熒光偏振檢測西北地區(qū)宮頸病變組織中HPV感染分型的研究*

武警陜西省總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710054)

劉征麗 張 菊△ 張 濰◇ 高艷娥◆

·臨床研究·

熒光偏振檢測西北地區(qū)宮頸病變組織中HPV感染分型的研究*

武警陜西省總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710054)

劉征麗 張 菊△張 濰◇高艷娥◆

目的：分析西北地區(qū)宮頸疾病組織標(biāo)本中感染HPV病毒型別的分布與患者疾病病程和年齡的關(guān)聯(lián)性。方法：分別提取425例西北地區(qū)宮頸疾病組織DNA，GP5+/GP6+非對稱擴(kuò)增熒光偏振檢測方法檢測每例宮頸疾病標(biāo)本組織 DNA的15種HPV型別,統(tǒng)計分析HPV型別檢測結(jié)果。結(jié)果：425例CIN及宮頸癌組織標(biāo)本中,417例檢測出HPV感染,感染率為98%。其中HPV16型感染101例,HPV11型感染69例,HPV6型感染56例,HPV18型感染51例,多重HPV型別感染39例。CIN I級中,高危型HPV感染陽性率為27.3%,CIN II級中,高危型HPV感染陽性率為65.1%,CIN III級中,高危型HPV感染陽性率為65%；宮頸癌中,高危型HPV感染陽性率高達(dá)70%。CIN III級中,多重HPV感染陽性率為16.8%；宮頸癌中,多重HPV感染陽性率達(dá)16%。不同年齡組,低危型HPV檢測陽性率差異較大。結(jié)論：本研究中,宮頸疾病標(biāo)本中HPV感染率為98%，其中，高危型和多重感染在高CIN級別、宮頸癌及60歲以上組中的感染率呈上升趨勢，提示HPV感染型別與病程和年齡有一定關(guān)聯(lián)。

宮頸癌是目前世界上危害女性健康的第二大疾病,目前的研究已經(jīng)證明,高危型人乳頭瘤病毒(HPV) 持續(xù)感染是導(dǎo)致癌前病變,形成宮頸癌的主要致病因素。高達(dá)99.7%的宮頸癌組織中存在人乳頭瘤病毒(HPV)感染。篩查和阻斷HPV感染是目前宮頸癌早期預(yù)防的重要方向[1]。本研究應(yīng)用熒光偏振技術(shù)檢測并分析西安地區(qū)三所醫(yī)院婦科經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為宮頸癌和 CIN的患者組織標(biāo)本中感染HPV病毒型別的分布及其與疾病進(jìn)程、患者年齡關(guān)聯(lián)性,研究HPV-DNA型和不同亞型復(fù)合感染在宮頸癌和CIN中的感染率,以分析本地區(qū)宮頸癌和宮頸病變中的優(yōu)勢感染型別,為指導(dǎo)西北地區(qū)宮頸癌的預(yù)防和個體化治療提供思路和分子診斷方法。

材料與方法

1 對 象 2010年3月至2014年3月,就診于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、西安交通大學(xué)第二醫(yī)院、武警陜西總隊醫(yī)院的425例宮頸癌和CIN患者,年齡19～68歲,宮頸癌患者51例,CIN患者374例,其中CIN I期56 例，CIN II期173例，CIN III期145例。所有患者均知情同意，并經(jīng)過院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 儀器與試劑 熒光偏振檢測儀Wallac Victor 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer),基因組DNA提取試劑盒,普通質(zhì)粒小提試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs購自Progema；分別含HPV L1 區(qū)域的pGEM-T-HPV16、pGEM-T-HPV18、pGEM-T-HPV31、pGEM-T-HPV33、pGEM-T-HPV35、pGEM-T-HPV39、pGEM-T-HPV42、pGEM-T-HPV34、pGEM-T-HPV45、pGEM-T-HPV 51、pGEM-T-HPV56、pGEM-T-HPV58、pGEM-T-HPV52 質(zhì)粒對照標(biāo)準(zhǔn)品由第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系全軍基因診斷技術(shù)研究所提供[2]。

