綿羊ARHGAP36 全長cDNA的克隆及其蛋白在睪丸精細管中的分布檢測

白 雪， 王連慶， 邢萬金

(內蒙古大學 生命科學學院， 呼和浩特 010021)

綿羊ARHGAP36 全長cDNA的克隆及其蛋白在睪丸精細管中的分布檢測

白 雪， 王連慶， 邢萬金

(內蒙古大學 生命科學學院， 呼和浩特 010021)

ARHGAP36是Rho GAPs家族的一員，在成神經管細胞瘤中超表達，可能參與調節(jié)細胞增殖。為了研究ARHGAP36在羊精子發(fā)生過程中的作用，采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術從綿羊睪丸組織中克隆了SARHGAP36的cDNA全長序列。內部區(qū)域cDNA序列與5′RACE 和3′RACE擴增的兩端序列測序后拼接，得到了2698 bp的綿羊ARHGAP36 cDNA全長，其中包含一個長1593 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼530 aa，與UniProt中預測的牛ARHGAP36氨基酸序列(A7MB27)同源性為98%，說明我們克隆的cDNA是Rho GAP家族的成員ARHGAP36。對所克隆的綿羊ARHGAP36的氨基酸序列和UniProt數據庫中所收集的所有其它ARHGAP成員的氨基酸序列比對分析顯示，ARHGAP36沒有其它ARHGAP成員都有的標志性“精氨酸指”基序，而它的對應基序中的保守精氨酸殘基被蘇氨酸替代了，暗示ARHGAP36很可能并不依靠酶催化活性發(fā)揮其功能。當把所克隆的cDNA與GenBank中發(fā)布的綿羊arhgap36序列比對時發(fā)現(xiàn)綿羊arhgap36基因組測序結果的第一個外顯子中缺少一小段DNA，導致如果用該基因組序列預測綿羊ARHGAP36的cDNA，無法得到能編碼正確氨基酸的cDNA，因此，實驗為進一步研究ARHGAP36這個特殊ARHGAP成員的功能提供了正確的cDNA序列。綿羊睪丸總蛋白Western blot檢測發(fā)現(xiàn)綿羊睪丸內的ARHGAP36有3種長度，免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)ARHGAP36蛋白在綿羊睪丸精細管中的精子發(fā)生過程中各類細胞中都有分布。

綿羊；ARHGAP36 ；cDNA克?。籖ACE；免疫組織化學

Rho GTP酶家族是小GTP酶家族中的成員，是一種受調節(jié)的分子開關(regulated molecular switches)。它們與Ras類似，都是在GTP結合的活性形式與GDP結合的失活形式之間來回切換?；罨腞ho GTP酶通過激活下游的效應分子，在細胞調節(jié)中發(fā)揮多種功能，比如細胞骨架的重排，細胞周期的進行及細胞遷移等[1]。到目前為止，已經在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)20種Rho GTP激酶家族的成員。Rho GTP酶共有RHO、RAC及CDC42 3種亞型，它們通過不同的方式對細胞骨架的肌動蛋白進行調節(jié)：在成纖維細胞中，RHO的活化促使黏著斑復合體的形成，并使肌動蛋白微絲收縮[2]；RAC的活化對皮層肌動蛋白聚合有非常重要的作用[3]；而CDC42則促使絲狀偽足的形成[4]。此外，RHO、RAC及CDC42需要經過細胞周期的G1期才能被激活。其中，RHO的調控則更嚴格，它需要G1中期周期蛋白D1表達的介導[5]。Rho GTP酶的活性受到GTP和GDP的調節(jié)，當與GTP結合時，Rho GTP酶被激活，但當所結合的GTP水解成GDP，Rho GTP酶失去活性。Rho GTP酶的活性受3類因子調節(jié)[6]。一類是GTP酶激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)，也稱為Rho GAP或ARHGAP，催化與Rho GTP酶結合的GTP水解成GDP，使Rho GTP酶失活[7-8]；另一類是鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)，作用相反，催化與Rho GTP酶結合的GDP轉化成GTP，激活Rho GTP酶[9]；此外還有鳥苷酸解離抑制因子(guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs)[6, 10]，主要作用可能是促使Rho GTP酶離開細胞膜。ARHGAP是一個大家族，自1991年[12]報道第一個Rho GAP蛋白Bcr(breakpoint cluster region protein)起，已經發(fā)現(xiàn)約70個成員[12]，HUGO 基因命名委員會(HGNC)已經登記了近50個成員(http://www.genenames.org/genefamilies/ARHGAP)。所有的Rho GAP蛋白都包含一個大約由150個氨基酸組成的Rho GAP結構域[13]，它與該家族的其它成員至少具有20%的同源性[14]。Rho GAP的結構域包括9個α螺旋，并且在其酶活性結構域中含有一個保守的精氨酸殘基[15-16]。Rho GAP與靶蛋白GTP-Rho結合具有序列特異性，對活化特異的Rho GTP酶具有重要作用，尤其是與GTP酶的活性中心直接結合的精氨酸殘基[17]。

