地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響*

王 倩 范文濤 賀又舜

湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長沙 410208)

地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響*

王 倩△范文濤△賀又舜

湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長沙 410208)

目的：探討地黃飲子對大鼠海馬腦片SDF-1蛋白的影響。方法：SD大鼠18只，用乙醚麻醉大鼠，分離海馬組織，培養(yǎng)2周后，分為對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)。采用地黃飲子含藥血清培養(yǎng)海馬腦片，觀察地黃飲子含藥血清對海馬腦片SDF-1的影響。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)用地黃飲子含藥血清培養(yǎng)大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組比較具有顯著差異，說明地黃飲子能促進(jìn)缺血區(qū)SDF-1的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)低氧低糖區(qū)腦組織神經(jīng)再生能力。結(jié)論：地黃飲子含藥血清能有效提高缺血缺氧區(qū)腦片SDF-1含量，進(jìn)一步改善腦組織缺血缺氧能力，通過SDF-1/CXCR4信號通路促進(jìn)腦組織神經(jīng)再生能力。

在正常情況下的神經(jīng)干細(xì)胞處在休眠狀態(tài)，只有在一定的信號條件下才可以被激活。腦缺血時,海馬、側(cè)腦室室管膜下區(qū)以及腦皮層可增殖的神經(jīng)干細(xì)胞被炎癥刺激激活，進(jìn)一步遷移到缺血損傷區(qū)，分化成神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，創(chuàng)建新的神經(jīng)連接。新生的神經(jīng)細(xì)胞可以替代損傷的神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)功能缺損。這表明,內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞具有修復(fù)缺血性腦損傷的能力。因?yàn)橥ㄟ^激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞所獲得的神經(jīng)干細(xì)胞有限，數(shù)量較少，同時調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞遷移、分化的激活因子不足，最終導(dǎo)致自身不能修復(fù)神經(jīng)功能缺損。本文研究地黃飲子通過調(diào)控SDF-1蛋白進(jìn)一步促神經(jīng)再生的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 動 物 新生6～9 d健康SD大鼠18只，清潔級，雌雄不拘，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK2012-003。

1.2 藥 物 中藥地黃飲子以《黃帝素問·宣明論方》所載地黃飲子藥味和比例配制：熟地黃、白茯苓、菖蒲各12g，巴戟天、 山茱萸、石斛、肉蓯蓉、麥門冬、炮附子各15g(先煎)， 官桂、 五味子、遠(yuǎn)志各10g。

根據(jù)2010 年版《中國藥典》選擇中藥材飲片：藥材飲片購買于陜西省西安市中藥飲片有限責(zé)任公司，飲片經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室鑒定為道地藥材。按組方配伍比例精確稱取，加入12倍重量的自來水，先泡40min，再大火煎煮10min，小火煎煮30min，留取藥液；再次加入12倍重量的自來水，再大火煎煮10min，小火煎煮30min，留取藥液；然后將2次所取藥液混合，裝入容量瓶成為地黃飲子煎劑。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮后，定容裝入玻璃凍干瓶冷凝干燥，干燥條件：-55℃，真空度：<10 Pa，時間：24 h。計(jì)算凍干粉獲得率，最后裝入密閉玻璃容器中密封保存。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養(yǎng)基、馬血清、噻唑藍(lán)(MTT)、 抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體、焦油紫均購于、兔抗SDF-1α、CXCR4多克隆抗體、生物素化二抗、辣根過氧化酶標(biāo)記、膜插件、 體視顯微鏡、振動切片機(jī)、電位記錄系統(tǒng)、顯微鏡、 細(xì)胞培養(yǎng)箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 地黃飲子含藥血清制備 采用大腦中動脈線拴法復(fù)制腦缺血模型。造模成功后灌服地黃飲子藥液每次2mL，劑量換算方法按照體表面積相當(dāng)于正常成年人70Kg體重劑量的3倍，換算為大鼠的用藥劑量約為每公斤體重灌服生藥量14.5g。治療第7天給藥后斷頭處死動物，收集大鼠的血液，離心分離血清，放入溫度為56℃水浴中滅活30min，采用0.22μm濾器進(jìn)行過濾，分裝并放置于-20℃的冰箱中備用。

2.2 海馬腦片培養(yǎng) 用乙醚麻醉大鼠，至于無菌環(huán)境，斷頭取出腦組織，放入含糖濃度為7.5 g/L的HBSS溶液中，溫度保持在4℃，分離出海馬組織。放在表面鋪有3%瓊脂的活組織切片機(jī)上，采用冠狀面切開腦組織，切成厚度約400μm的腦片。再將腦片放入6孔培養(yǎng)板的微孔濾膜上，培養(yǎng)板浸泡在培養(yǎng)液中。每個培養(yǎng)板含有6孔，每孔放置腦片6張，培養(yǎng)液含有5%CO2，溫度為37℃。將培養(yǎng)板放入平衡濕度的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為2周。

