烏骨雞黑色素細(xì)胞體外原代培養(yǎng)及鑒定

韓德平，王書祥，張媛媛，楊 祖，李俊英，鄧學(xué)梅

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，畜禽遺傳改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

烏骨雞黑色素細(xì)胞體外原代培養(yǎng)及鑒定

韓德平，王書祥，張媛媛，楊 祖，李俊英，鄧學(xué)梅*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，畜禽遺傳改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

旨在建立烏骨雞黑色素細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定的方法，為研究黑色素細(xì)胞功能提供理想的生物材料。本研究選取烏骨雞腹膜組織，采用DispaseⅡ和胰酶-EDTA混合消化法，經(jīng)嚴(yán)格控制不同培養(yǎng)階段的消化時間，對黑色素細(xì)胞進(jìn)行純化和傳代，獲取了烏骨雞黑色素細(xì)胞。通過觀察各個培養(yǎng)階段的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞生長曲線，表明在專用培養(yǎng)基條件下，細(xì)胞增殖良好。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征、電鏡下的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析、DOPA染色和細(xì)胞免疫化學(xué)染色鑒定，表明所獲得的細(xì)胞符合黑色素細(xì)胞特征。細(xì)胞經(jīng)傳代后培養(yǎng)至第10代，仍保持了正常的生物學(xué)特性，說明所建立的培養(yǎng)體系可以實(shí)現(xiàn)烏骨雞黑色素細(xì)胞體外原代培養(yǎng)。綜上表明，本研究成功建立了烏骨雞黑色素細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系。

烏骨雞；黑色素細(xì)胞；原代培養(yǎng)；鑒定

絲羽烏骨雞是我國珍貴的家禽品種，具有絲羽、烏骨、烏肉等特征[1]，因其傳統(tǒng)的藥用價值而備受關(guān)注[2]。人們普遍認(rèn)為，烏骨雞的藥用價值主要源于其體內(nèi)存在的大量黑色素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞廣泛分布于烏骨雞體內(nèi)各組織器官，黑色素細(xì)胞分布和黑色素的合成在不同日齡的組織內(nèi)存在差異，在氣管、肺、睪丸、卵巢以及嗉囊等組織，黑度隨日齡增長而逐漸加深；而腿肌和胸肌等組織的黑度卻隨著日齡增長而逐漸變淺[4]。骨膜和腹膜等結(jié)締組織，無論在胚胎期還是生長發(fā)育期，都表現(xiàn)為大量的黑色素沉積。因此，選取骨膜和腹膜用于黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)，是較好的選擇。

黑色素細(xì)胞是黑色素的產(chǎn)生來源，完全分化的成熟黑色素細(xì)胞是一種帶有許多長突起的伸長細(xì)胞[5]。烏骨雞黑色素可以延長果蠅壽命，并有增強(qiáng)果蠅排鉛解毒的能力[6]。人皮膚內(nèi)黑色素合成過程中的副產(chǎn)物對細(xì)菌具有氧化殺傷作用[7-8]。在炎癥條件下，皮膚角質(zhì)細(xì)胞和白細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)會促進(jìn)黑色素細(xì)胞合成黑色素和形成更多細(xì)胞突起[9-10]。除作為黑色素的合成場所以外，黑色素細(xì)胞還具有許多重要的功能。有研究表明，黑色素細(xì)胞在維持組織結(jié)構(gòu)和損傷后免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，組織損傷的局部環(huán)境會直接誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞遷移至損傷部位[11]。在斑馬魚損傷試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，早期遷移的免疫細(xì)胞通過釋放信號分子，誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞遷移至損傷部位，進(jìn)一步通過細(xì)胞突起包裹外來物質(zhì)[12]。另有資料報(bào)道，位于人內(nèi)耳紋狀體內(nèi)的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞，會通過調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響血管屏障的完整性，從而造成聽覺障礙[13]。黑色素細(xì)胞的功能是多樣的，其作用機(jī)制值得深入探討。

