無患子皂素無水乙醇提取工藝及提純方法比較研究

楊鶴群，菅紅磊，朱莉偉，孫達峰，張衛(wèi)明，蔣建新*

(1.北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程中心，北京 100083;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

無患子皂素無水乙醇提取工藝及提純方法比較研究

楊鶴群1，菅紅磊1，朱莉偉1，孫達峰2，張衛(wèi)明2，蔣建新1*

(1.北京林業(yè)大學材料科學與技術(shù)學院，林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程中心，北京 100083;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

采用無水乙醇對無患子果皮中的皂素進行提取分離。提取工藝研究表明，當固液比為1:6，在50 ℃，150 r/min搖床中提取6 h后，無患子皂素的得率為37.5%。通過向提取液中分別加入丙酮和無水乙醚可將皂素析出分離，皂素得率分別為17.9%和32.0%。丙酮析出分離出的皂素得率較低，但疏松潔白，顆粒較細，純度為90.5%。無水乙醚析出分離的皂素顏色微黃，顆粒較大，純度為84.7%，得率高達85.3%，是理想的無患子皂素提純?nèi)軇?/p>

無患子皂素；提??；無水乙醇；提純；丙酮；乙醚

無患子(SapindusmukurossiGaertn.)又名木患子、油患子、苦患樹、黃目樹等，屬無患子科(Sapindaceae)，為落葉大喬木，高可達20余米，樹皮灰褐色或黑褐色，主要分布于我國東部、南部至西南部，各地寺廟、庭園和村邊常見栽培。日本、朝鮮、中南半島和印度等地也常栽培。核果肉質(zhì)，果的發(fā)育分果爿近球形，直徑2～2.5 cm，橙黃色，干時變黑。種子球形，黑色，堅硬。根和果入藥，具有清熱解毒、化痰止咳的功能；果皮中含有皂素，可代替肥皂作洗滌之用，尤宜于絲質(zhì)品之洗滌；木材質(zhì)軟，邊材黃白色，心材黃褐色，可做箱板和木梳等[1]。

無患子皂素為非離子型表面活性劑，具有很強的表面活性，由于其具備良好的去污能力和起泡性且對人體無毒害，可用于天然洗發(fā)香波及各種洗護品中[2-3]。皂素存在于很多植物中，有關皂苷抑菌作用的報道很多，彭茜等研究發(fā)現(xiàn)皂莢皂苷在較低的質(zhì)量濃度(16～64 g/L)下對細菌的生長能起到一定的抑制作用，且抑菌活性與質(zhì)量濃度呈正相關；茶皂苷在質(zhì)量濃度為16 g/L的時候?qū)ζ【平湍妇袣缱饔肹4]。研究表明，無患子皂素屬于齊墩果烷型三萜皂素類[5-7]，具有抗菌、殺菌和消炎功效，因此可被用于殺菌劑和殺蟲劑[8-10]。此外，Upadhyay和Singh研究了無患子果粉的殺螺活性，結(jié)果表明無患子果粉的乙醇萃取物的殺螺活性遠遠要高于其他有機溶劑萃取物，并且證明了其中的殺螺有效成分為皂素和鞣酸[11]。Chen等的研究結(jié)果表明無患子種子提取物對黑色素瘤和肺細胞系的增殖擴散具有特異性抑制作用[12]。無患子皂素作為一種天然表面活性劑，還可以大大減弱木質(zhì)素對纖維素酶的抑制作用，在高底物濃度條件下利用生物質(zhì)發(fā)酵制備乙醇時起著重要作用[13]。

本文采用無水乙醇作為提取溶劑，對無患子果皮中皂素的提取及分離純化工藝進行了研究，該工藝操作步驟簡單，產(chǎn)品易于分離，為天然無患子皂素的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無患子果，產(chǎn)地福建，剝殼及粉碎后過20目篩，得到無患子果皮粉，干燥密封保存。香草醛，濃硫酸，無水乙醇，無水乙醚，丙酮均為分析純，主要儀器UV-2102C 型紫外可見分光光度計，尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無患子皂素定量方法的建立