2.3 分 組 培養(yǎng)分組：培養(yǎng)2周后，分為對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)。采用的培養(yǎng)液成分:25%HBSS、50%MEM、23%馬血清、0.75%葡萄糖、0.5%谷氨酰胺、2%雙抗。

2.4 地黃飲子含藥血清海馬腦片培養(yǎng) 海馬腦片培養(yǎng)2周后，在培養(yǎng)板各腦片培養(yǎng)液中加入0.1 mmol/L PI 90μL，在將培養(yǎng)板放置于溫度37℃、5%CO2、平衡濕度的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱內(nèi)1 h。然后在倒置顯微鏡下觀察并挑選無特異性，PI熒光顯色較好腦片。經(jīng)過篩選的腦片，對照組(HOTC組)加入正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為溫度37℃，并將腦片放置于含有5%CO2、平衡濕度的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。低氧缺糖組(OGD組)腦片加入無糖平衡鹽溶液(pH 7.4)做為培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為溫度37℃，并將腦片放置于含有5%CO2、1%O2的缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。兩組腦片均放置1h，之后兩組均加入地黃飲子含藥血清，放置于正常培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24h。最后兩組均加入PI，放置于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，用熒光倒置顯微鏡觀察，并拍照記錄。

2.5 組織切片制備 對照組(HOTC組)和低氧缺糖組(OGD組)腦片在普通培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)24h后，分別用4%多聚甲醛固定、浸糖，再用冰凍切片機(jī)從冠狀面切片，切片厚度約20μm，再進(jìn)行免疫組化染色備用。

2.6 免疫組化染色(ABC法) 腦切片采用0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。再用1% H2O2在溫室孵育30min，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。加入10%羊血清封閉1 h，不洗滌。分2次加入CXCR4兔抗多克隆抗體(1∶500)和兔抗SDF-1α多克隆抗體(1∶500)。陰性組腦片采用0.01mol/L PBS代替一抗，在溫度4℃下孵育48 h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。再加入生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，在溫度4℃下孵育12h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素復(fù)合物(1∶200)，在溫度4℃下孵育12h，0.01mol/L PBS漂洗，每次漂洗5min，共3次。采用DAB/H2O2顯色5～10min，電鏡下檢測顯色的程度，用自來水反復(fù)沖洗10次以終止。最后采用乙醇梯度脫水，封蓋玻片以鏡下觀察。

2.7 Western blot檢測 實(shí)驗(yàn)中取兩組腦片，分別是HOTC組、OGD組，兩組腦片按照每100mg的腦片分別加入1ml的勻漿液并充分?jǐn)嚢鑴驖{，在溫度4℃離心機(jī)以12 000轉(zhuǎn)/min，離心10min，取上清液并進(jìn)行分裝，存入-80℃的冰箱中備用。按Lowry et al的方法，采用小牛血清蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白，進(jìn)一步測定蛋白含量。再按照Gu et al方法，取等量的蛋白做為樣品待檢。用經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，在經(jīng)過5%脫脂奶粉封閉約1h，加入一抗(兔抗SDF-1抗體，兔抗CXCR4抗體)，在溫度4℃下放置24h。用洗滌緩沖液洗膜，然后添加熒光素和生物素標(biāo)記的兩種抗體，在溫度為37℃溫孵1h，2min后洗膜。在采用電鏡觀察，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)記錄分析結(jié)果。

2.8 圖像及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)獲得的免疫組化切片均在電鏡下采用圖像成像及分析系統(tǒng)進(jìn)行成像及分析。數(shù)據(jù)采用表示，用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析 3.1 采用Westernblot方法檢測HOTC組、OGD組大鼠海馬腦片SDF-1/CXCR4的變化 各組大鼠腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量測定，地黃飲子含藥血清培養(yǎng)大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組相比差異有顯著性意義的(P<0.05)。

組 別SDF?1CXCR4OGD組3．56±0．38△0．87±0．52△HOTC組1．82±1．210．36±1．03

注：與模型組比較△P<0.05

3.2 Western blot檢測大鼠腦片海馬區(qū)SDF-1

圖1 OGD組腦片海馬區(qū)SDF表達(dá)，OGD組海馬區(qū)SDF升高，陽性細(xì)胞數(shù)量增多。

圖2 HOTC組腦片海馬區(qū)SDF表達(dá)，HOTC組海馬區(qū)SDF升高不明顯，陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。

