大血藤抗氧化及抗菌活性研究

孫惠芳, 馬瑞麗, 徐秀泉, 湯 建*, 歐陽臻

(1．江蘇大學(xué) 藥學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 定西 743000)

大血藤抗氧化及抗菌活性研究

孫惠芳1, 馬瑞麗2, 徐秀泉1, 湯 建1*, 歐陽臻1

(1．江蘇大學(xué) 藥學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 定西 743000)

本文評(píng)價(jià)了大血藤乙醇提取物和石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水部位的體外抗氧化和抑菌活性以及與總酚含量的相關(guān)性。采用清除DPPH自由基法、Fe3+還原力法評(píng)價(jià)了各部位的抗氧化活性，采用紙片擴(kuò)散法評(píng)價(jià)各部位的抑菌活性。采用Folin-Ciocalteu法測定各部位總酚含量，并采用HPLC-UV解析活性部位物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，水部位清除DPPH能力最強(qiáng)(IC505.53 μg/mL)，優(yōu)于對(duì)照組Vc，其它部位順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?乙醇提取物>二氯甲烷部位>石油醚部位，還原Fe3+的能力順序與此相同?？偡雍颗c抗氧化活性正相關(guān)。石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位有中等強(qiáng)度的抑制革蘭氏陰性菌作用。表明大血藤可能會(huì)成為有價(jià)值的天然抗氧化和抗菌資源。

大血藤；抗氧化；抗菌；總酚含量

大血藤為我國特有植物，是大血藤科(以前歸于木通科)大血藤屬大血藤[Sargentodoxacuneata(Oliv. ) Rehd. et Wils.]，別名紅皮藤、大活血、紅藤等，為傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、理氣活血、祛風(fēng)殺蟲、消腫散結(jié)等作用，臨床用以治療闌尾炎、風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛等[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其含有多種化學(xué)組分，包括酚酸類、木脂素、三萜皂苷、黃酮、蒽醌等化學(xué)成分，藥材的乙醇提取物和水煎劑具有抑菌、抗氧化、抗炎免疫等作用[1,3]。

一些抗氧化天然產(chǎn)物，如：咖啡酸苯乙酯(CAPE)和姜黃素(curcumin) 具有顯著的抗衰老和神經(jīng)保護(hù)活性[4-5]。為研究大血藤抗氧化和抗菌的活性組分,本文研究中篩選了大血藤的抗氧化、抗菌活性部位，并初步分析了活性部位的咖啡酸、綠原酸和總多酚含量。

1 材料與儀器

大血藤藥材購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室歐陽臻教授鑒定為大血藤科大血藤屬植物大血藤SargentodoxacuneataRehd. et Wils.)。DPPH自由基購于Sigma公司；Folin-Ciocalteu’s 試劑購于 Merck 公司；液相用色譜純甲醇，雙純水；其它試劑為分析純。綠原酸、咖啡酸為實(shí)驗(yàn)室自制，純度(歸一化法)>98%。

R-21旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)；LC-20A高效液相色譜儀(Shimadzu)；Sartorius電子天平；高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大血藤各部位的制備

80 g 藥材干燥，粉碎(10～20目)，800 mL 80% 乙醇回流提取2次，每次2 h。提取液減壓濃縮得浸膏17.54 g (21.9% w/w)。加水混懸后用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯依次液-液萃取，蒸除溶劑得石油醚部位(ESCp)、二氯甲烷部位(ESCd)和乙酸乙酯部位(ESCe)。剩余水相上HP 20大孔樹脂柱 (4.0 cm×35 cm), 用5BV的水洗去單糖、寡糖、黏液和其它雜質(zhì), 再用5BV的95%乙醇洗脫，蒸除溶劑得到剩余水部位(ESCa)。ESCp、ESCd、ESCe及ESCa的得率分別為 0.11 g (0.8% w/w)、0.77 g (5.5% w/w)、2.09 g (14.9% w/w)和4.77 g (34.1% w/w)。樣品測試前保存于-20℃。