由于Rho GTP酶家族具有廣泛的細胞效應，ARHGAP家族作為Rho GTP酶的負調節(jié)因子對于Rho GTP酶在細胞生長、增殖、分化等過程中正確發(fā)揮作用至關重要[18]，調節(jié)胚胎發(fā)育[19-20]、神經發(fā)育[21]、細胞分裂和分化[22-23]。缺失某些Rho GAPs會導致顯著的變異表型[24]。如arhgap31突變會導致Adams-Oliver綜合癥[25]，CHN1(arhgap2)突變引起 isolated Duane retraction綜合癥[26]。ARHGAP6在人體的多種組織中表達，它的缺失會引發(fā)線性皮膚缺損小眼畸形(microphthalmia with linear skin defects, MLS)[27]。在小鼠的ARHGAP6的缺失會導致牙釉質的缺損[28]。ARHGAP的非酶結構域的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)，可能與其在細胞中的定位及信號傳導中的特殊作用有關[15]。

ARHGAP36是Rho GAPs家族的一員，最近發(fā)現(xiàn)ARHGAP36的超表達與人的成神經管細胞瘤(medulloblastoma, MB)有關[29]。ARHGAP36在鼠成神經管細胞瘤中也超表達，且能激活轉錄因子Gli 并影響下游基因表達[30]。這些結果顯示ARHGAP36在對于調節(jié)細胞增殖具有重要作用。本實驗室先前測序綿羊睪丸轉錄物組，發(fā)現(xiàn)有ARHGAP36片段，推測ARHGAP36可能在精子發(fā)生過程中有某種作用。經查閱GenBank發(fā)布的綿羊基因組序列，發(fā)現(xiàn)綿羊的arhgap36(Gene ID: 100913153)序列中尚存在gap，難以預測出可信的cDNA和氨基酸序列。NCBI預測了59個物種的arhgap36(FLJ30058)直系同源基因序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?Term=ortholog_gene_158763[group])，UniProt蛋白數據庫里也收集了32條ARHGAP36氨基酸序列(http://www.uniprot.org/uniprot/?query=arhgap36&sort=score)，但都是根據基因組序列預測的，尚無來自于實驗克隆的cDNA編碼序列。UniProt預測了兩條綿羊ARHGAP36 氨基酸序列，一條為547 aa(W5PTE2)，另一條為536 aa(W5PTE3)，差異很大，無法確認哪一條正確。為了深入研究ARHGAP36對綿羊精子發(fā)生的影響，本文用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術克隆了綿羊ARHGAP36 的cDNA全長，為闡明ARHGAP36在羊睪丸組織中的功能積累資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其組織

內蒙古綿羊公羊屠宰后立即采集其睪丸，保存在-80°C冰箱中備用。

1.2 試劑

RNAiso Reagent、DNA Ligation Kit、RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、3 U/μL rTaq DNA聚合酶、PCR緩沖液(10×，MgCl2free)、250 bp DNA Ladder Marker、2.5 mmol/L MgCl2、dNTPs等均購自寶生物工程(大連)有限公司。SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 購自Clontech公司(Catalog NO. 634914)。DNA Marker II、DNA Marker III和2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司。AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 購自AXYGEN Biosciences公司。pMD19-T cloning Vector購自寶生物工程(大連)有限公司。辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG購自上海圻明生物科技有限公司。E.coliDH5α由內蒙古大學生命科學學院基因工程實驗室保存。

1.3 公羊睪丸組織總RNA的提取及cDNA 合成

所用的器皿均用0.1% DEPC水37℃下浸泡12 h，然后121℃滅菌30 min，除去殘余的DEPC，置于干燥箱中烘干。RNA提取所用溶液均用0.1% DEPC水配制。稱取羊睪丸組織50～100 mg，，按照TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒操作步驟提取公羊睪丸組織的總RNA。

以總RNA為模板，oligod(T)為引物，利用AMV反轉錄酶合成cDNA的第一鏈。

1.4 綿羊ARHGAP36 cDNA內部區(qū)域的克隆

1.4.1 PCR引物設計 根據GenBank上發(fā)布的牛(NM_001101988)、黑猩猩(XM_521264)、馬(XM_001491324)、人(NM_144967)、恒河猴(XM_001094001)、小鼠(NM_001081123)和大鼠(XM_229133)的ARHGAP36 mRNA序列，使用CLC Sequence Viewer軟件進行基因序列的同源性比對，在這幾種哺乳動物ARHGAP36 cDNA序列的內部找到4處高度保守的區(qū)段。因為該基因的cDNA的預期比較長(>2 kb)，我們根據這4個保守區(qū)的序列設計了兩條上游引物及兩條下游引物(位置見圖2)，分段克隆綿羊ARHGAP36 cDNA的內部區(qū)域，然后根據重疊區(qū)拼接。兩組PCR的引物分別是：