4 討 論 最新研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元信息傳遞。SDF-1mRNA和神經(jīng)元CXCR4共同分布在腦組織相同部位，SDF-1具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)在局灶性腦缺血的大腦皮層中，SDF-1含量在腦缺血前2日含量持續(xù)升高[1]。研究表明，SDF-1可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、粘附、遷移和歸巢。在缺血性腦卒中大鼠實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組化方法觀察到第一個月和第四個月腦缺血邊緣SDF-1的表達(dá)水平顯著高于對側(cè)腦SDF-1對應(yīng)的部分。對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞起到誘導(dǎo)遷移并分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用[2]。腦缺血后炎癥因子刺激，引起海馬區(qū)及大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移，同時受神經(jīng)生長因子及抑制因子的影響，促進(jìn)損傷區(qū)對遷移中的神經(jīng)干細(xì)胞捕獲，在損傷區(qū)域分化成神經(jīng)元，建立神經(jīng)神經(jīng)連接，修復(fù)神經(jīng)損傷[3]。實(shí)驗(yàn)研究表明， SDF-1能夠促進(jìn)神經(jīng)損傷區(qū)刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移。同時，損傷區(qū)的細(xì)胞生長因子可以進(jìn)一步促進(jìn)缺血區(qū)對神經(jīng)干細(xì)胞的捕獲，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)損傷[4]。

SDF-1蛋白的受體是CXCR4，CXCR4具有7個跨膜結(jié)構(gòu)，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，通常存在于細(xì)胞膜的表面，部分也存在于細(xì)胞胞漿中。SDF-1及其受體CXCR4廣泛存在于人體多種細(xì)胞及組織中，主要存在于腦、心臟、肺臟、脾臟、肝臟。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用[5]。近年來的研究證實(shí)，SDF-1/CXCR4信號通路在神經(jīng)干細(xì)胞遷移及歸巢、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)再生等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞具有增殖分化潛能，能分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[6]。在正常情況下，他們在休息狀態(tài)，只有在一定的信號可以激活刺激。腦缺血時,海馬、大腦皮層等區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞開始增殖，進(jìn)一步遷移，分化為神經(jīng)元，建立新的神經(jīng)連接，替代損傷區(qū)神經(jīng)，促進(jìn)缺血區(qū)神經(jīng)修復(fù)[7]。這表明,內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞具有修復(fù)缺血性腦損傷的能力。然而，因?yàn)橥ㄟ^激活干細(xì)胞數(shù)量上的缺乏，導(dǎo)致腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量不足，同時調(diào)節(jié)新生神經(jīng)元遷移、分化的促進(jìn)因子分泌不足，最終導(dǎo)致自身修身神經(jīng)損傷效果不佳。最近發(fā)現(xiàn)，SDF-1可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞突觸傳遞。SDF-1與其受體分布在相同的腦區(qū)，SDF-1具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能，可通過SDF-1/CXCR4信號通路進(jìn)一步調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞遷移[8]。本研究發(fā)現(xiàn)用地黃飲子含藥血清培養(yǎng)大鼠腦片，能明顯提高缺血、缺氧組腦片SDF-1蛋白、CXCR4含量，與對照組比較具有顯著差異，說明地黃飲子能促進(jìn)缺血區(qū)SDF-1的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)低氧低糖區(qū)腦組織神經(jīng)再生能力。地黃飲子含藥血清能有效提高缺血缺氧區(qū)腦片SDF-1含量，進(jìn)一步改善腦組織缺血缺氧能力，通過SDF-1/CXCR4信號通路促進(jìn)腦組織神經(jīng)再生能力。

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(收稿2014-10-11；修回2014-11-08)

Effect of Dihuang Yinzi protein on hippocampal slices of SDF-1 in rats

Hunan University of Chinese Medicine(Changsha 410208)

Wang Qian Fan Wentao He Youshun

Objective：To study Dihuang Yinzi protein in rat hippocampal slices of SDF-1. Methods：18 SD rats, rats with ether anesthesia, separation of hippocampus, training 2 weeks later, divided into the control group (group HOTC) and low oxygen lack of sugar group (OGD group). Using Dihuang Yinzi drug-containing serum cultured hippocampal slices, observation of Dihuang Yinzi drug-containing serum affect hippocampal slices of SDF-1. Results：The study found that with Dihuang Yinzi drug-containing serum training rats, can significantly improve the ischemia and hypoxia of brain slice of SDF-1 and CXCR4 protein content, compared with the control group with significant difference, Dihuang Yinzi can promote the expression of ischemia area SDF-1, to further promote the low oxygen sugar area brain nerve regeneration ability. Conclusion ：DiHuang YinZi medicated serum can effectively improve the ischemia anoxic zone slices SDF-1 content and further improve the cerebral ischemic anoxia ability, through the SDF-1/CXCR4 signaling pathway to promote brain nerve regeneration.

@Dihuang Yinzi Animal,experiment Rats

*陜西省科技廳資助項(xiàng)目(2012k19-05-04)

@地黃飲子 動物，實(shí)驗(yàn) 大鼠

R563

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.058

△陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)