2.2 抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[6]，分別取大血藤各部位待測液20，50，100，200，400 μL于具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再加入60%乙醇溶液2 mL，0.1 mmo1/L DPPH溶液1mL ，搖勻，暗處靜置30 min。用60%乙醇(空白對(duì)照)調(diào)零，在517 nm波長下測定吸光度A。維生素C為陽性對(duì)照。DPPH清除率按公式：清除率=[A空白-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100% 計(jì)算。

2.2.2 Fe3+還原力測定

參文獻(xiàn)[7]，分別取大血藤各部位待測液50，100，200，300，400 μL于具塞試管中，各自補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后置于50 ℃水浴中20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，4 800 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度，用蒸餾水調(diào)零(空白對(duì)照)。維生素C(Vc)為陽性對(duì)照。

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)

參照紙片擴(kuò)散法[8]，金黃色葡萄球菌(ATCC 12600，G+), 綠膿桿菌 (ATCC 10145，G-), 大腸桿菌 (ATCC 11775，G-)和克雷伯氏肺炎菌 (ATCC 13883，G-)于4 ℃在熔融Mueller-Hinton 營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)。 10 μL樣品(20 mg/mL) 滴加到紙片，新霉素(neomycin，500 μg/mL) 為陽性對(duì)照藥，于37 ℃培養(yǎng)18 h后測定抑菌圈。

2.4 總多酚含量測定

參照文獻(xiàn)[6]，以Folin-Ciocalteu法測定樣品中的總多酚含量。用不同濃度沒食子酸 (1.0～7.0 μg/mL)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取1 mg/mL濃度的樣品溶液0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入6 mL蒸餾水，和0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻，0.5～8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，加蒸餾水加溶劑稀釋至刻度至10 mL，混勻。75 ℃水浴10 min，以空白試劑調(diào)零，在760 nm波長下測定吸光度。

2.5 HPLC-UV分析

色譜柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，4.5 μm)；流動(dòng)相：A為1%冰醋酸水溶液，B為甲醇，以A ∶B=68 ∶32等度洗脫；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測波長：327 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

配置綠原酸、咖啡酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，濃度分別為25.6，4.2 μg/mL，采用倍半法逐級(jí)稀釋，所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微濾膜過濾，制備兩種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別精密稱取大血藤乙醇提取物、石油醚萃取物、二氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、剩余水部位粉末8.0，8.2，8.4，5.08，8.4 mg，分別用甲醇加溶劑稀釋至刻度至10 mL，進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，分別測定5種樣品中綠原酸、咖啡酸的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 清除DPPH自由基活性

除石油醚部位，其它各部位都具有良好的清除DPPH·能力。水部位的清除能力最強(qiáng)，其IC50為5.53 μg/mL，小于Vc的IC50(7.10 μg/mL)。乙酸乙酯部位、二氯甲烷部位、乙醇提取物和石油醚部位的IC50值分別為 5.89 μg/mL，26.62 μg/mL，26.81 μg/mL 和152.22 μg/mL (圖1(A))。各部位清除DPPH·能力均呈劑量依賴性。

圖1 大血藤各部位的清除DPPH·活性(A)及Fe3+還原力活性(B)

3.2 Fe3+還原力測定

還原力是抗氧化物質(zhì)提供電子的重要指標(biāo)。如圖1(B)所示，各部位能量依賴性地還原Fe3+，水部位和乙酸乙酯部位的還原力強(qiáng)于其它部位，但明顯弱于Vc。

3.3 抗菌活性

大血藤臨床上用以治療急性闌尾炎和盆腔炎，可能與藥材的抗菌作用相關(guān)。表1數(shù)據(jù)表明，大血藤乙醇提取物和水部位抑菌活性較弱，乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位的抑菌活性較強(qiáng)，并且表現(xiàn)出針對(duì)革蘭氏陰性菌的敏感性，對(duì)革蘭氏陽性菌的抑菌率幾為0。石油醚部位對(duì)四種菌的抑制率接近，未表現(xiàn)出選擇性。