本實驗中無患子皂素的定量采用香草醛-濃硫酸顯色法[14]。香草醛-濃硫酸與皂苷反應形成特征的紅色，是最廣泛采用的皂素顯色法，反應機理是使羧基脫水，增加雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合反應生成共軛雙鍵系統(tǒng)，又在酸作用下形成陽碳離子鹽而顯色。香草醛-濃硫酸顯色劑是一種廣譜性顯色劑，很多物質(zhì)如醇類、酚類、有機酸、揮發(fā)油、甾體、萜類等都可以顯色。由于香草醛-濃硫酸顯色劑并不是皂素的特異顯色劑，乙醇和丙酮均可與香草醛-濃硫酸顯色劑發(fā)生顯色反應，而且顯色比皂素明顯，因此使用此方法定量，一定要保證操作的統(tǒng)一性，否則誤差非常大。

1.2.1.1 溶液的配制

標準樣品溶液：精確稱取經(jīng)干燥恒重的標準樣品25 mg，溶解于體積濃度為50%乙醇中，置于25 mL容量瓶中定容，得到濃度為1 mg/mL的皂素標準溶液，搖勻備用。

香草醛溶液：0.8 g香草醛溶于10 mL無水乙醇，得到濃度為8 %的香草醛溶液。

硫酸溶液：77 mL質(zhì)量分數(shù)95%硫酸加到23 mL去離子水中，得到體積濃度為77%的硫酸。

1.2.1.2 最大吸收波長的確定

取標準樣品溶液0.5 mL，準確加入8%香草醛溶液0.5 mL，于冰水浴中加入77%硫酸液4 mL，搖勻，于60 ℃水浴加熱15 min，然后置于冰水浴中冷卻10 min，室溫下以試劑為空白，用l cm比色皿在紫外-可見分光光度計上進行波長掃描，得出無患子皂素的最大吸收波長。

1.2.1.3 標準曲線的繪制

分別取標準樣品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于具塞試管中，并加水至溶液體積為0.5 mL，按1.2.1.2中加入香草醛-濃硫酸顯色劑反應后，在最大吸收波長下測定其吸光度，并以吸光度對濃度繪制標準曲線。

1.2.2 皂素的提取工藝

1.2.2.1 乙醇濃度的影響

稱取約10 g的無患子果皮粉，以固液比1 ∶6分別加入濃度為0、45、75和100%的乙醇水溶液，在50 ℃，150 r/min搖床中提取6 h，使用香草醛-濃硫酸顯色法測定提取液中的皂素含量。

1.2.2.2 固液比的影響

稱取約10 g的無患子果皮粉，分別以固液比1 ∶2、1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶15加入無水乙醇，在50 ℃，150 r/min搖床中提取6 h，使用香草醛-濃硫酸顯色法測定提取液中的皂素含量。

1.2.2.3 反應時間的影響

稱取約10 g的無患子果皮粉，以固液比1:6加入60 mL無水乙醇，在50 ℃，150 r/min搖床中提取，反應過程中使用香草醛-濃硫酸顯色法測定提取液中的皂素含量，得到皂素提取率隨時間的變化曲線。

1.2.2.4 反應溫度的影響

稱取約10 g的無患子果皮粉，以固液比1 ∶6加入無水乙醇，分別在40、50、60和70 ℃，150 r/min搖床中提取6 h，使用香草醛-濃硫酸顯色法測定提取液中的皂素含量。

1.2.3 皂素提純

1.2.3.1 丙酮析出法

將上述無水乙醇提取液過濾除掉固體殘渣后，分別加入1、2、3、5、10倍體積的丙酮，經(jīng)3000 r/min離心15 min后，倒掉上清液，丙酮和乙醚依次洗滌，得到丙酮提純皂素，80 ℃烘干后稱重，計算得率。

1.2.3.2 無水乙醚析出法

將上述無水乙醇提取液過濾除掉固體殘渣后，分別加入1、2、3、5、10倍體積的無水乙醚，經(jīng)3000 r/min離心15 min后，倒掉上清液，乙醚洗滌，得到乙醚提純皂素，80 ℃烘干后稱重，計算得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 無患子皂素定量方法的建立