3 實驗方法 ①DNA提?。好坷颊邔m頸標(biāo)本均分成兩部分：一部分用于病理組織學(xué)鑒定，另一部分用于分子生物學(xué)分析。后一部分組織 DNA 提取嚴(yán)格按照TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒說明書操作進(jìn)行，產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度計測量純度和濃度后放置于-20℃保存。DNA溶于10μl Tris-HCl (1 mmol/L, pH 8.0)，存于-20℃，用于后續(xù)檢驗。②引物與探針：15種常見HPV型別：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 42、HPV 34、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56和HPV58是我國人群最常見的宮頸致病型別[3]。15型高危HPV通用引物和特異探針序列參照文獻(xiàn)[3]，由上海生工生物工程有限公司合成。GP5+ 5‘-tttgttactgtggtagataccactc-3’，GP6+ 5‘-gaatatgatttacagtttatttttc-3’。③標(biāo)本的HPV非對稱擴(kuò)增熒光偏振分型檢測：以提取的宮頸CIN或?qū)m頸癌組織DNA為模板，參照文獻(xiàn)[2-3]，應(yīng)用非對稱擴(kuò)增熒光偏振檢測方法檢測每例宮頸癌或CIN標(biāo)本組織DNA的15種常見HPV型別：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 42、HPV 34、HPV 45、HPV 51、HPV 56、HPV58和HPV 52型。首先，GP5+/GP6+通用引物非對稱擴(kuò)增：反應(yīng)體系(100μl): 模板DNA 10μl，3.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.01uM GP5+上游引物，0.1uM GP6+下游引物，2.0U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性 5min，94℃ 60s，45℃ 60s，72℃ 60s，40循環(huán)，最后94℃ 60s，45℃ 60s。然后，20μl非對稱擴(kuò)增產(chǎn)物與每組中各1.8nM 3種型特異探針溶液250μl混合，48℃孵育30min，冷卻至室溫于熒光偏振檢測儀檢測每個反應(yīng)的熒光偏振值。每例標(biāo)本的非對稱擴(kuò)增產(chǎn)物共分5組行熒光偏振雜交分型檢測。FAM (6-carboxy-fluorescein)檢測的激發(fā)光波長485nm，吸收光波長530nm，TAMRA (tetramethyl-6-carboxyrhodamine)檢測的激發(fā)光波長535nm，吸收光波長590nm，ROX (b-carboxy-x-rhodamine)檢測的激發(fā)光波長580nm，吸收光波長620nm。將pGEM-T-HPV6、pGEM-T-HPV11、pGEM-T-HPV16、pGEM-T -HPV18、pGEM-T-HPV31、pGEM-T-HPV33、pGEM-T-HPV35、pGEM-T-HPV39、pGEM-T-HPV42、pGEM-T-HPV34、pGEM-T-HPV45、pGEM-T-HPV 51、pGEM-T-HPV56、pGEM-T-HPV58、pGEM-T-HPV52 質(zhì)粒對照標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本DNA分別按以上條件進(jìn)行檢測。每例均重復(fù)3次。檢測分析FP值以確定樣本的病毒型。

4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，t檢驗分析相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HPV分型的熒光偏振檢測結(jié)果 見表1。425例CIN及宮頸癌組織標(biāo)本中，417例檢測出HPV感染，感染率為98%。其中HPV16型感染101例,占24.2%,是本研究中感染率最高的一型,以下依次為HPV11型感染69例,占16.5%,HPV6型感染56例,占13.4%,HPV18型感染51例,占12.2%,多重HPV型別感染39例,占9.4 %。7例CIN及1例宮頸癌未檢測出HPV感染。

2 高危HPV病毒型別與疾病進(jìn)程關(guān)聯(lián)性 見表1。各級CIN及宮頸癌中，高危型HPV感染陽性率為60.7%，多重HPV感染陽性率為9.4%。各級別CIN中,感染隨CIN級別的增高,高危型HPV的感染率呈上升趨勢,CINI級中,高危型HPV感染陽性率為27.3%,CINII級中,高危型HPV感染陽性率為65.1%,CINIII級中,高危型HPV感染陽性率為65%；宮頸癌中,高危型HPV感染陽性率高達(dá)70%。多重感染在高CIN級別及宮頸癌中的感染率也呈上升趨勢,CINIII級中,多重HPV感染陽性率為16.8%；宮頸癌中,多重HPV感染陽性率達(dá)16%。56例低危型HPV6陽性患者中,CINI感染率占30.3%,宮頸癌感染率僅占7%；69例低危型HPV11陽性患者中,CINI感染率占33.3%,宮頸癌感染率僅占4.3%。

表1 HPV各病毒型別感染與宮頸病變病程[n(%)]

3 高危HPV病毒型別與患者年齡關(guān)聯(lián)性 見表2。各年齡組中,17～40歲組,低危型HPV檢測陽性率為35.2%；41～60歲組,低危型HPV檢測陽性率為24.5%；60歲以上組,低危型HPV檢測陽性率僅為11.9%,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),提示高危型HPV感染率隨年齡增加有所提高。17～40歲組，復(fù)合感染HPV檢測陽性率為10%，41～60歲組，復(fù)合感染HPV檢測陽性率為7.9%，60歲以上組，復(fù)合感染HPV檢測陽性率為9.5%，各年齡組間無顯著差異(P>0.05)。

