大連地區(qū)耳聾人群常見聾病基因突變的研究

牟書瑜，劉 琳，崔 玲，趙黎陽，柏 樺，別 旭，孫秀珍

(1.大連市友誼醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116001; 2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116027)

大連地區(qū)耳聾人群常見聾病基因突變的研究

牟書瑜1，劉 琳1，崔 玲1，趙黎陽1，柏 樺1，別 旭2，孫秀珍2

(1.大連市友誼醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116001; 2.大連醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 大連 116027)

目的 篩查分析大連地區(qū)耳聾人群中4個耳聾基因的9個位點的突變攜帶及分布狀況，以探討大連地區(qū)耳聾患者常見聾病基因突變特點及發(fā)病率。方法 采用基因芯片檢測5 266例耳聾患者4個聾病基因中常見的9個位點：GJB2基因的35delG、176del16、235delC和299delAT，SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G，線粒體DNA(mtDNA)12SrRNA基因的1555A>G和1494C>T，GJB3基因的538C>T。采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 大連地區(qū)5 266例耳聾人群中，發(fā)現(xiàn)攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的患者1 416例(26.89%，1 416/5 246)，其中GJB2基因突變攜帶者657例(12.48%，657/5 266)，SLC26A4基因突變攜帶者512例(9.72%，512/5 266)，mtDNA 12S rRNA線粒體基因突變攜帶者239例(4.54%，239/5 266)，GJB3基因突變攜帶者8例(0.15%，8/5 266)。結(jié)論 應(yīng)用基因芯片可以高效、快速地在大樣本人群中，尤其是聾人群體中進行大規(guī)模的基因篩查；大連地區(qū)耳聾人群攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的發(fā)生率均較低。

耳聾;基因芯片;篩查; GJB2;SLC26A4;mtDNA12SrRNA;GJB3

無論是先天性還是遲發(fā)性的聽力下降，都有一定的遺傳因素作用，聾病基因芯片的研制成功，為進一步了解耳聾的本質(zhì)提供了方便。北京博奧生物有限公司研制的聾病基因芯片[1]可一次性檢出GJB2、PDS、GJB3和線粒體共4個基因9個位點的突變情況。本研究應(yīng)用該系統(tǒng)對大連市耳聾殘疾人群進行檢測，以了解常見聾病基因在大連地區(qū)耳聾人群中的分布，對部分人群給出基因診斷，并在婚育方面給予指導，以避免再生或降低其后代發(fā)生遺傳性耳聾的幾率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

來源于大連市殘疾人聯(lián)合會的持證聽力殘疾患者5 266例，其中男2 899 例，女2 367例，年齡最小1歲，最大90歲，平均(42.51±17.60)歲，所有患者均為持有大連市頒發(fā)的聽障殘疾證，一至四級，均來自大連市各區(qū)及縣，所有患者均在醫(yī)生指導下填寫“耳聾病人信息登記”，獲取耳聾相關(guān)信息，包括一般信息、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個人史(包括耳聾前傳染病史、耳毒性藥物應(yīng)用史、外傷史等)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因檢測內(nèi)容：所有受檢者均接受了常見聾病基因檢測，包括：GJB2基因的35delG、176del16、235delC和299delAT，GJB3基因的538C>T，線粒體DNA(mtDNA)12SrRNA基因的1555A>G和1494C>T，SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G。

1.2.2 DNA制備方法：用含有EDTA抗凝劑的采血管采集受檢者3 mL外周靜脈血，應(yīng)用康為世紀 CW0544 血液基因組非柱式提取試劑盒提取人全血基因組，提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進行。-20 ℃保存并在1個月內(nèi)完成基因檢測。