烏骨雞作為黑色素細(xì)胞及黑色素極為豐富的自然突變體，已成為相關(guān)功能研究的重要模型。目前，針對烏骨雞黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法雖有報(bào)道，但其培養(yǎng)效率還不夠理想。本研究旨在建立烏骨雞原代黑色素細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系，為研究烏骨雞黑色素細(xì)胞生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

20胚齡烏骨雞胚胎來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀觥：谏丶?xì)胞培養(yǎng)基主要成分為人黑色素細(xì)胞生長添加物(HMGS，Gbico)，其中含有牛垂體提取物、胎牛血清、牛胰島素、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白、基本成纖維細(xì)胞生長因子、氫化可的松、肝素、佛波醇酯。

1.2 方法

1.2.1 黑色素細(xì)胞的原代分離培養(yǎng) 取孵化20 d的烏骨雞蛋，酒精擦拭蛋殼表面，經(jīng)紫外線照射消毒30 min。沿氣室一側(cè)敲破蛋殼，取出雞胚，無菌剪取腹膜。經(jīng)滅菌生理鹽水清洗后，置于Medium 254(Gibco)中，用眼科剪剪碎組織。置于15 mL離心管中，加入適量蛋白酶(Dispase) Ⅱ酶(Roche)和胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(Gibco)，37 ℃消化15 min，加入胎牛血清，終止消化，反復(fù)吹打后經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾。1 000 r·min-1離心10 min，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。1 000 r·min-1離心10 min，加入含HMGS的新鮮培養(yǎng)基混勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞，以2×105mL-1接種于細(xì)胞瓶中。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后吸棄培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞和上清，以后每2 d換液1次。

1.2.2 黑色素細(xì)胞純化與傳代培養(yǎng) 觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長狀況，至細(xì)胞達(dá)70%融合時，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液(Gibco)37 ℃消化7～10 min，鏡下觀察細(xì)胞消化狀態(tài)。棄去消化液，加入滅菌PBS清洗后棄掉。再加入新鮮消化液消化5 min，棄掉消化液，此時只有含黑色素的細(xì)胞仍然貼壁細(xì)胞瓶，加入含人黑色素細(xì)胞生長添加物(HMGS，Gbico)的新鮮培養(yǎng)基Medium 254，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。消化培養(yǎng)3次即可得到純的黑色素細(xì)胞。傳代培養(yǎng)時消化時間為10 min，1個25 mL細(xì)胞瓶傳代2個25 mL細(xì)胞瓶。

1.2.3 黑色素細(xì)胞生長率的測定 取處于對數(shù)生長期的黑色素細(xì)胞，0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104mL-1，按200 μL每孔接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從接種24 h開始，每日隨機(jī)取3個孔做細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)比色試驗(yàn)，計(jì)算平均值，共計(jì)數(shù)14 d，未計(jì)數(shù)細(xì)胞每2 d換液1次。加入100 μL 10% CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，自動酶標(biāo)儀450 nm波長測吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4 RT-PCR及序列測定 取培養(yǎng)至第5代的細(xì)胞，接種于6孔板中，加入生長培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%融合后，利用細(xì)胞RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA，根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank公布的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物(Primer Premier 5.0軟件)，引物由北京生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。鑒定引物擴(kuò)增特異性時，設(shè)置陰性對照，此時不加cDNA模板，其它條件一致。PCR產(chǎn)物由華大基因公司測序鑒定。

1.2.5 抗Microphthalmia(MITF)免疫細(xì)胞化學(xué)染色 取第5代處于對數(shù)生長期的黑色素細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105mL-1，接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室溫固定20 min。0.1% Triton X-100室溫處理10 min，PBS洗2次。山羊血清封閉液室溫作用20 min，吸棄封閉液，加入抗MITF(1∶2 000，Abcam)抗體,37 ℃作用1 h，PBS清洗3次。加入HRP標(biāo)記抗小鼠二抗(1∶1 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫作用1 h，PBS清洗3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫避光顯色5 min。水溶性封片劑封片后，置于倒置顯微鏡下觀察。陰性對照染色時用PBS替代一抗，經(jīng)二抗作用后，DAB顯色觀察。