表2 HPV各病毒型別感染與患者年齡

討 論

宮頸癌是危害女性健康的第二大常見腫瘤,是造成發(fā)展中國家女性死亡的主要病因[4]。宮頸癌發(fā)病原因復(fù)雜,潛伏期可長達(dá)10年之久,高危型HPV病毒持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的致病因素,HPV病毒型眾多,基因序列的復(fù)雜性決定了致病作用的復(fù)雜性,高危型HPV病毒的E6/E7癌基因表達(dá),使宿主細(xì)胞生長調(diào)節(jié)失控,轉(zhuǎn)化為永生細(xì)胞,在致癌因素的協(xié)同下導(dǎo)致癌變發(fā)生[5-7]。HPV基因型的檢測既是預(yù)測婦女宮頸病變的風(fēng)險標(biāo)志物，也將是基于HPV基因型別不同而采用不同的針對性的免疫和放化療治療方法的基礎(chǔ)，將對未來宮頸癌的阻斷性干預(yù)預(yù)防和靶向治療效果有重要影響。

本文研究西安地區(qū)確診的宮頸癌和CIN患者中HPV DNA檢出率為98%，其中，高危型HPV感染陽性率為60.7%,多重HPV感染陽性率為9.5%。我們發(fā)現(xiàn)：在本地區(qū)宮頸癌及癌前病變患者呈顯著年輕化趨勢,隨病變惡性程度的增高,高危型HPV和多重HPV感染的感染率呈上升趨勢,進(jìn)一步證實了 HPV感染在宮頸病變發(fā)生發(fā)展中的重要作用。HPV基因型別的研究結(jié)果存在地域差異,在本地區(qū)HPV單一型感染中,以HPV11、16、18、52、58型感染率最高,其次是多重HPV感染,其中高危HPV 16感染率位居第一。本研究還將患者人群按年齡分為3組：19～40歲、41～60歲、60歲以上。60歲以上組,高危型和多重HPV檢測陽性率達(dá)88.1%,具有統(tǒng)計學(xué)差異,提示高危型HPV感染率隨年齡增加有顯著提高,表明HPV感染各年齡段分布不同,年齡可能是影響HPV感染型的重要因素,高齡感染患者的癌變率可能更高。

積極推進(jìn)宮頸HPV感染型篩查普及,掌握本地區(qū)優(yōu)勢感染型別,以便及早發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染人群,及早治療CIN患者，阻止HPV感染的傳播,對于阻止宮頸癌的發(fā)生發(fā)展,降低本地區(qū)宮頸癌發(fā)病率和病死率有重要意義。本研究綜合研究分析了西安地區(qū)宮頸癌中HPV感染分型及其與疾病病程和年齡的分布與關(guān)聯(lián)性，提示了HPV感染型別與疾病病程和年齡的顯著相關(guān)性,將為本地區(qū)宮頸疾病的防治、對病變患者針對性的實施阻斷干預(yù)和靶向治療、改善預(yù)后提供重要的臨床依據(jù),對于宮頸癌的預(yù)后分析和針對性、預(yù)見性個體化治療也具有重要的指導(dǎo)意義。

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(收稿：2014-08-19)

The detection of human papillomavirus genotypes with fluorescence polarization assay in North-Western China’s Patients Cervical Tissue

The Armed Police Corps Hospital of Obstetrics and Gynecology in Shaanxi Province(Xi’an 710054)

Liu Zhengli Zhang Ju Zhang Wei et al

Objective：To detect HPV genotypes in cervical tissue samples and to investigate the relationships between HPV genotypes and the clinical stage, age of patients. Methods：15 HPV genotypes in 425 cervical cancer tissue samples were detected by GP5+/6+ PCR and hybridization with fluorescence polarization assay. HPV genes in samples were amplified by GP5+/6+ PCR. Fifteen HPV genotypic probes labeled with fluorophores hybridized with target PCR product to identify the presence of specific HPV genotypes. The relationships between HPV genotypes and the clinical stage, age of patients were analyzed by SPSS17.0 and t test. Results：417 of 425 cervical tissue samples were HPV positive. 101 cervical tissue samples were HPV16 positive. 69 cervical tissue samples were HPV11 positive. 56 cervical tissue samples were HPV6 positive. 51 cervical tissue samples were HPV18 positive. 39 cervical tissue samples were multiple-HPV positive. The infection rates of high-risk HPV were 65% and 70%in CINIII and cervical cancer respectively. The infection rates of multiple-HPV were 16.8% and 16% in CINIII and cervical cancer respectively. The infection rates of low-risk HPV were 35.2%，24.5% and 11.9% in 17-40years, 41-60 years and beyond 60 years group respectively. Conclusion：This study suggested a possible relationship between HPV infection and cervical disease. The infection rates of HPV are 98%. The infection rates of high-risk and multiple HPV increased in CINIII, cervical cancer and beyond 60 years group.

Uterine cervical neoplasms Papillomavirus infections Fluorescence polarization immunoassay

*國家自然科學(xué)基金項目(81071435，81371891)

△第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系基因診斷技術(shù)研究所

◇第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科

◆西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

子宮頸腫瘤 乳頭狀瘤病毒感染 熒光偏振免疫測定

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.012