如圖1所示，無患子皂素與香草醛-濃硫酸反應后在459 nm處有最大吸收。在459 nm下測得無患子皂素的定量標準曲線(見圖2)，方程為y=1.030 8x-0.022 7，

式中：y—皂素經(jīng)香草醛-濃硫酸顯色后在459 nm下的吸光度；x—溶液中的皂素濃度，mg/mL。

皂素得率通過以下公式進行計算：

式中：A—吸光度；N—稀釋倍數(shù)；V—樣品溶液的總體積，mL；m—溶液中原料質(zhì)量，mg。

圖1 無患子皂素標準溶液的紫外吸收光譜圖

2.2 無患子皂素的提取工藝

2.2.1 乙醇濃度對皂素得率的影響

如圖3所示，皂素的得率隨乙醇濃度的上升而下降，在水溶液中，無患子皂素的提取得率高達46.9%，而在無水乙醇中無患子皂素的得率為37.5%。乙醇濃度越低，皂素提取液的顏色越深，25%乙醇溶液和水的皂素提取液呈乳濁液狀， 這可能是由于固體殘渣在水中有潤脹性，吸水后固體顆粒膨脹體積增大，在水中懸浮不會沉降下來。皂素提取液經(jīng)過濾除去固體殘渣后，分別加入5倍溶液體積的丙酮，只有無水乙醇提取液中的皂素可以沉淀析出，其他含水體系的皂素溶液在加入丙酮變?yōu)槿闈嵋籂?，無沉淀析出。無患子皂素中含有-COOH、糖苷鍵和多個-OH，屬于中等極性至弱極性物質(zhì)[15-16]，強極性的水可將無患子果皮中的強極性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸、果膠等浸出，由此可得，雖然無患子皂素在水溶液中的提取得率較高，但是分離純化較困難，所以選擇無水乙醇作為無患子皂素的提取溶劑。

圖2 無患子皂素定量標準曲線

圖3 乙醇濃度對無患子皂素得率的影響

2.2.2 固液比對皂素得率的影響

如圖4所示，皂素得率隨固液比的增加而升高，當固液比增加至1 ∶6時，繼續(xù)提高固液比對皂素得率的增幅不大。溶劑的用量越大，有效成分從固相傳遞到液相的推動力越大，傳質(zhì)速率愈快；當溶劑用量達到物料充分浸潤時，繼續(xù)增加溶劑用量對分離效果影響不大，因此確定固液比為1 ∶6。

2.2.3 提取時間對皂素得率的影響

如圖5所示，皂素得率隨提取時間的增加而升高，6小時后皂素得率增加不明顯。增加提取時間有利于組分從固相擴散到液相，當提取時間達到一定值后萃取達到平衡，繼續(xù)延長提取時間，無患子水提液中的生物堿、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、糖等雜質(zhì)溶解量加大，反而不利于分離，因此確定提取時間為6h。

圖4 固液比對無患子皂素得率的影響

圖5 提取時間對無患子皂素得率的影響

2.2.4 反應溫度對皂素得率的影響

圖6 提取溫度對無患子皂素得率的影響

如圖6所示，提取溫度越高，皂素的得率越高，皂素得率與溫度之間的關系接近線性。隨提取溫度升高，溶劑的粘度降低，這有利于組分的擴散，但與此同時，糖類、蛋白質(zhì)、果膠等雜質(zhì)會溶出，這將增加后處理分離的難度；若提取溫度過高，無患子皂素將會發(fā)生水解變性，生成副產(chǎn)物，所以提取操作溫度對分離效果的影響較大。另外，隨提取溫度升高，乙醇的揮發(fā)速率會增加，需要增加揮發(fā)溶劑的冷凝回收裝置，因此選擇在50 ℃下提取無患子皂素。

