非洲鴕鳥肺組織

非洲鴕鳥原本是野生動(dòng)物，目前鴕鳥已經(jīng)被世界各地農(nóng)場集體飼養(yǎng)，這讓雛鴕鳥成為各種傳染病、疾病和應(yīng)激原的易感動(dòng)物，導(dǎo)致了很高的死亡率，尤其是前三個(gè)月的雛鴕鳥，死亡率高達(dá)50%[1，5]。雛鴕鳥的生長趨勢很特別，生長發(fā)育很快，并且同一年齡段的鴕鳥大小懸殊很大[6-7]，特別是在鴕鳥生長的前三個(gè)月(育雛期)最為明顯[8]。所以本試驗(yàn)選擇雛鴕鳥作為研究對象。

非洲鴕鳥肺組織結(jié)構(gòu)比較特別，具有哺乳動(dòng)物和禽類肺組織的雙重結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。鴕鳥肺次級支氣管黏膜有明顯的皺襞，絨毛很發(fā)達(dá)，假復(fù)層柱狀纖毛上皮，固有膜為疏松結(jié)締組織，外側(cè)為平滑肌層；三級支氣管與肺房、呼吸毛細(xì)管有開口，管壁不完整，黏膜為單層立方上皮，固有膜結(jié)締組織少，下皮有散在分布的平滑?。环畏啃《?，排列不規(guī)則，肺房和呼吸毛細(xì)管有開口；呼吸毛細(xì)管管壁為單層扁平上皮，周圍有豐富的毛細(xì)血管；肺實(shí)質(zhì)有孤立淋巴小結(jié)散在分布[9]；油鏡下可觀察到類似于哺乳動(dòng)物的Ⅰ型細(xì)胞和Ⅱ型細(xì)胞。

A.對照組，添加0 mg·L-1 硼酸；B.添加40 mg·L-1 硼酸組；C.添加80 mg·L-1 硼酸組；D.添加160 mg·L-1 硼酸組；E.添加320 mg·L-1 硼酸組；F.添加640 mg·L-1 硼酸組；圖A中右上角所附小圖為陰性對照組，無任何熒光信號A.Control group，0 mg·L-1 boric acid；B.40 mg·L-1 boric acid；C.80 mg·L-1 boric acid；D.160 mg·L-1 boric acid；E.320 mg·L-1 boric acid；F.640 mg·L-1 boric acid圖4 45 d 非洲雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡分布(TUNEL技術(shù)熒光顯微照片，20×)Fig.4 Effect of boric acid on the apoptosis cells in ostrich lung(TUNEL method，20×)

與對照組相較，**表示差異極顯著(P<0.01)，n=4Compared with control group，**.P<0.01， n=4 per group圖5 45 d 鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡IOD的檢測Fig.5 The detection of ostrich lung tissue apoptosis cells IOD values

非洲鴕鳥肺在組織結(jié)構(gòu)和生理功能上與其他鳥類有所不同。從結(jié)構(gòu)上看，鴕鳥肺與其他鳥類相較，新肺不發(fā)達(dá)，這被認(rèn)為是走鳥類的普遍特征[10]。由此，鴕鳥肺組織的形態(tài)學(xué)特性和獨(dú)特功能，解釋了鴕鳥在持續(xù)高溫環(huán)境中也不會(huì)發(fā)生呼吸性堿中毒的機(jī)制[10]。

3.2 硼酸對肺組織的影響

研究表明，適當(dāng)劑量的硼在整個(gè)生命周期中有多種生物學(xué)功能，并且具有抗炎效應(yīng)[11]，在維持細(xì)胞的完整性中起著重要的作用[12]，本研究發(fā)現(xiàn)，添加硼酸劑量低于80 mg·L-1，肺組織中異嗜性粒細(xì)胞無明顯變化，而添加硼酸劑量超過 160 mg·L-1時(shí)(高劑量硼酸)，肺組織中異嗜性粒細(xì)胞明顯增加，促使肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。因此，適宜劑量的硼酸能夠發(fā)揮有效的抗炎作用；當(dāng)硼酸劑量超過160 mg·L-1時(shí)，硼酸作為機(jī)體的外來刺激物，誘導(dǎo)雛鴕鳥肺發(fā)生炎癥反應(yīng)。炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御反應(yīng)，異嗜性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是呼吸系統(tǒng)對抗外來刺激的第一道防線[13]。當(dāng)肺組織受到刺激原刺激，上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會(huì)分泌白介素1β，TNF-α、TGF-β、INF-γ等大量細(xì)胞因子[14]，從而激發(fā)機(jī)體的炎癥應(yīng)答。

