茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取及其抗氧化活性研究

陳紅梅

(安慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶 246011)

茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取及其抗氧化活性研究

陳紅梅

(安慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶 246011)

采用超聲輔助提取法分別從茯苓皮中提取多糖和三萜類物質(zhì)?？疾焯崛∪軇?、超聲功率、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等對(duì)茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，選用乙醇提取多糖，選用乙酸乙酯浸提三萜類物質(zhì)，最佳提取條件為：超聲功率450 W，液料比為45 mL/g，提取溫度80℃，提取時(shí)間35 min。通過對(duì)DPPH自由基清除作用、還原力、羥基自由基清除作用的測(cè)定，評(píng)價(jià)茯苓皮中多糖和三萜類物質(zhì)的抗氧化活性。結(jié)果表明，抗氧化能力與質(zhì)量濃度存在量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)，茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力均高于VC；茯苓皮三萜類物質(zhì)提取液還原力與VC相當(dāng)。茯苓皮提取物作為一種天然的抗氧化劑具有良好的應(yīng)用前景。

茯苓；多糖；三萜；抗氧化活性

茯苓，大多埋于地下，腐生或寄生于松科植物馬尾松或赤松根部，為擔(dān)子菌綱多孔菌科茯苓屬[Poriacocos(Schw.) Wolf]，俗稱松苓、茯兔、松柏玉等，是一種藥食兩用的真菌。茯苓在中國(guó)主要有三大產(chǎn)區(qū)，分別是安徽、云南和福建。茯苓為傳統(tǒng)中藥，具有利水滲濕、健脾和胃、養(yǎng)心安神、利尿、增強(qiáng)機(jī)體免疫等功能[1-2]，在古代就被稱為“四時(shí)神藥”，成為多種方劑的配伍組方。茯苓富含多種有效成分，包括茯苓多糖、三萜類、月桂酸、麥角甾醇、腺嘌呤及膽堿等活性物質(zhì)，具有很高的藥用及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]?，F(xiàn)代研究表明，茯苓具有抗誘變、增強(qiáng)機(jī)體免疫、促進(jìn)細(xì)胞分裂、抗炎抑菌、補(bǔ)體激活等藥理活性[4-5]。其中，茯苓多糖和三萜類物質(zhì)是最重要的有效成分。

茯苓多糖主要成分為β-茯苓聚糖，是β-(1，3)-D-葡萄糖聚合體，β-茯苓聚糖本身沒有生物活性，只有支鏈切斷后才表現(xiàn)出生物活性。茯苓多糖具有降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、預(yù)防衰老等作用，具有廣泛的應(yīng)用前景[6]。三萜類物質(zhì)廣泛存在于自然界，不同產(chǎn)地的茯苓，三萜類物質(zhì)成分也不盡相同。三萜類物質(zhì)具有廣泛的生物活性，具有利尿、抗腫瘤、抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫、抗生育等活性[7]。

茯苓菌核的外皮即為茯苓皮，在茯苓加工過程中常被作為下腳料而被丟棄，本研究對(duì)茯苓皮中的多糖和三萜類物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)對(duì)茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取物的還原力、羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，綜合評(píng)價(jià)其抗氧化活性。據(jù)此，旨在為茯苓的綜合利用提供理論依據(jù)，也為其應(yīng)用于天然抗氧化劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓皮洗凈于烘箱中60℃烘干，粉碎，過60目篩備用。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司，1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)購(gòu)自Sigma公司，無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、香草醛、抗壞血酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100高速粉碎機(jī)(上海楚定分析儀器有限公司)；FA2004A型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；UV-2000型紫外-可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加適量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，分別加入蒸餾水將體積補(bǔ)充至1 mL，再加入2 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液，混勻，于室溫放置20min，在波長(zhǎng)490 nm處分別測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.1377x-0.1497，R2=0.9992。

1.3.2 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0mg，取適量無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容，得到質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7mL齊墩果酸溶液于試管中，水浴揮干溶劑，分別加入香草醛-冰乙酸和高氯酸，置于65℃恒溫水浴中加熱15min，取出用流動(dòng)冷水冷卻，再分別加入5mL冰乙酸，混勻，在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度值。以齊墩果酸質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.1717x-0.2231，R2=0.9975。

1.3.3 茯苓皮中多糖的提取及含量測(cè)定[8]