表1 引物序列

Table 1 Information of primer sequence for the genes

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence擴(kuò)增片段長度/bpProductsizeMITFF:TGTCCCTTGTTCCATCC,R:ACATTTCCGAGGTTGTCAC204TYRF:TCAAGGACCCCAAGACTCCC,R:CGGAAGCTGTAATTGGCCATT106TRP-1F:GCTAAGAAGGTATTCGGCT,R:AGTGAGAAGAGGCTGATGC376KITF:CATCGGTGCCATCCTTTGAG,R:CTTGTCACCATTGCTGGATGC110

1.2.6 多巴染色鑒定 取第5代處于對數(shù)生長期的黑色素細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105mL-1，接種于6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛液室溫固定20 min。PBS清洗后，加入3，4-二羥基-L-苯丙氨酸孵育液(DOPA，Sigma-Aldrich；1L PBS中含1.104 g DOPA)，37 ℃孵育30 min。更換新的DOPA孵育液，直至孵育液顏色變色后終止反應(yīng)。甘油封片后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 透射電鏡觀察 取長滿至80%的第5代細(xì)胞，用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心10 min。加入PBS，混勻重懸細(xì)胞，1 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)1次。最后離心成細(xì)胞團(tuán)塊，加入2.5%戊二醛固定后，送至中國農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡室進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 烏骨雞體內(nèi)黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)與形態(tài)觀察

由于采用腹膜分離黑色素細(xì)胞，所以培養(yǎng)上清中含有較多脂肪，12 h后棄掉上清和未貼壁的細(xì)胞。12 h時黑色素細(xì)胞已出現(xiàn)明顯突起，24 h時細(xì)胞基本完全貼壁(圖1A)，細(xì)胞傳代過程中采用控制不同的消化時間去除雜細(xì)胞的方法，瓶內(nèi)只留貼壁黑色素細(xì)胞(圖1B)；繼續(xù)培養(yǎng)至9 d，黑色素細(xì)胞形成明顯多個突起，胞質(zhì)內(nèi)未見明顯黑色素(圖1C)；培養(yǎng)至10 d，細(xì)胞數(shù)量和突起進(jìn)一步增多(圖1D)，部分黑色素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見明顯的黑色素沉積(圖1E)，并形成交聯(lián)(圖1F)。

2.2 黑色素細(xì)胞生長曲線測定

經(jīng)檢測，體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞前期生長緩慢，從第7天開始細(xì)胞生長迅速，出現(xiàn)指數(shù)增長，至10 d細(xì)胞增長緩慢，出現(xiàn)停滯期(圖2)，此時，合成的黑色素明顯增多。

2.3 黑色素合成相關(guān)基因檢測

黑色素細(xì)胞經(jīng)純化培養(yǎng)后，傳至第10代，進(jìn)行MITF、TYR、TRP-1和KIT基因表達(dá)檢測。RT-PCR結(jié)果顯示4種基因均有特異性擴(kuò)增條帶(圖3)，細(xì)胞正常生長。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果通過比對，為目的基因的核苷酸序列，表明擴(kuò)增基因確實(shí)在細(xì)胞中有表達(dá)。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

取第5代處于對數(shù)生長期的黑色素細(xì)胞進(jìn)行觀察，此時，并不是所有黑色素細(xì)胞均可見明顯黑色素沉積。因此，通過MITF免疫細(xì)胞染色鑒定黑色素細(xì)胞。圖4A中可見，MITF染色后陽性信號位于黑色素細(xì)胞的胞核部分。而圖4B可見，陰性對照染色時(不加一抗)，肉眼觀察僅有不足半數(shù)的黑色素細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯的黑色素顆粒。由此說明，黑色素細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)，已大量增殖。但由于不同生長階段的黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素合成狀態(tài)亦有不同，不能單純依據(jù)黑色素顆粒來判定細(xì)胞特性。