通過TUNEL技術(shù)可見，飲水硼酸添加質(zhì)量濃度為40 mg·L-1時(shí)可顯著抑制雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡，劑量高于 320 mg·L-1時(shí)能顯著促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。適度的細(xì)胞凋亡可幫助組織修復(fù)生長，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化，維持機(jī)體組織器官正常的結(jié)構(gòu)等。異常細(xì)胞凋亡則可導(dǎo)致機(jī)體損傷，造成組織病態(tài)修復(fù)，結(jié)構(gòu)破壞及功能失常等。W.T.Barranco等研究表明，硼酸抑制人前列腺癌細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)劑量依賴性，卻未檢測到硼酸引起caspase-3活性和細(xì)胞凋亡兩個(gè)指標(biāo)的變化[15]，然而之后有研究表明，硼酸能夠誘導(dǎo)前列腺癌和乳腺癌兩種細(xì)胞系凋亡，試驗(yàn)中檢測到caspase-3活性有變化[16]。最近有研究報(bào)道低濃度的硼酸可抑制雛鴕鳥胸腺細(xì)胞凋亡，高濃度硼酸可誘導(dǎo)雛鴕鳥胸腺細(xì)胞凋亡[17]。綜合以上研究報(bào)道，本試驗(yàn)中硼酸與細(xì)胞凋亡的關(guān)系與前人研究結(jié)論一致。

MASSON染色可見，添加硼酸劑量大于320 mg·L-1時(shí)，肺組織膠原纖維沉淀增加，可推測為高劑量硼酸可誘導(dǎo)肺組織纖維化。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，有研究認(rèn)為其發(fā)生的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[18]。肺纖維化主要是由于肺泡上皮細(xì)胞損傷，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，最終導(dǎo)致肺組織異常，結(jié)構(gòu)重塑[13，19]。在肺纖維化過程中，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮著一個(gè)平衡作用。在肺纖維化進(jìn)程中成纖維細(xì)胞凋亡減少[20]，肺泡上皮細(xì)胞凋亡明顯升高[21]。在本試驗(yàn)中，添加硼酸劑量為40 mg·L-1時(shí)可顯著抑制雛鴕鳥肺組織細(xì)胞凋亡，劑量高于 320 mg·L-1時(shí)能顯著誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞凋亡，我們不清楚肺組織中凋亡的是成纖維細(xì)胞還是上皮細(xì)胞，所以此處只能結(jié)合本試驗(yàn)中的其他結(jié)果綜合考慮，首先是HE染色可見高劑量加硼酸組(>160 mg·L-1)細(xì)胞間質(zhì)增厚，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，MASSON染色可見高劑量加硼酸組(>320 mg·L-1)膠原蛋白沉淀較前幾組顯著增加，疑似發(fā)生肺纖維化，而肺纖維化能夠促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡[22]。綜上所述，飲水添加硼酸濃度高于320 mg·L-1可誘導(dǎo)鴕鳥肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肺的纖維化，但是硼酸對鴕鳥肺纖維化的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] BONATO M，EVANS M R，HASSELQUIST D，et al.Ostrich chick humoral immune responses and growth rate are predicted by parental immune responses and paternal colouration[J].BehavEcolSociobiol，2013，67(12)：1891-1901.

[2] NIELSEN F H.Is boron nutritionally relevant?[J].NutrRev，2008，66(4)：183-191.

[3] HUNT C D.Dietary boron：progress in establishing essential roles in human physiology[J].JTraceElemMedBiol，2012，26(2-3)：157-160.

[4] 盧 巖，宿英英，馮景陽，等.大鼠急性腦缺血時(shí)肺臟病理改變及內(nèi)皮素-1含量變化[J].中華老年心腦血管病雜志，2002，4(5)：337-340. LU Y，SU Y Y，F(xiàn)ENG J Y，et al.The pathomorphological changes of lung and the changes in endothelin-1 contents in plasma and bronchoalveolar lavage fluid in rats with acute cerebral ischemia[J].ChineseJournalofGeriatiricHeartBrainandVesselDiseases，2002，4(5)：337-340.(in Chinese)

[5] DEEMING D C.Rearing environments around the world[M]//The ostrich：biology，production and health.CABI Publishing，1999：191-216.

[6] DEEMING D C，AYRES L.Factors affecting the rate of growth of ostrich(Struthio camelus) chicks in captivity[J].VetRec，1994，135(26)：617-622.

[7] DEEMING D C，AYRES L，AYRES F J.Observations on the commercial production of ostrich(Struthio camelus) in the United Kingdom：rearing of chicks[J].VetRec，1993，132(25)：627-631.

[8] BUNTER K L，CLOETE S W.Genetic parameters for egg-，chick-and live-weight traits recorded in farmed ostriches(Struthiocamelus)[J].LivestProdSci，2004，91(1)：9-22.

[9] 靳二輝，彭克美，宋 卉，等.非洲雛鴕鳥呼吸器官的形態(tài)學(xué)研究[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28(5)：553-556. JIN E H，PENG K M，SONG H，et al.The morphological observation of the respiratory organs in African ostrich chicks[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2008，28(5)：553-556.(in Chinese)

[10] MAINA J N，NATHANIEL C.A qualitative and quantitative study of the lung of an ostrich，Struthio camelus[J].JExpBiol，2001，204(13)：2313-2330.

[11] CAO J，JIANG L P，ZHANG X M，et al.Boric acid inhibits LPS-induced TNF-α formation through a thiol-dependent mechanism in THP-1 cells[J].JTraceElemMedBio，2008，22(3)：189-195.