F1 5′-AGGAGCCCCAGGACACAAC-3′(相當于牛ARHGAP36 cDNA的60～78 bp)；

R1 5′-CCCTTCTTCAGGAGAGCAG-3′ (相當于牛ARHGAP36 cDNA的1109～1127 bp)；

F2 5′-ATTGCTGGTTTACCTGATG-3′ (相當于牛ARHGAP36 cDNA的945～963 bp)；

R2 5′-TAGGAGGAGGGTAGGAAAG-3′ (相當于牛ARHGAP36 cDNA的1995～2013 bp)

羊與牛是同科動物，基因的同源性極高，因此我們根據牛的ARHGAP36 cDNA的預測序列，預期PCR產物長度分別約1067 bp和1068 bp。兩段PCR產物約有183 bp重疊區(qū)，用于拼接。引物由寶生物工程(大連)公司合成。

1.4.2 PCR擴增 擴增F1-R1區(qū)段的PCR反應條件是94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增F2-R2區(qū)段的PCR反應條件是94℃預變性3 min；94℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

擴增的PCR產物回收后與pMD-19T載體連接轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，提取質粒后PCR鑒定，分別選擇3個克隆的質粒送交北京三博遠志公司測序。

1.4.3 用3′RACE和5′RACE分別擴增綿羊ARHGAP36 cDNA3′末端和5′末端

RACE引物設計 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit中給了兩條RACE公用引物UPM和NUP序列，其中NUP實際上是UPM的3端的半段，做套嵌PCR。為了增加PCR擴增的效率和特異性，我們額外設計了一條RACE引物，此引物位于公用引物UPM的內部，并且與另一條公用引物NUP的5′端重疊，用作5′RACR的上游引物和3′RACE的下游引物。序列如下：

UPM：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

NUP：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

UVU：5′-TAGGGCAAGCAGTGGTATC-3′

此外我們根據上述克隆測序后獲得的綿羊ARHGAP36 cDNA內部區(qū)域，設計了5′RACE的下游引物SP5，位于上述克隆拼接后的綿羊ARHGAP36 cDNA片段的149～173 bp；設計的3′RACE的上游引物SP3位于上述克隆拼接后的綿羊ARHGAP36 cDNA片段的-184～-208 bp；兩條引物的位置見圖2，序列如下：

SP5：5′-GGTGTTTGGACGGTCAGTAGGTAG-3′

SP3：5′-CTGGTGCTACCTTGCCTCTCTCTT-3′

首先按照操作該試劑盒的操作說明，用總RNA以及試劑盒自帶的SMART II A oligo、5′-CDS引物和3′-CDS引物分別合成5′RACE和3′RACE用的cDNA第一鏈。

RACE擴增 5′RACE：以上述5′RACE的cDNA第一鏈為模板，用UPM引物和SP5引物進行一輪Touch-Down PCR，條件為94℃變性30 s，72℃退火1 min，延伸30 s，5個循環(huán)；94℃變性30 s，70℃退火30 s，72℃ 1 min，5個循環(huán)；94℃變性30 s，68℃退失30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。以此PCR產物為模板，用NUP引物和SP5引物進行第二輪巢式PCR，反應條件同上。以此巢式PCR產物為模板，用UVU引物和SP5引物進行第3次PCR，反應條件為94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。將第3次PCR產物進行電泳觀察是否有帶，如有帶則回收與pMD-19T載體連接。

為了鑒定擴增出的產物是否包含上述已經克隆的ARHGAP36 cDNA片段的5′端一部分，我們另外設計一條靠近上述片段5′末端的內部引物，用于最后PCR鑒定。設計的鑒定引物SPa(5′-AGTTCGTGGTAAGCAGCCTC-3′)位于F1引物下游66～86 bp，位于SP5的上游-44～-64 bp，因此F1和SPa引物均在5′RACE產物的內部，如果用F1-SPa引物做PCR鑒定的話，預期產物105 bp。如果出現(xiàn)此預期產物，分別選擇3個克隆的質粒送交北京三博遠志公司測序。

3′RACE: 與上述5′RACE方案相似，但上游引物改用上述已克隆的綿羊ARHGAP36 cDNA片段3′端的SP3引物。以3′RACE的cDNA第一鏈為模板，SP3引物與UPM引物進行第一輪PCR，用SP3引物與NUP引物進行第二輪巢式PCR，SP3引物與UVU引物進行第3輪PCR。為了鑒定擴增出的產物是否包含上述已經克隆的ARHGAP36 cDNA片段的3′端一部分，我們另外設計一條靠近上述片段3′末端的內部引物，用于最后PCR鑒定。設計的鑒定引物SPb(5′ -AGCCGTCCCTTTAATTGATG-3′) 位于R2引物上游-91～-111 bp，位于SP3下游的32～52 bp。即SPb和R2引物實際上位于3′RACE產物的內部，用SPb-R2引物進行PCR鑒定，預期出現(xiàn)129 bp產物。如果出現(xiàn)此預期產物，分別選擇3個克隆的質粒送交北京三博遠志公司測序。