表1 大血藤各部位的抑菌活性

注：Ec:大腸桿菌，Kp:克雷伯氏肺炎菌，Pa:綠膿桿菌，Sa:金黃色葡萄球菌。

3.4 大血藤各部位總多酚含量測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.117 4x+0.013 9 (r2=0.999 6)，在1.0～7.0 μg/mL范圍內(nèi)范圍線性關(guān)系良好。采用Folin-Ciocalteu測定各部位總多酚含量，如表2所示，水部位的總多酚含量為449.83 mg/kg，高于乙酸乙酯部位(346.76 mg/kg)，二氯甲烷部位(238.59 mg/kg) 和乙醇提取物 (242.84 mg/kg)，石油醚部位的總多酚含量最低，為63.69 mg/kg?？偠喾拥暮颗c清除DPPH自由基和還原力高度相關(guān)，這意味著總多酚可能是抗氧化活性的主要活性成分。但與抗菌活性關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)。

3.5 大血藤各部位中綠原酸和咖啡酸的含量測定

表2 大血藤各部位總多酚和2種化合物的含量測定

注：*與浸膏的質(zhì)量比(w/w)；—:未檢測到。

前期研究中發(fā)現(xiàn)綠原酸、咖啡酸含量較高，且均有良好的抗氧化等活性，因此考察各部位中這兩種化合物的含量。綠原酸回歸方程：y=29 384x-9 917，r2=0.999 9，0.8～25.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；咖啡酸回歸方程：y=64 087x-618.65，r2=0.999 2，0.1～4.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。綠原酸、咖啡酸的含量參見表2。 乙酸乙酯部位中綠原酸和咖啡酸的含量最高，水部位次之。說明綠原酸和咖啡酸是藥材抗氧化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

關(guān)于大血藤的抗氧化和抑菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有力佐證了該藥材在抗菌抗炎的傳統(tǒng)應(yīng)用，也表明該藥材可能會(huì)成為有價(jià)值的天然抗氧化和抗菌資源。優(yōu)選出乙酸乙酯部位和水部位為活性部位，并利用HPLC-UV技術(shù)初步確定活性部位的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，藥材所含酚酸類化合物是大血藤藥材抗氧化、抑菌作用的主要活性成分，但不是唯一的活性成分，可能存在含量較低但活性顯著的化合物，需要進(jìn)一步的研究，以其發(fā)掘該藥材中活性更顯著的抗氧化和抑菌活性組分。

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Antioxidant and Antibacterial Properties ofSargentodoxacuneata

Sun Huifang1,Ma Ruili1,Xu Xiuquan1, Tang Jian1*,Ouyang Zhen1

(1.School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2.Dingxi Municipal Dryland Farming Research and Extension Center, Dingxi 743000, China)

In present study, the potential antioxidant and antibacterial activities of the ethanol extract (ESC) and petroleum ether-(ESCp), dichloromethane-(ESCd), ethyl acetate-(ESCe), and aqueous soluble-(ESCa) fractions ofSargentodoxacuneatawere evaluated, as well as the correlation with total phenolics content. The antioxidant activities were evaluated with scavenging DPPH radical and reducing power assays. The antibacterial activity was evaluated using the disc diffusion assay. The content of total phenolics was determined by the Folin-Ciocalteu colorimetric method, with the HPLC-UVfor further analysis of bioactive subfraction. The results showed that ESCa scavenged DPPH potently (IC505.53 μg/mL), superior to ascorbic acid, followed by ESCe, ESC, ESCd, ESCp, the same to reducing power. The total phenolics content in samples was highly correlated with the antioxidant activity. ESCp, ESCd and ESCe inhibited moderately Gram-negative bacteria. These results validated the potential use of this plant as antioxidant and anti-bacterial agent.

Sargentodoxacuneata; antioxidant; antibacterial; total phenolics content

2014-08-28

國家博士后基金(2012M521023)；江蘇省博士后基金(1201027B)。

孫惠芳，女，碩士研究生，主要從事神經(jīng)保護(hù)植物化學(xué)成分研究。

*通訊作者：湯建，男，博士，副教授。E-mail：jt.u@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.03.004

R285;Q946.8

A

1006-9690(2015)03-0016-04