準(zhǔn)確稱取茯苓皮粉末各5.0g，置于燒瓶中，加入一定量的石油醚浸泡，過濾，濾渣分別用蒸餾水和乙醇溶液于超聲波清洗器中反復(fù)抽提一段時(shí)間，減壓濃縮，再分別加入3倍體積的無水乙醇，靜置過夜收集沉淀，沉淀用蒸餾水溶解并定容至50mL容量瓶中，待用。取此樣品溶液，按照1.3.1的方法顯色，在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出樣品中多糖的含量。

1.3.4 茯苓皮中三萜類物質(zhì)的提取及含量測(cè)定[9]

準(zhǔn)確稱取茯苓皮粉末各5.0g，置于燒瓶中，分別加入乙醇溶液、乙酸乙酯和石油醚溶液，在超聲波清洗器中回流提取一段時(shí)間，分別抽濾，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮回收溶劑至近干，得到黑色浸膏，加入乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，待測(cè)。取此樣品溶液，按照1.3.2的方法顯色，在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出樣品中三萜類物質(zhì)的含量。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取茯苓皮粉末5.0g，分別考察不同提取溶劑、超聲功率、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)得率的影響。

1.3.6 茯苓皮提取物抗氧化活性測(cè)定

1)DPPH分別吸取0.5mL質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3和0.4mg/mL的樣品溶液同0.15mmol/L的DPPH乙醇溶液2.5mL混合，充分搖勻，在室溫下于暗室中反應(yīng)1h后在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以未加入樣品的DPPH乙醇溶液為空白。同時(shí)，以VC和BHT作陽性對(duì)照。按式(1)計(jì)算DPPH自由基的清除率。

(1)

式中：D(517 nm)0為空白溶液吸光度測(cè)定值；D(517 nm)1為樣品溶液吸光度測(cè)定值。

2)還原力 分別吸取1.0mL質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3和0.4 mg/mL的樣品溶液同pH值6.6的磷酸鹽緩沖溶液2 mL和1%鐵氰化鉀溶液2 mL混合，充分搖勻，置于55℃恒溫水浴鍋中保溫25 min，迅速冷卻，加入三氯乙酸2 mL，充分搖勻，于4500 r/min下離心10 min。取上清液2 mL同0.2% FeCl3溶液0.5 mL和蒸餾水1 mL混合，充分搖勻后靜置10 min，在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度值，以蒸餾水為空白。另以VC作陽性對(duì)照。吸光度值可以評(píng)價(jià)樣品的還原力，吸光度值越大，則樣品的還原力越強(qiáng)[10]。

3)羥基自由基 分別吸取1.0 mL質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3和0.4 mg/mL的樣品溶液于試管中，依次往其中加入5 mmol/L水楊酸溶液1.0 mL、5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、蒸餾水2.0 mL，充分混勻后再加入5 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，置于37℃水浴中保溫30 min，加入0.15 mol/L EDTANa2溶液0.5 mL終止反應(yīng)，測(cè)定其在510 nm處的吸光度值，以蒸餾水為空白。VC作陽性對(duì)照。按式(2)計(jì)算羥基自由基(·OH)的清除率。

(2)

式中：D(510 nm)0為空白溶液吸光度測(cè)定值；D(510 nm)1為不加H2O2的黃酮溶液吸光度測(cè)定值；D(510 nm)2為加入黃酮溶液后的吸光度測(cè)定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)茯苓皮中多糖、三萜類物質(zhì)的得率的影響

選用蒸餾水和乙醇分別提取茯苓皮多糖，結(jié)果如表1所示。用乙醇作為提取溶劑，多糖得率達(dá)到12.5%；蒸餾水提取液中多糖得率為8.7%。乙醇提取液中多糖得率高于蒸餾水提取液中多糖得率，且差異極顯著(P<0.01)。選用乙醇作為提取溶劑浸提茯苓皮多糖。

表1 茯苓皮不同溶劑提取物多糖得率

注：表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表2 茯苓皮不同溶劑提取物三萜含量

注：表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

選用乙醇、乙酸乙酯和石油醚分別提取茯苓皮中三萜類物質(zhì)，結(jié)果如表2所示。乙酸乙酯提取液和石油醚提取液中三萜類物質(zhì)得率均高于乙醇提取液三萜類物質(zhì)得率，且差異極顯著(P<0.01)，其中乙酸乙酯提取液中三萜類物質(zhì)得率又較石油醚提取液中得率高，差異顯著(P<0.05)，含量達(dá)到19.9%。選用乙酸乙酯作為提取溶劑浸提茯苓皮中三萜類物質(zhì)。