將上述測序結果拼接后即可得到綿羊ARHGAP36 cDNA全長。

1.5 ARHGAP36抗體制備即在綿羊睪丸組織中的免疫組織化學檢測

以克隆的綿羊ARHGAP36 cDNA的F2-R2片段為模板，用上游引物5′-CGGATCCATGATTGATAACTGGGATGTC-3′(下劃線為添加的BamH I酶切位點)和下游引物5′-GGAATTCAGGAAAGAAGTAGCCGATGCC-3′(下劃線為添加的EcoR I酶切位點)擴增綿羊ARHGAP36中部的402 bp cDNA片段，擴增條件為94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，回收后BamH I與EcoR I雙酶切，插入原核表達載體pGEX-4T3中，IPTG誘導表達后用GST柱子純化GST-ARHGAP36融合蛋白(其分子量約為45 ku)，然后免疫小鼠，制備小鼠抗GST-ARHGAP36腹水多克隆抗體。用制備的多克隆抗體為一抗，Western blot法檢測該抗體能否特異性識別大腸桿菌中表達的GST-ARHGAP36融合蛋白和綿羊睪丸總蛋白中的內源性ARHGAP36蛋白。

取雄性綿羊睪丸組織，4%中性多聚甲醛4℃固定過夜，經脫水、透明、滲蠟、包埋后，進行5μm連續(xù)切片。將連續(xù)切片貼片于預先處理好的防脫載玻片上，采用二次展片法展片。60℃恒溫箱中烤片2 h，以本實驗室自制的小鼠抗綿羊GST-ARHGAP 36腹水多克隆抗體(1∶50)為一抗，辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG為二抗，同時以未免疫的小鼠腹水以及GST單克隆抗體為一抗作為對照，按照免疫組化試劑盒說明進行免疫組化染色。

2 結果

以綿羊睪丸總RNA反轉錄的總cDNA為模板，用F1-R1、F2-R2引物進行PCR擴增均獲得約1100 bp的擴增產物，與預期大小相符(圖1 A泳道2，4)。經過測序拼接后得到1957 bp(包含F(xiàn)1和R2引物)的綿羊ARHGAP36 cDNA內部區(qū)片段，經BLAST發(fā)現(xiàn)與GenBank中預測的牛ARHGAP36 cDNA(NM_001101988)的同源性達到98%，證明我們獲得的綿羊ARHGAP36 cDNA是正確的。

圖1 綿羊ARHGAP36 cDNA的克隆及PCR鑒定

A—內部區(qū)的克隆與鑒定。泳道1、3、5：DNA Marker III (4500 bp, 3000 bp, 2000 bp, 1200 bp, 800 bp, 500 bp, 300 bp)；泳道2：F1-R1引物的PCR產物；泳道4：F2-R2引物的PCR產物；泳道6：F1-R1的PCR產物與pMD19-T連接后的PCR鑒定；泳道7：F2-R2的PCR產物與pMD19-T連接后的PCR鑒定。B—5′末端的克隆。泳道1、3、5：DNA Marker III；泳道7：DNA Marker II(1200 bp, 900 bp, 700 bp, 500 bp, 300 bp, 100 bp)；泳道2：5′RACE第一輪PCR反應產物；泳道4：5′RACE第二輪PCR反應產物；泳道6：5′RACE第三輪PCR反應產物；泳道8～10：用F1-SPa引物鑒定5′RACE第三輪PCR產物與pMD19-T連接成的3個重組質粒。C—3′末端的克隆。泳道1、3、5：DNA Marker III；泳道7：DNA Marker II；泳道2：3′RACE第一輪PCR反應產物；泳道4：3′RACE第二輪PCR反應產物；泳道6：3′RACE第三輪PCR反應產物；泳道8～10：用SPb-R4引物鑒定3′RACE第三輪PCR產物與pMD19-T連接成的3個重組質粒。

然后我們用綿羊的睪丸總RNA，按照Clontech RACE試劑盒的說明合成用于5′RACE和3′RACE的相應的cDNA第一鏈，各進行1次Touch-Down PCR，隨后繼續(xù)2次Nest PCR，最終擴增得到了綿羊ARHGAP36 cDNA的5′和3′末端部分，其中5′RACE的擴增片段約250 bp(圖1B泳道6)，而3′RACE的擴增片段約為700 bp(圖1C泳道6)。

將回收的5′RACE 和3′RACE的擴增產物分別與pMD19-T連接，轉化DH5α，隨機各挑取3個克隆提取質粒，分別用F1-SPa引物和SPb-R2引物進行PCR鑒定。3個5′RACE克隆用F1-SPa引物進行PCR鑒定，均出現(xiàn)約100 bp產物(圖1B泳道8～10)；3個3′RACE克隆用SPb-R2引物進行PCR鑒定，均出現(xiàn)約130 bp產物(圖1C泳道8～10)，均與預期長度相同。

圖2 用RACE技術克隆的綿羊ARHGAP36 cDNA全長

下劃線及其下的字母表示本文所設計的克隆引物位置；斜體字母是5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)；正體大寫字母和小寫字母分別表示對應于相鄰的外顯子； ATG(49-51)是起始密碼，TAG(1639-1641)是終止密碼；灰色背景的aataaa(2671-2676)是PolyA加尾信號。