[12] MAHABIR S，SPITZ M R，BARRERA S L，et al.Dietary boron and hormone replacement therapy as risk factors for lung cancer in women[J].AmJEpidemiol，2008，167(9)：1070-1080.

[13] 衛(wèi)張蕊，周國鋒，田 瓊.炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子在肺纖維化中作用的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2005，21(suppl)：85-87. WEI Z R，ZHOU G F，TIAN Q.Study progress of influence and related mechanism of cytokines in pulmonary fibrosis[J].JournalofCellularandMolecularImmunology，2005，21(suppl)：85-87.(in Chinese)

[14] WYNN T A.Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis[J].JExpMed，2011，208(7)：1339-1350.

[15] BARRANCO W T，ECKHERT C D.Boric acid inhibits human prostate cancer cell proliferation[J].CancerLett，2004，216(1)：21-29.

[16] CARPER S，ELEGBEDE A，HALL C，et al.Boric acid induces apoptosis in both prostate and breast cancer cell lines[J].CancerRes，2007，67(9 Supplement)：4220(Abstract).

[17] XIAO K，ANSARI A R，REHMAN Z U，et al.Effect of boric acid supplementation of ostrich water on the expression of Foxn11 in thymus[J/OL].HistolHistopathol，2015：11595.[2014-8-17].http：//www.hh.um.es/Articles-Proofs/11-595-manuscript.pdf.

[18] WALTERS D M，CHO H Y，KLEEBERGER S R.Oxidative stress and antioxidants in the pathogenesis of pulmonary fibrosis：a potential role for Nrf2[J].AntioxidRedoxSignal，2008，10(2)：321-332.

[19] THANNICKAL V J，TOEWS G B，WHITE E S，et al.Mechanisms of pulmonary fibrosis[J].AnnuRevMed，2004，55：395-417.

[20] BüHLING F，WILLE A，R?CKEN C，et al.Altered expression of membrane-bound and soluble CD95/Fas contributes to the resistance of fibrotic lung fibroblasts to FasL induced apoptosis[J].RespirRes，2005，6：37.

[21] UHAL B D.Apoptosis in lung fibrosis and repair[J].Chest，2002，122(6suppl)：293S-298S.

[22] 李今朝，李艷杰，李振華，等.實(shí)驗(yàn)性肺纖維化細(xì)胞凋亡及Fas/FasL基因變化[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28(3)：184-187. LI J Z，LI Y J，LI Z H，et al.Cell apoptosis and the changes of Fas/FasL gene in experimental pulmonary fibrosis[J].ChineseJournalofTuberculosisandRespiratoryDiseases，2005，28(3)：184-187.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Effect of Boric Acid on the Morphology of African Ostrich Chicks Lung

TANG Juan1，XIAO Ke1，ZHENG Xin-ting1，ZHU Dai-yun1，WANG Wei1，WANG Jing1，YANG Zhi1，SUN Peng-peng1，WANG Yan-hong2，WANG Xiao-yi2，PENG Ke-mei1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China；2.HenanJinluSpecialLivestockBreedingCo.,LTD.，Zhengzhou450008，China)

The aim of the present study was to detect the effects of boric acid on the morphology of African ostrich chick lung.Twenty-four healthy ostrich chicks were randomly divided into 6 groups：Group A(control group)，B，C，D，E，F(xiàn)，and supplemented with boric acid at the concentration of 0，40，80，160，320，and 640 mg·L-1，respectively.The morphology changes of lung were observed by using light microscope and the HE staining technology，the collagen fiber changes were detected by MASSON staining，and TUNEL methods were used to label the apoptosis cells in ostrich lung.The results were as followings，compared with the control group，when the boric acid dose less than 80 mg·L-1(group A，B，C)，the lung structure was well developed，cell morphology was intact，nucleus was stained darkly and the lung organizational structure was clearly，especially at 80 mg·L-1.Adversely，when boric acid doses higher than 160 mg·L-1(group D，E，F(xiàn))，the high dose boric acid damaged the lung tissue structure，heterophilic granulocytes were increased，the interstitial was thickening with HE staining，especially at 640 mg·L-1.MASSON staining showed that compared with the control group，collagen deposition was increased in high dose boric acid group(more then 320 mg·L-1boric acid).Compared with control group，the IOD of apoptosis cells was significantly decreased in the 40 mg·L-1boric acid group，whereas，the IOD of apoptosis cells was significantly evaluated in the 320 and 640 mg·L-1boric acid groups.Add 40 mg·L-1boric acid can inhibit apoptosis in lung，more than 160 mg·L-1boric acid can promote inflammation，more than 320 mg·L-1boric acid can increase apoptosis and cause pulmonary fibrosis.

pulmonary fibrosis；apoptosis；boric acid；lung；ostrich chicks

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.12.022

2015-01-16

國家自然科學(xué)基金(31272517)

唐 娟(1988-)，女，河南南陽人，碩士生，主要從事動(dòng)物組織學(xué)與胚胎學(xué)研究，E-mail：783443066@qq.com，Tel：027-87286970

*通信作者：彭克美，教授，博導(dǎo)，E-mail：kemeip@163.com

S852.1

A

0366-6964(2015)12-2291-08