2.1.2 超聲功率對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

在不同的超聲功率(300、350、400、450、500、550和600 W)下，分別按液料比20 mL/g，提取溫度50℃，提取時(shí)間30 min進(jìn)行提取，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，隨著超聲功率的增加，茯苓皮多糖得率也隨之上升，當(dāng)功率達(dá)到450 W時(shí)，此時(shí)繼續(xù)增加超聲功率，多糖得率仍在上升，但上升趨勢(shì)較緩慢。而當(dāng)功率達(dá)到450 W，繼續(xù)增加超聲功率，此時(shí)茯苓皮三萜類物質(zhì)得率反而呈下降趨勢(shì)。選擇超聲功率在450 W較為合適。

圖1 超聲功率對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

2.1.3 液料比對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

在超聲功率450 W，以不同的液料比(15、25、35、45、55、65和75 mL/g)，分別按提取溫度50℃，提取時(shí)間30 min進(jìn)行提取，結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，隨著液料比的增加，茯苓皮多糖得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)液料比超過45 mL/g，此時(shí)多糖得率呈下降趨勢(shì)；而隨著液料比的增加，茯苓皮中三萜類物質(zhì)呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)液料比超過50 mL/g，此時(shí)三萜類物質(zhì)呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)?？紤]到得率及后期處理，以液料比為45 mL/g為宜。

圖2 液料比對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

2.1.4 提取溫度對(duì)對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

在超聲功率450W，液料比45mL/g，分別按不同的提取溫度(40、50、60、70、80和90℃)，提取時(shí)間30 min進(jìn)行提取，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，隨著提取溫度的升高，茯苓皮多糖得率呈不斷上升趨勢(shì)，只是當(dāng)溫度達(dá)到80℃后，繼續(xù)升高溫度，多糖得率增長(zhǎng)緩慢；隨著溫度的升高，三萜類物質(zhì)得率也不斷增加，但當(dāng)溫度超過80℃后，三萜類物質(zhì)得率反而下降。提取溫度可以設(shè)為80℃。

圖3 提取溫度對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

2.1.5 提取時(shí)間對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

在超聲功率450 W，液料比45 mL/g，提取溫度80℃，分別按不同的提取時(shí)間(15、25、35、45、55和65 min)進(jìn)行提取，結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)得率均呈先上升后降低的趨勢(shì)。提取時(shí)間在45 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大；提取時(shí)間在35 min時(shí)，三萜類物質(zhì)得率達(dá)到最大?？紤]到得率及能耗，可以選擇提取時(shí)間35 min。

圖4提取時(shí)間對(duì)茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)的影響

2.2 茯苓皮提取物抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH的醇溶液呈紫色，DPPH是一種穩(wěn)定的含氮自由基，結(jié)構(gòu)中含有孤對(duì)電子，可以與自由基清除劑提供的電子配對(duì)結(jié)合，使DPPH溶液褪色，根據(jù)吸光度值的大小可以評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化性[11-12]。由圖5可知，茯苓皮多糖提取液和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，并且當(dāng)提取液質(zhì)量濃度由0.1 mg/mL增加至0.5 mg/mL時(shí)，多糖和三萜類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率也隨之升高。隨著對(duì)照品BHT和VC質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)DPPH的清除率逐漸增大。在質(zhì)量濃度較低時(shí)，多糖和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)DPPH的清除率不如VC；而當(dāng)三萜類物質(zhì)提取液質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL后，其對(duì)DPPH的清除率已經(jīng)超過VC；當(dāng)多糖提取液質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL后，其對(duì)DPPH的清除率與VC相當(dāng)，超過BHT對(duì)DPPH的清除率。

圖5 茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)提取液對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.2.2 還原力測(cè)定

由圖6可知，隨著茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取液質(zhì)量濃度的升高，它們的還原力也在增加。對(duì)照品VC的還原力也隨著其質(zhì)量濃度的升高而增加。茯苓皮三萜類物質(zhì)提取液的還原力與VC整體相當(dāng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，甚至稍高于VC。而茯苓皮多糖提取液，其還原力不如三萜類物質(zhì)提取液和VC。

圖6 茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)提取液的還原力

2.2.3 羥基自由基清除率

由圖7可知，茯苓皮多糖提取液和三萜類物質(zhì)提取液均具有一定的清除羥基自由基的作用，并且當(dāng)提取液質(zhì)量濃度由0.1 mg/mL增加至0.5 mg/mL時(shí)，多糖和三萜類物質(zhì)對(duì)羥基自由基的清除率也在升高。隨著對(duì)照品VC質(zhì)量濃度的升高，其對(duì)羥基自由基的清除率也在增加。在質(zhì)量濃度較低時(shí)，茯苓皮多糖提取液和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)羥基自由基的清除率與對(duì)照品VC相當(dāng)，而當(dāng)質(zhì)量濃度升高到0.4 mg/mL時(shí)，多糖提取液和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)羥基自由基的清除能力均大于對(duì)照品VC的清除能力，其中多糖提取液對(duì)羥基自由基的清除能力又稍高于三萜類物質(zhì)。