5′RACE 和3′RACE的擴增產物測序后與上述克隆得到的ARHGAP36 cDNA內部片段拼接，除去兩頭的RACE引物后得到了2698 bp的綿羊ARHGAP36 cDNA全長(圖2)。其中包含一個1593 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼530 aa，與UniProt數據庫中預測的牛ARHGAP36氨基酸序列(A7MB27)同源性為98%，說明我們克隆的cDNA是編碼Rho GAP家族的成員ARHGAP36，序列已提交NCBI，登錄號為JQ736806。根據牛ARHGAP36氨基酸序列(A7MB27)注釋，綿羊ARHGAP36的1～19 aa為信號肽， 209～409 aa是一個Rho GAP結構域，132～168 aa是一個富含精氨酸區(qū)。237～241 aa(VGIFT)是一個類似GAP結構域的活性部位的保守基序。

為了檢測ARHGAP36蛋白在精子發(fā)生過程中的表達情況，我們自制了小鼠抗綿羊ARHGAP36的腹水多克隆抗體，并用Western blot法鑒定了該抗體能否識別羊ARHGAP36蛋白。如圖3A顯示，本抗體既能識別大腸桿菌表達并純化的約45 ku的GST-ARHGAP36融合蛋白(圖3A泳道2)，也能識別轉化了pGEX-4T3的大腸桿菌所誘導表達出的26 ku的GST標簽蛋白(圖3A泳道3)。用該抗體作一抗Western blot檢測綿羊睪丸總蛋白，發(fā)現(xiàn)能在55～72 ku之間看到兩條明顯的識別信號(圖3B泳道2)，分子量與綿羊ARHGAP36除去信號肽后的成熟肽57.8 ku一致。在55 ku處還有一條識別帶(圖3B泳道2)，提示綿羊ARHGAP36在睪丸內可能存在不同長度的形式。

用該抗體對綿羊睪丸組織切片進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)ARHGAP36蛋白存在于精細管內的各層次的細胞中(圖3D)，說明在精子發(fā)生過程中，初級精母細胞到圓形精子都在表達ARHGAP36。

圖3綿羊睪丸總蛋白中ARHGAP36的Western blot檢測和組織切片中ARHGAP36 的免疫組織化學檢測

A—用自制的小鼠抗羊ARHGAP36多克隆抗體做一抗進行Western blot檢測大腸桿菌表達的純化的GST-ARHGAP36蛋白。泳道1：蛋白分子量Marker(Ku)；泳道2：用于免疫小鼠制備抗體的純化的GST-ARHGAP36，分子量約45 ku；泳道3：IPTG誘導后的表達GST的大腸桿菌總蛋白。B—用自制的小鼠抗羊ARHGAP36多克隆抗體做一抗進行Western blot檢測綿羊睪丸總蛋白中的內源性ARHGAP36。泳道1：蛋白分子量Marker(Ku)；泳道2：綿羊睪丸總蛋白，體內的成熟ARHGAP36蛋白理論分子量約57.8 ku；泳道3：IPTG誘導后的表達GST的大腸桿菌總蛋白。C—GST單克隆抗體作為一抗的免疫組織化學對照。D—小鼠抗羊GST-ARHGAP36腹水多克隆抗體做一抗的免疫組化。紅色染色信號為ARHGAP36蛋白所在位置，D圖中精細管橫截面內的精子發(fā)生過程不同時期的細胞內均有紅色信號。

3 討論

UniProt數據庫根據International Sheep Genomics Consortium發(fā)布的綿羊基因組序列[31]預測了兩條綿羊ARHGAP36 氨基酸序列，一條為547 aa(W5PTE2)，另一條為536 aa(W5PTE3)，兩條之間的主要差異是W5PTE2在N端比后者多44個氨基酸(MGGCIPFLKTARTRYPRIMPPLLLLSALIFLVNVLGHNSNRRAK)，但在距離C端51 aa之前缺失一個36個氨基酸的片段(ITFFKNQSQPGQVMDYMSFLESLKNNACFRLSMKFC)。本實驗克隆的綿羊ARHGAP36 cDNA編碼530 aa，與兩種預測版本的長度均不同，氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，與W5PTE2更相似。W5PTE2去掉N端的18個氨基端(MGGCIPFLKTARTRYPRI)、在第18 aa后插入的GAPG 4個氨基酸、第88 aa后去掉CSG 3個氨基酸就與本實驗克隆的cDNA推導氨基酸序列相同。