1.2.3 基因芯片檢測：(1)PCR 擴增：在模板加樣區(qū)內(nèi)，向相對應(yīng)的 A、B 系列試劑中分別加入 3 μL同一樣本核酸溶液，按照遺傳性聾病基因檢測 PCR 擴增程序進行 PCR 擴增；將離心管或八連排管置于 PCR 擴增儀中，按晶芯?E-CyclerTM 96 PCR 儀標準操作規(guī)程進行 PCR 擴增反應(yīng)；總反應(yīng)時間約為 3 小時 20 分。(2)芯片雜交：按照晶芯?BioMixer II 芯片雜交儀標準操作規(guī)程設(shè)定雜交程序。(3)掃描判讀：使用晶芯?LuxScan TM 10K/B 微陣列芯片掃描儀和晶芯?9項遺傳性耳聾基因檢測芯片判別系統(tǒng)進行信號的讀取及結(jié)果判斷。本方法檢測對象為遺傳性耳聾相關(guān)基因突變位點，共計 9 個。

2 結(jié) 果

5 266例耳聾患者中，發(fā)現(xiàn)攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的患者1 416例(26.89%，1 416/5 266)，其中GJB2基因突變攜帶者657例(12.48%，657/5 266)，SLC26A4基因突變攜帶者512例(9.72%，512/5 266)，mtDNA 12S rRNA線粒體基因突變攜帶者239例(4.54%，239/5 266)，GJB3基因突變攜帶者8例(0.15%，8/5 266)。

3 討 論

耳聾是一種很普遍的感音神經(jīng)功能紊亂，受到社會和經(jīng)濟的影響。在世界范圍內(nèi)，先天性耳聾的患病率大概為1～3/1 000，包括已知的許多由遺傳和環(huán)境引起的耳聾，在中國每年有30 000個患有先天性聽力損害的嬰兒出生，在語前聾患者中，60%的患者是遺傳性耳聾。目前已知的非綜合征性耳聾突變位點已經(jīng)有133個，克隆的基因達40多個，博奧生物有限公司研制的耳聾基因芯片涵蓋部分臨床常見的耳聾基因，用于大樣本基因篩查有較大的實用意義。

3.1 GJB2基因

GJB2基因定位于13q11-12,全長4 804 bp，編碼區(qū)為678 bp，編碼在耳蝸和表皮中表達的β類縫隙連接蛋白Connexin26(Cx26)。Cx26是一種跨膜蛋白，與其他的連接蛋白分子形成連接子，連接子在毗鄰的細胞融合形成間隙連接，這個大孔允許細胞質(zhì)交換電解質(zhì)、第二信使和代謝物。

GJB2基因異常是遺傳性非綜合征性耳聾的主要致病原因。目前已有111種突變方式被報道[2]，其中顯性突變9種，隱性突變92種，未知突變10種。GJB2突變后引起的NSHL具有明顯的種族差異性[3]，且突變復雜多樣，歐美人群中Cx26基因突變最多見為30delG或35delG的熱點突變，在地中海國家和美國遺傳性無綜合征耳聾患者中占60%～85%，而在中國人群中尚未發(fā)現(xiàn)。戴樸等[4]對中國18個省份聾校的1 680例非綜合征性耳聾病例GJB2基因檢測中發(fā)現(xiàn)235delC突變的檢出率較高，為18.16%。本研究中，在耳聾人群中GJB2基因檢出率為12.48%(657/5 266)，以235delC檢出率最高，仍未發(fā)現(xiàn)35delG的基因突變。

3.2 SLC26A4基因

SLC26A4基因又稱PDS基因，位于人類染色體7q31，編碼含有780個氨基酸的蛋白質(zhì)Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，是一種跨膜蛋白。SLC26A4基因某一位點的突變導致Pendrin功能障礙，引起CI-轉(zhuǎn)運障礙或內(nèi)耳淋巴液流動異常，引起前庭導水管擴大(enlarged vestibular aqueduct，EVA)和內(nèi)淋巴管內(nèi)壓升高，內(nèi)耳毛細胞受損和聽神經(jīng)萎縮，從而導致聽力下降。

目前報道的SLC26A4基因突變類型已達160種[5]，不同種族的人群中SLC26A4基因突變譜不同，在北歐最常見的突變是L236P、T416P和IVS8+1 G > A；在東亞IVS7-2A>G和H723R是韓國人、中國人和日本人突變頻率較高的類型。趙亞麗等[6]在明確診斷前庭水管擴大的耳聾患者研究中發(fā)現(xiàn)IVS7-2A>G在所有突變體中約占57.63%(102/177)，本次研究中SLC26A4基因突變發(fā)生率為(9.72%，512/5 266)。