2.5 多巴染色

由于黑色素細(xì)胞含有大量酪氨酸酶，能夠氧化多巴形成黑色物質(zhì)，因此通過多巴染色可以鑒定黑色素細(xì)胞特性。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)傳代的培養(yǎng)細(xì)胞用多巴染色后，均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。黑色素細(xì)胞突起明顯，可以明顯觀察到胞漿內(nèi)含有大量均質(zhì)染色的黑色物質(zhì)(圖5)。

A.培養(yǎng)24 h；B.消化傳代后；C.傳代培養(yǎng)9 d；D.傳代培養(yǎng)10 d；E.明顯黑色素沉積；F.黑色素細(xì)胞形成交聯(lián)。箭頭指示黑色素細(xì)胞。標(biāo)尺：50 μmA.Culture after 24 h；B.Digestion and passage；C.Passage on day 9；D.Passage on day 10；E.Obvious accumulation of melanin；F.Close contact of melanocytes.The arrows indicate the melanocytes.Bar：50 μm圖1 體外培養(yǎng)烏骨雞黑色素細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The morphology of cultured melanocytes from Silky Fowl

圖2 烏骨雞黑色素細(xì)胞生長曲線Fig.2 The growth curve of cultured melanocytes from Silky Fowl

2.6 透射電鏡觀察

收集黑色素細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡觀察，見圖6。結(jié)果顯示，黑色素細(xì)胞的胞漿內(nèi)可見各種不同階段的黑色素小體形成過程。說明，分離培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的黑色物質(zhì)是黑色素，成功實(shí)現(xiàn)黑色素細(xì)胞分離培養(yǎng)。

1.TRP-1基因；2.TRP-1陰性對照；3.KIT基因；4. KIT基因陰性對照；5.MITF基因；6.MITF基因陰性對照；7.TYR基因；8.TYR基因陰性對照；M.DM2000 plus marker1.TRP-1 gene；2.TRP-1 negative；3.KIT gene；4.KIT negative；5.MITF gene；6.MITF Negative；7.TYR gene；8.TYR negative；M.DM2000 plus marker圖3 MITF、TYR、TRP-1和KIT基因RT-PCR檢測Fig.3 Detection of MITF，TYR，TRP-1 and KIT genes by RT-PCR

3 討 論

3.1 烏骨雞黑色素細(xì)胞體外分離培養(yǎng)條件優(yōu)化

人類及其它動物黑色素細(xì)胞分離培養(yǎng)由來已久，但是皮膚組織是目前分離培養(yǎng)的主要選擇。研究發(fā)現(xiàn)，通過0.25% 胰酶消化人包皮組織，可以成功分離到黑色素細(xì)胞，但需要14 d細(xì)胞才能全部長滿[14-15]。對于新生豬皮膚，通過0.25% 胰酶消化，3周后黑色素細(xì)胞長滿融合[16]。白瑞等[17]通過分離培養(yǎng)羊駝皮膚黑色素細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)利用0.2% Dispase和0.25%胰酶-0.02% EDTA兩步消化法是分離有毛皮膚黑色素細(xì)胞的最佳方法，既可以減少對細(xì)胞的損傷，又可以提高細(xì)胞的分離純度，縮短試驗(yàn)操作時間。烏骨雞黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)少見報(bào)道，僅見于皮膚組織分離培養(yǎng)[18]。由于烏骨雞黑色素細(xì)胞位于皮膚的真皮層，細(xì)胞成分相對復(fù)雜，加大了分離培養(yǎng)的難度[19]。而烏骨雞黑色素細(xì)胞多位于結(jié)締組織，腹膜內(nèi)黑色素細(xì)胞較為豐富[20]。并且相對于皮膚而言，腹膜內(nèi)細(xì)胞成分較為簡單。本研究選取雞胚胎期腹膜組織分離黑色素細(xì)胞，原因主要是烏骨雞雞胚在蛋殼內(nèi)，未接觸外界環(huán)境，細(xì)菌污染少。結(jié)果表明，烏骨雞胚胎期的腹膜組織特別適合于原代黑色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)，培養(yǎng)條件經(jīng)優(yōu)化后培養(yǎng)9 d即可獲得大量黑色素細(xì)胞，并保持其生物學(xué)特性。