UniProt為何預測出差異如此之大且均有錯誤的兩種綿羊ARHGAP36蛋白呢？我們仔細檢查了GenBank數據庫(NW_004080190)和Ensembl數據庫里(ENSOARG00000012814)里綿羊arhgap36的基因組DNA序列，發(fā)現(xiàn)都還不完整，都有376 bp的gap。把我們克隆到的綿羊ARHGAP36 cDNA與這兩個數據庫的基因組測序結果比對，發(fā)現(xiàn)該基因組DNA中有11段匹配我們克隆的cDNA，即綿羊arhgap36由11個外顯子組成，10個內含子都是GT-AG內含子。基因組DNA中的gap位于第一個內含子內部，不影響對該基因的編碼區(qū)解讀。第2～11外顯子拼接的序列與我們克隆的cDNA完全相同，但第1外顯子內部缺少我們克隆的第99～110 bp的11個堿基 (GGAGGAGCCCC，位于本實驗設計的F1引物內部)。基因組DNA中如果缺失這11個堿基將會導致翻譯的時候第1外顯子內部就出現(xiàn)終止密碼，因此，GenBank中現(xiàn)有的綿羊基因組序列的這個小錯誤導致用生物信息學軟件無法推導出正確的綿羊ARHGAP36 cDNA。這應該就是UniProt中預測ARHGAP36氨基酸序列出現(xiàn)N端混亂的原因。

綿羊arhgap36中缺失的這11 bp正好位于我們根據比對牛、鼠、人、黑猩猩等生物的ARHGAP36 cDNA找到的高度保守區(qū)之一，我們也據此設計了F1引物。雖然這11 bp在克隆內部區(qū)的時候是我們的一條上游引物，但在5′RACE擴增的時候屬于內部序列，5′RACE產物的測序結果也證實這11 bp真實存在于ARHGAP36 cDNA 5′區(qū)域的內部。證明這11 bp在綿羊arhgap36中應該存在，在GenBank綿羊基因組中的缺失應該是基因組測序或者組裝的錯誤。

ARHGAP家族的特征結構是Rho GAP結構域。根據Rho GAP家族的成員RhoGAP、p190、bcr、chimerin、3BP-1及p85[32]的研究結果，我們對所克隆的綿羊SARHGAP36的Rho GAP結構域進行了分析。該結構域含有9個螺旋結構，含有7個G蛋白結合位點的螺旋(圖4 黑色框)，2個非G蛋白結合位點的螺旋(圖4白色框)。它含有增強GTP激酶活性的位點Gly238，Leu288，Leu318，Met357，Asn361，前4個氨基酸殘基位于B-F口袋(pocket)附近，第5個位于F螺旋上。

圖4 綿羊ARHGAP36的Rho GAP結構域

9個α螺旋用方框表示，其中，A～C 7個黑色方框表示該螺旋含G蛋白結合的位點，A0和A1兩個白色方框表示該螺旋不含G蛋白結合的位點；N和C分別表示肽鏈的兩端。

ARHGAP家族的Rho GAP結構域中有一個保守的精氨酸(R)具有催化作用，被稱為“精氨酸指”(arginine finger)[33]，是該家族的標志性基序，如ARHGAP1的R282(保守序列為GIFR)。我們比對了本實驗所克隆的綿羊ARHGAP36和UniProt中目前收集的全部ARHGAP36氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)ARHGAP36在相當于ARHGAP1中的“精氨酸指”的保守精氨酸部位全都是蘇氨酸(T)(保守序列為GIFT)，即用蘇氨酸取代了精氨酸。為了檢查這個精氨酸被替換掉的現(xiàn)象在ARHGAP家族的其它成員中是否也存在，我們進一步比對了UniProt數據庫收錄的全部約40個ARHGAP成員在不同物種中的氨基酸序列，重點檢查了相當于ARHGAP1中的“精氨酸指”部位，發(fā)現(xiàn)各ARHGAP成員的直系同源基因的氨基酸序列非常保守，成員之間(旁系同源基因)的序列差異較大，但在相當于ARHGAP1的“精氨酸指”部位的氨基酸序列均很保守(表1)。從表1可以看出，所比對的38個ARHGAP成員中除了ARHGAP36外全都有“精氨酸指”(保守序列為*G**R*)結構，只有ARHGAP36的對應部位的精氨酸被蘇氨酸替換，暗示ARHGAP36的生物學功能并不需要酶催化活性。最近的一個報道也用氨基酸突變實驗證明了這個精氨酸替換和其它兩個與催化活性有關的氨基酸突變都不影響ARHGAP36激活Gli轉錄因子的作用，而其N末端可能與ARHGAP36的亞細胞定位與功能有關[30]。由此推測ARHGAP36可能并不以其催化活性發(fā)揮作用，也許是作為細胞信號通路的一個節(jié)點，目前也已經鑒定出ARHGAP36與sonic hedgehog (SHH) / patched (PTCH) 信號通路中的Sufu相互作用[30]，該信號通路與人的發(fā)育有關。

表1 多種動物的38個ARHGAP家族成員的“精氨酸指”基序的保守氨基酸序列比對結果

與ARHGAP右側平行的數字表示ARHGAP家族的成員序號；成員序號下方、“比對數目”右側的數字是本文所使用UniProt數據庫中對應的ARHGAP成員的物種數；其中ARHGAP16、37、38、41和43 5個成員在UniProt中還沒有預測的氨基酸序列。