大前庭水管是兒童感音神經(jīng)性耳聾最常見的內(nèi)耳畸形，患兒出生時可能聽力正常，或伴有輕度至中重度的聽力損失，患兒如語前發(fā)病者，多有較好的語言能力， 發(fā)病之前有感冒，顱外傷或其他使顱壓增高的病史，可以造成明顯的聽力下降，約81%～94%的患者為雙側(cè)發(fā)病。臨床表現(xiàn)為波動性感音神經(jīng)性聽力損失，多呈進行性、高頻聽力下降，無低頻下降的上升型聽力曲線。對LVAS的突變基因篩查，有利于LVAS的早期診斷，從而指導攜帶致病基因的兒童行為，預(yù)防疾病發(fā)生。

3.3 線粒體DNA(mtDNA)

線粒體DNA(mtDNA)是唯一存在于人細胞質(zhì)中的DNA分子，是獨立于細胞核染色體外的基因組，具有自我復制、轉(zhuǎn)錄和編碼的功能，但同時核DNA的調(diào)控，在有性生殖中，受精卵的線粒體絕大部分來自于卵子的細胞質(zhì)，這一特點決定了線粒體遺傳屬于母系遺傳。mtDNA的突變可通過母親傳給后代，后代子女中的女性可將突變的mtDNA繼續(xù)傳給下一代，而男性不再下傳。這一特點也成為預(yù)防m(xù)tDNA突變攜帶者發(fā)生藥物性耳聾的關(guān)鍵。

不同國家及不同人種mtDNA突變的發(fā)生率不盡相同，高加索人種突變頻率為0%～28.57%，日本非綜合征SNHL中A1555G突變頻率為3%～8.7%，紀育斌等[7]綜合16篇研究對象為非綜合征型SNHL患者的文獻數(shù)據(jù)，初步得出中國的非綜合征型SNHL患者中A1555G突變頻率為6.62%(230/3 473)。本研究中發(fā)現(xiàn)mtDNA 12S rRNA在大樣本耳聾人群中突變頻率為4.54%(239/5 266)，由于種族和環(huán)境及地域的差異，發(fā)病率也因而有較大的不同。

本次研究中mtDNA突變239例中有110例有明確氨基糖甙類抗生素用藥后致聾史。有97例發(fā)病年齡>5歲，語言能力尚好，表現(xiàn)為遲發(fā)性聽力下降，提示遺傳因素可能在該類基因攜帶者耳聾發(fā)病中起重要作用。此次篩查發(fā)現(xiàn)有239例攜帶藥物易感耳聾基因突變。根據(jù)該基因的母系遺傳規(guī)律，其母系家族成員中還有10倍成員，約2 390人攜帶此類致聾基因。如果他們不慎使用氨基糖苷類藥物后必將導致聽力損害和聽力下降。通過對他們整個母系家族用藥指導，將有效地預(yù)防和避免他們發(fā)生聽力殘疾。

3.4 GJB3基因

GJB3基因，即編碼Cx31的基因，可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳性非綜合征型耳聾。1998年Xia JH等[8]最早報道了兩個引起顯性遺傳高頻聽力下降的GJB3突變。在中國各地研究中發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變的發(fā)生率不高，0.56%(1/87)[9]、0.75%(1/133)[10]或更低，本研究中為0.15%(8/5266)。

與國內(nèi)同類研究相比，本研究發(fā)現(xiàn)耳聾人群攜帶遺傳性耳聾相關(guān)突變基因的發(fā)生率均較低，主要原因為本研究年齡范圍不同于其他研究，包含了老年聾群體和其他原因致聾的病人。但本次研究遵循隨機化原則，隨機選擇耳聾人群，并且樣本量較大，對國內(nèi)進行遺傳性耳聾基因檢測的流行病學研究具有重要意義。

[1] 王國建，戴樸，韓東一，等.基因芯片技術(shù)在非綜合征性耳聾快速基因診斷中的應(yīng)用研究[J].中華耳科雜志，2008,6(1)：61-64.