圖7 茯苓皮多糖、三萜類物質(zhì)提取液對(duì)羥基自由基的清除作用

3 結(jié)論

茯苓作為傳統(tǒng)藥材，其下腳料茯苓皮也具有一定的藥理作用，尤其以消腫利水為長(zhǎng)[13]。茯苓皮中有多糖和三萜類等物質(zhì)的存在。多糖類物質(zhì)和三萜類化合物近年來研究較多，二者均是重要的天然抗氧化物質(zhì)。選用乙醇作為提取溶劑，從茯苓皮中提取多糖，選用乙酸乙酯浸提三萜類物質(zhì)，最佳提取條件為：超聲功率450 W，液料比為45 mL/g，提取溫度80℃，提取時(shí)間35 min。

抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，茯苓皮多糖提取液和三萜類物質(zhì)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。在一定范圍內(nèi)，茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取液的抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度的升高而增加。質(zhì)量濃度較高時(shí)，多糖和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)DPPH的清除率超過VC和BHT。茯苓皮三萜類物質(zhì)提取液的還原力和VC相當(dāng)，稍高于多糖提取液的還原力。在質(zhì)量濃度較高時(shí)，茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)提取液對(duì)羥基自由基的清除能力均大于對(duì)照品VC。茯苓皮提取物的抗氧化能力總體來說要優(yōu)于VC。

生物氧化是機(jī)體進(jìn)行能量代謝和物質(zhì)代謝必不可少的環(huán)節(jié)，生物體代謝過程中產(chǎn)生的自由基對(duì)機(jī)體會(huì)造成損傷，甚至?xí)鸾M織病變，引起人們對(duì)抗氧化物質(zhì)的關(guān)注，天然抗氧化劑的開發(fā)具有良好的應(yīng)用前景[14-15]。對(duì)茯苓皮多糖和三萜類物質(zhì)的抗氧化作用進(jìn)行研究，DPPH自由基的清除能力、還原力和羥基自由基的清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化性的重要參數(shù)[16]。很多疾病的發(fā)生都與羥基自由基有著相當(dāng)大的關(guān)系。DPPH自由基因?yàn)椴僮餮杆佟⒑?jiǎn)便，目前也廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化活性。還原力與抗氧化能力密不可分，還原力愈強(qiáng)意味著其抗氧化能力愈強(qiáng)。羥基自由基是一種活潑的自由基，具有較強(qiáng)的活性和毒性，可與組織細(xì)胞中的一些生物大分子發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷[17-19]。羥基自由基是一種相對(duì)來說較難清除的自由基。深入研究茯苓皮提取物抗氧化作用對(duì)天然抗氧化劑的開發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Study on extraction technology and antioxidative activity of polysaccharides and triterpenoids from peel ofPoriacocos

CHEN Hong-mei

(School of Life Science, Anqing Teachers College, Anqing 246011, China)

Microwave assisted extracting conditions of polysaccharides and triterpenoids from peel ofPoriacocoswere studied. The influence of extraction solvent, solvent-material ratio, ultrasonic power, temperature, extraction time was evaluated by single factor experiments. The results showed that the polysaccharides were obtained by ethanol, while the triterpenoids was obtained by ethyl acetate. The optimal conditions were as follows. Ultrasonic power 450 W; solvent-material ratio, 45 mL/g; temperature, 80℃; and extraction time, 35 min. The antioxidant activity was evaluated based on DPPH radical scavenging capacity, reducing power and hydroxyl free radical scavenging capacity. The ability of antioxidative activity was increased with the inerease concentrations of polysaccharides and triterpenoids. When extracted at the concentration of 0.4 mg/mL, polysaccharides and triterpenoids revealed relatively better DPPH radical scavenging capacity and hydroxyl free radical scavenging capacity than VC. Reducing power of riterpenoids was comparable to those of VC. Therefore, the peel ofPoriacocosis effective as novel natural antioxidants.

Poriacocos; polysaccharides; triterpenoids; antioxidative activity

2014-06-09；

2014-09-15

安徽省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(KJ2011B081)

陳紅梅，碩士，講師，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)，E-mail: hongmeichen2000@163.com。

R284.2

A

2095-1736(2015)02-0048-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.048