有關ARHGAP36的生物學功能研究還沒有更多的報道，未見關于ARHGAP家族成員在配子發(fā)生過程中的表達與生物學功能的研究報道。本實驗室在檢測綿羊睪丸組織的轉錄物時發(fā)現(xiàn)該基因的mRNA片段，鑒于ARHGAP家族與細胞分裂有關[18]，生物信息學分析顯示ARHGAP36是唯一不具有“精氨酸指”的ARHGAP家族成員，因此可能并不具有催化活性，我們猜測ARHGAP36在精子發(fā)生過程中可能發(fā)揮某種特殊作用。綿羊睪丸總蛋白Western blot檢測發(fā)現(xiàn)綿羊睪丸內的ARHGAP36可能有3種長度(圖3B泳道2)，初步的免疫組織化學檢測證實ARHGAP36在精子發(fā)生過程中的細胞內均表達(圖3D)，目前尚不清楚睪丸內的ARHGAP36有何種功能，本實驗室正在研究它在睪丸中與哪種蛋白有相互作用。

4 結論

本文首次克隆了綿羊ARHGAP36的全長cDNA序列，并發(fā)現(xiàn)了該基因的第一外顯子在GenBank綿羊基因組序列組裝的錯誤。初步檢測了ARHGAP36蛋白在綿羊睪丸和精子發(fā)生過程細胞中的表達，為下一步深入研究ARHGAP36在精子發(fā)生過程中的作用奠定了基礎。

[1]Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology[J]. Nature, 2002, 420: 629-635.

[2]Ridley A J, Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors[J]. Cell, 1992, 70(3): 389-399.

[3]Ridley A J, Paterson H F, Johnston C L, et al. The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling[J]. Cell, 1992, 70(3): 401-410.

[4]Nobes C D, Hall A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia[J]. Cell, 1995, 81: 53-62.

[5]Welsh C F, Roovers K, Villanueva J, et al. Timing of cyclin D1 expression within G1 phase is controlled by Rho[J]. Nat Cell Biol, 2001(3): 950-957.

[6]Tcherkezian J, Lamarche-Vane N. Current knowledge of the large RhoGAP family of proteins[J]. Biol Cell, 2007, 99: 67-86.

[7]Lamarche N, Hall A. GAPs for rho-related GTPases[J]. Trends Genet, 1994, 10:436-440.

[8]Scheffzek K, Ahmadian M R, Wittinghofer A. GTPase-activating proteins: helping hands to complement an active site[J]. Trends Biochem Sci, 1998, 23: 257-262.

[9]Cerione R A, Zheng Y. The Dbl family of oncogenes[J]. Curr Opin Cell Biol, 1996, 8: 216-222.

[10]Olofsson B. Rho guanine dissociation inhibitors: Pivotal molecules in cellular signaling[J]. Cell Signal, 1999, 11: 545-554.

[11]Diekmann D, Brill S, Garrett M D, et al. Bcr encodes a GTPase-activating protein for p21rac[J]. Nature, 1991, 351: 400-402.

[12]Bernards A. GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila[J]. Biochim Biophys Acta, 2003, 1603: 47-82.

[13]Peck J, Douglas I V G, Wu C H, et al. Human RhoGAP domain-containing proteins: structure, function and evolutionary relationships[J]. FEBS Lett, 2002, 528: 27-34.

[14]Moon S Y, Zheng Y. Rho GTPase-activating proteins in cell regulation[J]. Trends Cell Biol, 2003, 13: 13-22.

[15]Gamblin S J, Smerdon S J. GTPase-activating proteins and their complexes[J]. Curr Opin Struct Biol, 1998, 8: 195-201.

[16]Graham D L, Eccleston J F, Lowe P N. The conserved arginine in rho-GTPase-activating protein is essential for efficient catalysis but not for complex formation with Rho.GDP and aluminum fluoride[J]. Biochemistry, 1999, 38(3): 985-991.

[17]Nassar N, Hoffman G R, Manor D, et al. Structures of Cdc42 bound to the active andcatalytically compromised forms of Cdc42GAP[J]. Nat Struct Biol, 1998, 5 (12): 1047-1052.

[18]Ligeti E, Welti S, Scheffzek K. Inhibition and termination of physiological responses by GTPase activating proteins[J]. Physiol Rev, 2012, 92: 237-272.

[19]Boissel L, Houssin N, Chikh A, et al. Recruitment of Cdc42 through the GAP domain of RLIP participates in remodeling of the actin cytoskeleton and is involved in Xenopus gastrulation[J]. Dev Biol, 2007, 312: 331-343.

[20]Kim J, Shim S, Choi S C, et al. A putative Xenopus Rho-GTPase activating protein (XrGAP) gene is expressed in the notochord and brain during the early embryogenesis[J]. Gene Expr Patterns, 2003, 3: 219-223.

[21]Tolias K F, Duman J G, Um K. Control of synapse development and plasticity by Rho GTPase regulatory proteins[J]. Prog Neurobiol, 2011, 94: 133-148.