2.3 無患子皂素提純

如圖7所示，在皂素提取液中加入不同體積的丙酮或無水乙醚將皂素沉淀析出。隨丙酮的加入量增加，沉淀顏色由淡黃變得潔白，當加入2倍體積的丙酮后，皂素沉淀得率最高可達17.9%，皂素純度為90.5%，再繼續(xù)提高丙酮的加入量，皂素得率反而出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為丙酮加入量大于2倍溶液體積后，沉淀變得細微疏松，顏色潔白，皂素的純度較高。隨無水乙醚的加入量增加，皂素沉淀量增加，當加入10倍體積的無水乙醚時，皂素沉淀得率可達32.0%，而無水乙醇提取時香草醛-濃硫酸顯色法測得的溶液中皂素得率為37.5%，因此無水乙醚對無患子皂素的沉淀率高達85.3%，所得皂素純度為84.7%，是比較理想的皂素提純分離方法。

圖7 丙酮和無水乙醚對無患子皂素沉淀分離的影響

溶劑按極性排列為：乙醇>丙酮>乙醚，無患子皂素為中等極性至弱極性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，在皂素的乙醇提取液中加入極性較弱的丙酮和非極性的乙醚后，由于皂素的溶解度下降而析出。非極性的無水乙醚會使皂素迅速沉淀析出，因此沉淀易結(jié)團，沉淀顆粒較大，呈微黃色，但是得率較高。加入極性較弱的丙酮后，會使部分中等極性的皂素析出，沉淀疏松潔白，呈絮狀，但是得率較低，在加入過多丙酮后，體系會轉(zhuǎn)變?yōu)槿闋罘稚Ⅲw。

3 結(jié) 論

本文對無患子皂素的提取提純方法進行了研究。研究表明，水提取無患子皂素的得率較高，但是皂素在水溶液中分離困難，因此選用無水乙醇作為提取溶劑。在50 ℃、固液比1 ∶6、搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下，用無水乙醇作為溶劑提取6h后，無患子皂素的得率為37.5%。無患子皂素從無水乙醇提取液中自然結(jié)晶困難，采用溶劑丙酮和無水乙醚將皂素沉淀析出可以得到純度較高的皂素產(chǎn)品。當在皂素提取液中加入10倍體積的無水乙醚后，雖然所得沉淀顏色微黃，易結(jié)團，顆粒較大，皂素得率為32.0%，沉淀率高達85.3%，因此無水乙醚是比較理想的無患子皂素沉淀劑。丙酮沉淀出的皂素純度較高，疏松潔白，顆粒較細，但是得率較低僅為17.9%。

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Ethanol Extraction and Purification of Saponin fromSapindusmukurossiGaertn

Yang Hequn1, Jian Honglei1, Zhu Liwei1, Sun Dafeng2, Zhang Weiming2, Jiang Jianxin1,*

(1.College of Material Science and Technology, MOE Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials and Bioenergy, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China)

The saponin was extracted fromSapindusmukurossiGaertn. using anhydrous ethanol as extraction solvent. The effects of temperature, solid-liquid ratio and time on extraction efficiency were investigated. The results showed that the optimal conditions for the extraction of saonin were temperature of 50 ℃, solid-liquid ratio of 1 ∶6 and time of 6 h. At the optimal conditions, the yield ofSapindusmukurossisaponin reached 37.5%. The isolation of saponin from the ethanol extraction was carried out by the addition of acetone or anhydrous ether, yielding 17.9% and 32.0% of sapindosides (on the basis of the weight of pericarps), respectively. The saponin precipitated by acetone with a purity of 90.5% were porous and fine-grained with white color, while the saponin obtained from anhydrous ether precipitation with a purity of 84.7% were yellowish with lager particle size. The precipitation rate of saponin from the ethanolic extract by anhydrous ether was 85.3%, which suggested the potential of anhydrous ether for the isolation of saponin.

Sapindusmukurossisaponin; extraction; anhydrous ethanol; purification; acetone; ether

2014-07-18

“十二五”國家科技支撐計劃資助項目( 2012BAD36B01)；大學生創(chuàng)新計劃(X201410022049)；國家林業(yè)局重點資助項目( 2012-03)。

楊鶴群(1994-)，女，梁希實驗班，本科在讀，研究方向：天然產(chǎn)物化學。

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.001

TQ423

A

1006-9690(2015)02-0001-04

*通訊作者：蔣建新，教授，博士研究生導師。主要研究方向：林產(chǎn)化工及生物燃料化學品。