A.MITF免疫細(xì)胞化學(xué)染色；箭頭指示陽性細(xì)胞；B.陰性對照?？招募^.胞漿內(nèi)可見明顯黑色素，實(shí)心箭頭.胞漿內(nèi)未見黑色素。標(biāo)尺：50 μmA.Immunocytochemical stain of MITF.The arrows indicate positive cells；B.Negative control.Feint arrow indicates obvious melanin is observed in the cytoplasm，solid arrow indicates no melanin is observed in the cytoplasm.Bar：50 μm圖4 黑色素細(xì)胞MITF免疫細(xì)胞化學(xué)染色Fig.4 Immunocytochemical stain of MITF in melanocytes

箭頭指示黑色素細(xì)胞內(nèi)多巴反應(yīng)陽性信號。標(biāo)尺：50 μmThe arrows indicate the DOPA positive signals in melanocytes.Bar：50 μm圖5 多巴染色顯示黑色素細(xì)胞Fig.5 Observation of melanocytes using DOPA stain

箭頭指示黑色素細(xì)胞內(nèi)不同階段的黑色素小體The arrows indicate the different stages of melanosomes in melanocytes圖6 黑色素細(xì)胞透射電鏡觀察Fig.6 Observation of melanocytes by transmission electron microscope

先期分離試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純的0.25% 胰酶-0.02% EDTA消化需要較長時間，增加了細(xì)胞損傷程度，而且分離到的黑色素細(xì)胞數(shù)量較少。后選用0.2% Dispase和0.25% 胰酶-0.02% EDTA聯(lián)合消化法，同時將兩種消化酶加入到剪碎組織中，縮短了消化時間，減少長時間消化對細(xì)胞的損傷，分離到的黑色素細(xì)胞數(shù)量多，培養(yǎng)效果好。

純化細(xì)胞時，多根據(jù)黑色素細(xì)胞和其它細(xì)胞的貼壁時間和消化時間的不同，通過控制時間差來純化細(xì)胞。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的貼壁時間相似，所以很難通過控制貼壁時間來消除成纖維細(xì)胞。但是由于黑色素細(xì)胞貼壁牢固，可以通過控制消化時間來分離黑色素細(xì)胞與雜細(xì)胞。雜細(xì)胞首先會被消化下來，通過棄上清后可以清除成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞。本研究在消化雜細(xì)胞后，直接將完全培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)瓶中，不再進(jìn)一步消化黑色素細(xì)胞，可以減少胰酶對細(xì)胞的消化損傷，黑色素細(xì)胞可以快速長滿融合。