[22]Mishima M, Glotzer M. Cytokinesis: a logical GAP[J]. Curr Biol, 2003, 13: R589-591.

[23]Hirose K, Nosaka T. Role of MgcRacGAP/Cyk4 as a regulator of the small GTPase Rho family in cytokinesis and cell differentiation[J]. Cell Struct Funct, 2001, 26: 645-651.

[24]Csépányi-K?mi R, Lévay M, Ligeti E. Small G proteins and their regulators in cellular signaling[J]. Mol Cell Endocrinol, 2012, 353: 10-20.

[25]Southgate L, Machado R D, Snape K M, et al. Gain-of-function mutations of ARHGAP31, a Cdc42/Rac1 GTPase regulator, cause syndromic cutis aplasia and limb anomalies[J]. Am J Hum Genet, 2011, 88(5): 574-585.

[26]Miyake N, Chilton J, Psatha M, et al. Human CHN1 mutations hyperactivate alpha2-chimaerin and cause Duane's retraction syndrome[J]. Science, 2008, 321(5890): 839-843.

[27]Kutsche K, Werner W, Bartsch O, et al. Microphthalmia with linear skin defects syndrome (MLS): a male with a mosaic paracentric inversion of Xp[J]. Cytogenet Genome Res, 2002, 99 (1-4): 297-302.

[28]Prakash S K, Gibson C W, Wright J T, et al. Tooth enamel defects in mice with a deletion at the Arhgap 6/Amel X locus[J]. Calcif Tissue Int, 2005, 77 (1): 23-29.

[29]Jackson P J, Larson J D, Beckmann D A, et al. The role of Arhgap36 as a novel driver in high-risk human medulloblastoma. Abstracts from the 4th Quadrennial Meeting of the World Federation of Neuro-Oncology held in conjunction with the 18th Annual Meeting of the Society for Neuro-Oncology[M]. San Francisco, California, 2013, CB-032.

[30]Rack P G, Ni J, Payumo A Y, et al. Arhgap36-dependent activation of Gli transcription factors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014 [Epub ahead of print]

[31]Archibald A L, Cockett N E, Dalrymple B P, et al. The sheep genome reference sequence: a work in progress[J]. Anim Genet. 2010, 41(5): 449-453.

[32]Barrett T, Xiao B, Dodson E J, et al. The structure of the GTPase-activating domain from p50 rhoGAP[J]. Nature, 1997, 385: 458-461.

[33]Rittinger K, Walker P A, Eccleston J F, et al. Crystal structure of a small G protein in complex with the GTPase-activating protein rhoGAP[J]. Nature, 1997, 388(6643): 693-697.

Molecular cloning of the sheep ARHGAP36 full length cDNA and the protein distribution in seminiferous tubules

BAI Xue, WANG Lian-qing, XING Wan-jin

(School of Life Sciences, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

ARHGAP36, a member of Rho GAP(GTPase-activating proteins) family, is over expressed in medulloblastoma, and thus may be implicated in regulation of cell proliferation. To elucidate its function in sheep spermatogenesis, the full length cDNA of sheep ARHGAP36 was cloned using RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique from sheep testicular tissue. A cDNA of 2698 bp was obtained after joining the 5′-and 3′ RACE fragments with the middle region cloned and sequenced independently. An ORF (open reading frame) of 1593 bp encoding a peptide of 530 aa with a homology of 98% with the predicted cattle ARHGAP36 (A7MB27) in the UniProt was found in this cDNA. Analysis of the all predicted amino acid sequence of ARHGAP36 and other ARHGAP members from various animals collected in the UniProt showed that this ARHGAP36 lacked the conserved arginine residue (it is replaced with a threonine) in the "arginine finger", which was a hallmark motif of the Rho GAP family, suggesting the catalytic function may not be required for ARHGAP36. By aligning the cDNA to the predicted sheepArhgap36 gene sequence (Gene ID: 100913153) in GenBank, a criticalshort gap was also found in the first exon which will led to incapability of deducing a correct sheep ARHGAP36 amino acid sequence. Thus, the results provided a correct sheep ARHGAP36 cDNA for the further research on the function of this unique Rho GAP family member. Detection of the total protein of sheep testis by Western blot and tissue sections of sheep testis by Immunohistochemistry using anti-ARHGAP36 polyclonal antibody as the primary antibody indicated that ARHGAP36 protein might have three forms of various lengths in testis and exists in nearly all types of the cells during spermatogenesis in sheep seminiferous tubules.

sheep; ARHGAP36; cDNA cloning; RACE; immunohistochemistry

2014-08-27；

2014-09-29

國家自然科學基金項目(31460600)；內蒙古自然科學基金項目(2012MS0401)

白雪，研究方向為分子遺傳學，E-mail：120218099@qq.com；

邢萬金，博士，教授，博士研究生導師，研究方向為分子遺傳學，E-mail: xwanjin@imu.edu.cn。

Q751；S826

A

2095-1736(2015)02-0001-07

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.001