[2] Kenneson A, Van Naarden Braun K, Boyle C. GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review[J]. Genet Med， 2002,4 (4): 258-274.

[3] A Cryns K,Orzan E,Murgia A,et al.A genotype-phenotype correlation for GJB2 (connexin 26) deafness[J]. J Med Gene， 2004,41(3):147-154.

[4] 戴樸,于飛,劉新，等. 18個省市聾校學生非綜合征性聾病分子流行病學研究I-GJB2 235de1C和線粒體mtDNA 12S rRNA A1555G突變篩查報告[J].中華耳科學雜志，2006,4(1):1-5.

[5] Pera A, Dossena S, Rodighiero S,et al.Functional assessment of allelic variants in the SLC26A4 gene involved in Pendred syndrome and nonsyndromic EVA[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2008,105(47):18608-18613.

[6] 趙亞麗，王秋菊，李慶忠，等. 95例前庭水管擴大核心家系SLC26A4基因特異突變圖譜[J]. 聽力學及言語疾病雜志，2008,16(3):171-177.

[7] 紀育斌，王秋菊，蘭蘭，等.國內(nèi)線粒體DNA 12S rRNA A1555G 突變的流行病學文獻分析[J]. 聽力學及言語疾病雜志，2010，18(1):6-10.

[8] Xia JH,Liu CY,Tang BS,et al.Mutations in the gene encoding gap junction protain beta-3 associated with autosomal domination hearing impairment[J].Nat Genet, 1998,20(4)：370-373.

[9] 梁爽,孫喜斌,韓睿，等.非綜合征型聾患者耳聾相關(guān)基因檢測結(jié)果分析[J].聽力學及言語疾病雜志，2011，19(1):10-13.

[10] 陳俞,瑪依拉·吐地,張華，等.新疆維吾爾族與漢族非綜合征性耳聾患者四個耳聾基因突變譜的篩查[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2010，11：1083-1087.

Study on common gene mutation of the deaf population in Dalian

MOU Shu-yu1， LIU Lin1， CUI Ling1，ZHAO Li-yang1， BAI Hua1， BIE Xu2， SUN Xiu-zhen2

(1.DepartmentofOtolaryngology,DalianFriendshipHospital,Dalian116001,China;2.DepartmentofOtolaryngology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

Objective To screen and analysis the most common pathologic genes which are carried and distributed in the deaf population in Dalian, to explore the characteristics and incidence rate of the deafness patients in Dalian.Methods 5266 deafness patients were detected with the gene chip, which is able to perform mutation detection of 9 hot-spot mutations in four most common pathologic genes,including GJB2(35delG，176del16，235delC and 299delAT), SLC26A4(2168A>G and IVS7-2A>G), mtDNA12SrRNA (1555A>G,1494C>T), GJB3538C>T simutaneously. The datas were analyzed by using SPSS19.0 software.Results Among the 5 246 deafness patients, 1 416 cases were found to carry the most common pathologic genes (26.89%, 1 416/5 266), GJB2 gene mutation carriers in 657 cases (12.48%, 657/5 266), SLC26A4 gene mutation carriers in 512 cases (9.72%, 512/5 266), mtDNA 12S rRNA carriers in 239 cases (4.54%, 239/5 266), GJB3 gene mutation carriers in 8 cases (0.15%, 10/5 266). Conclusion The gene chip can be efficiently and quickly used in large sample populations, especially for the large-scale s gene defect screening. The mutation rate is relatively low for the deaf population in Dalian.

deafness;genechip;screening;GJB2;SLC26A4;mtDNA12SrRNA;GJB3

論 著

10.11724/jdmu.2015.01.08

國家自然科學基金項目(11472074)； 大連市科技計劃項目(2010)

牟書瑜(1957-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，主任醫(yī)師。E-mail：mushuyu@gmail.com

別 旭，副教授。E-mail：bx5581@sina.com

R764.21

A

1671-7295(2015)01-0034-03

牟書瑜，劉琳，崔玲，等. 大連地區(qū)耳聾人群常見聾病基因突變的研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2015,37(1)：34-36.

2014-12-19；

2015-01-19)