3.2 黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇

原代黑色素細(xì)胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基極其嚴(yán)格。劉源等[21]培養(yǎng)人黑色素細(xì)胞時，研究發(fā)現(xiàn)加入佛波酯(TPA)和胎牛血清的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM)內(nèi)，黑色素細(xì)胞生長旺盛，優(yōu)于加入TPA、霍亂毒素(CT)、磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)和谷氨酰胺的DMEM和F12混合培養(yǎng)基。TPA可以活化蛋白激酶C，通過ADG/PKC信號途徑刺激黑色素細(xì)胞增殖。而TPA作為一種致癌劑，存在很大安全風(fēng)險，同時也會限制某些色素性疾病的研究?；魜y毒素是神經(jīng)毒素，可活化腺苷酸環(huán)化酶，通過cAMP/PKA途徑刺激黑色素細(xì)胞增殖。白瑞等[17]通過采用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、CT、氫化可的松、胰島素和慶大霉素后，羊駝皮膚黑色素細(xì)胞生長良好。bFGF是天然有絲分裂原，可活化酪氨酸激酶，經(jīng)受體介導(dǎo)活化MAKP通路，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。胰島素通過受體酪氨酸激酶途徑，可以促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成代謝。本研究先前采用DMAM和F12混合培養(yǎng)基，加入HEPES、bFGF、氫化可的松、胰島素、TPA和胎牛血清，可以維持黑色素細(xì)胞生長，但是生長周期較慢。后選用原代黑色素細(xì)胞專用培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分與之前相比，多加入牛垂體提取物、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和肝素，此時細(xì)胞增殖周期有所縮短，生長狀態(tài)較好。所以正確選擇培養(yǎng)基也是黑色素細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

3.3 黑色素合成相關(guān)基因正常表達(dá)

烏骨雞體內(nèi)的黑色素主要為真黑色素，其合成是一個復(fù)雜的生化反應(yīng)過程。體內(nèi)的酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)的作用下氧化成多巴，TYR進(jìn)一步將多巴氧化為多巴醌，多巴醌環(huán)化生成多巴色素，后經(jīng)多巴色素異構(gòu)酶(TRP)的作用生成5，6-二羥基吲哚羧酸，最后在氧化酶的作用下生成真黑色素[22]。所以TYR和TRP是黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)水平可以反映黑色素細(xì)胞的生理狀態(tài)。

烏骨雞體內(nèi)的黑色素細(xì)胞來自于神經(jīng)嵴細(xì)胞，神經(jīng)嵴細(xì)胞經(jīng)腹側(cè)和背側(cè)遷移過程發(fā)育為成黑色素細(xì)胞。成黑色素細(xì)胞進(jìn)一步在皮膚和內(nèi)臟組織形成黑色素細(xì)胞，并產(chǎn)生黑色素。KIT基因被認(rèn)為表達(dá)于成黑色素細(xì)胞，作為一種受體，通過與周圍環(huán)境表達(dá)的干細(xì)胞因子(SCF)配體作用，調(diào)控細(xì)胞的存活[23]。而MITF基因是促進(jìn)成黑色素細(xì)胞特化的首要轉(zhuǎn)錄因子，目前被認(rèn)為是最主要的調(diào)控基因[24]。研究表明，在烏骨雞胚胎發(fā)育早期，這幾種基因表達(dá)上調(diào)，對于黑色素細(xì)胞遷移和存活具有重要意義[25]。

本研究培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞內(nèi)，既檢測到黑色素合成基因的表達(dá)，也檢測到與成黑色素細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，說明培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞完全具有增殖和合成黑色素的活性，適合進(jìn)行體外黑色素細(xì)胞的相關(guān)功能研究。

3.4 烏骨雞黑色素細(xì)胞生物學(xué)特性分析

本試驗(yàn)在黑色素細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過控制消化時間，成功分離到胞漿內(nèi)含有黑色素的細(xì)胞。繼而通過傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步純化黑色素細(xì)胞。觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞與組織內(nèi)觀察到的細(xì)胞形態(tài)基本一致，都是具有長突起的樹突樣細(xì)胞。

體內(nèi)試驗(yàn)認(rèn)為，MITF基因作為關(guān)鍵基因，與多個基因存在直接關(guān)聯(lián)，其中Sox10和Pax3可調(diào)控MITF的表達(dá)，而TRP1、TRP2、TYR、EDNRB、EDN3基因也受MITF調(diào)控，所以其表達(dá)水平可以反應(yīng)細(xì)胞的活性狀態(tài)[26]。由于MITF可通過調(diào)控酪氨酸基因家族啟動子，進(jìn)而影響酪氨酸基因的表達(dá)，影響黑色素的合成，所以在體外細(xì)胞培養(yǎng)時檢測其表達(dá)水平，可以在一定程度上鑒定細(xì)胞特性。本研究通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞胞核內(nèi)MITF蛋白的高表達(dá)。與此時黑色素細(xì)胞增殖旺盛，黑色素合成較多有關(guān)。本研究結(jié)果與之前報(bào)道豬皮膚黑素細(xì)胞和羊駝皮膚黑色素細(xì)胞的MITF表達(dá)位置相一致[16-17]。所以，通過檢測MITF蛋白的表達(dá)，可以在一定程度上鑒定黑色素細(xì)胞，并且指示黑色素細(xì)胞的活性狀態(tài)。

電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，分離培養(yǎng)的細(xì)胞是黑色素細(xì)胞，胞漿內(nèi)可觀察到不同階段黑色素小體的形成過程。而且，利用黑色素細(xì)胞含有的酪氨酸酶能夠氧化多巴形成黑色反應(yīng)物質(zhì)的特性，進(jìn)行了多巴染色，發(fā)現(xiàn)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)明顯黑色物質(zhì)，培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞具有明顯的突起，符合烏骨雞黑色素細(xì)胞的特征。由于黑色素顆粒不需多巴染色即可呈現(xiàn)，未經(jīng)多巴染色時，可觀察到部分細(xì)胞胞漿內(nèi)有明顯的黑色素沉積，而大部分細(xì)胞的胞漿內(nèi)未見明顯黑色素顆粒。經(jīng)多巴染色后，所有細(xì)胞均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。說明體外培養(yǎng)的黑色素細(xì)胞處于不同的黑色素合成狀態(tài)，或無外界刺激時，并不一定合成黑色素，進(jìn)一步成熟或出現(xiàn)外界刺激時，可增加黑色素的合成。

4 結(jié) 論

本研究通過選取胚胎腹膜和專用培養(yǎng)基，利用消化時間差異成功建立了烏骨雞黑色素細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系。并經(jīng)細(xì)胞形態(tài)和黑色素小體觀察，多巴反應(yīng)、MITF蛋白和黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)等檢測，進(jìn)一步確定了細(xì)胞的生物學(xué)特性，為今后研究黑色素細(xì)胞功能奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 程金華)

Culture and Identification of Primary Melanocytes from Silky Fowlinvitro

HAN De-ping，WANG Shu-xiang，ZHANG Yuan-yuan，YANG Zu，LI Jun-ying，DENG Xue-mei*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The purpose of this study was to establish a method for melanocytes culture and identification systeminvitro，and to provide an ideal biological material for investigating the melanocytes functions.Peritoneum of Silky Fowl was collected and digested by dispaseⅡ and trypsin-EDTA mixed digestive solution under different digestive time.The pure melanocytes were obtained after continuous passages.Through the observation of cell morphology and cell growth curve showed that the primary melanocytes grew well under the specific medium.The cell specificities were further confirmed by the morphology，ultrastructure observation under electron transmission microscope，genes expression associated with melanin synthesis，and cell characteristic by DOPA stain and immunocytochemistry.The successfully cultured melanocytes sustained the normal biological characteristics on passage 10 demonstrating that the culture of primary melanocytes was accomplished under thisinvitrosystem.All together，theinvitroculture system of melanocytes from Silky Fowl was successfully established in our study.

Silky Fowl；melanocyte；primary culture；identification

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.010

2014-10-30

國家自然科學(xué)基金(31472082)；國家863計(jì)劃(2013AA102501)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2014BH003)

韓德平(1984-)，男，山東濰坊人，博士，主要從事組織胚胎學(xué)的研究，E-mail：handeping1984@163.com

*通信作者：鄧學(xué)梅，E-mail：deng@cau.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2015)06-0949-08