18F標記正電子藥物研究現(xiàn)狀與進展

霍 焱，王榮福

北京大學 第一醫(yī)院，北京 100034

隨著人口日趨老齡化，全世界癌癥死亡人數(shù)逐年上升。全國腫瘤登記中心披露，每年新發(fā)腫瘤病例估計約為312萬例，據(jù)世界衛(wèi)生組織預計到2030年癌癥患者可超1 310萬［1］。雖癌癥原因尚不清楚，但若能早期診斷，多數(shù)患者可通過手術治療、化療、放療或聯(lián)合治療而改善生存質(zhì)量甚至延長生命。正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography，PET），利用人體生命元素諸如18F、11C、15O、13N等正電子核素標記的藥物，從體外無創(chuàng)、定量、動態(tài)地觀察這些物質(zhì)進入人體后隨時間變化的生理、生化變化，從分子水平洞察其在人體內(nèi)的代謝及研究受體的分布和活動［2-3］，可對腫瘤的早期診斷、良惡性鑒別、分期、分級及療效預測顯示出獨特的優(yōu)勢［4］。

分子影像學反映機體組織、細胞及分子水平的代謝和功能狀態(tài)的變化，不僅是疾病早期診斷的利器，在新藥研發(fā)方面也有著巨大的應用前景，還可為個體化治療提供指導［5］。因此，親腫瘤的正電子核素標記藥物的研制和開發(fā)利用是分子影像學與分子核醫(yī)學一直追求的目標。

現(xiàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤的持續(xù)生長、侵襲轉(zhuǎn)移與血管新生密切相關。血管新生是指從預先存在的血管中形成新血管的過程。而毛細血管細胞中粘附分子——整合素αvβ3的表達及其與特異性基質(zhì)配體如 含 精 氨 酰-甘 氨 酰-天 冬 氨 酸（arg-gly-asp，RGD）三肽的相互作用抑制腫瘤新生血管的生成并促進腫瘤細胞的凋亡，在腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移中起著關鍵作用。在血管新生過程中，內(nèi)皮細胞表達的整合素調(diào)節(jié)細胞的遷移和生存。腫瘤細胞表達的整合素可促進細胞侵襲和穿越血管壁，以便于腫瘤轉(zhuǎn)移。整合素αvβ3在活化的內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞中呈高度表達，但在正常的內(nèi)皮細胞和多數(shù)正常組織中呈不表達，這為抗血管新生策略提供了潛在的靶點［6］。

1 18F標記藥物方法學應用研究與新進展

正電子核素18F可通過取代有機化合物分子中的羥基、硝基或氫原子，實現(xiàn)藥物的18F標記。18F為缺中子核素由醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)獲得。同時18F所發(fā)射的正電子與周圍負電子作用發(fā)生湮沒輻射，產(chǎn)生二個方向相反、能量均為511keV的光子。用符合探測線路測量這二個光子，比常用的直接測量方法空間分辨率好、靈敏度高，且不受組織厚度影響。18F的半衰期為110min，因此可以在較短時間內(nèi)重復給藥，以研究不同生理、病理狀態(tài)下示蹤劑的分布。同時藥物的標記要求快速、自動化，制備和質(zhì)控檢驗需快速可行，這樣對藥物生產(chǎn)的工藝要求比較高［7］。

小分子多肽顯像劑因至多含有50個氨基酸，方便易得，易于合成，且易于放射性標記及對其修飾，免疫原性小，易與特定靶位點結(jié)合，體內(nèi)分布特性好，易于被靶組織迅速攝取，因此，經(jīng)過特定修飾的多肽類似物可克服傳統(tǒng)抗體及其片段的不利藥動學特點及顯像性質(zhì)，應用于腫瘤顯像中［8］。

用正電子放射性核素18F標記含RGD基序的多肽，然后用正電子發(fā)射型計算機斷層顯像／體層成像（positron emission tomography／computed tomography，PET／CT）進行顯像可無創(chuàng)性地在活體上顯示腫瘤生長過程中αvβ3受體的表達量變化，可間接反映新生血管生成及腫瘤的增長情況，在指導靶向腫瘤新生血管的生物治療及療效評價方面具有重要的意義［9］。經(jīng)典的方法多采用放射性核素標記某種特定的輔基，然后通過進一步的化學結(jié)合方法對生物分子進行標記。放射性輔基的合成是18F標記多肽過程中最關鍵的一環(huán)。18F標記多肽大多采用18F-酞化作用（18F-acylation）方法，但該法須采用多個步驟來合成放射性標記輔基，耗時長，產(chǎn)率低［10］，這些原因?qū)е码m然放射性受體PET顯像已開展多年，但目前能應用于臨床的仍非常少［11-12］。很多學者針對此方法做了較多改進工作，但目前仍很難簡便地進行一步法標記。

1．1 18F標記輔基法

18F標記輔基法最常用的方法是將羧基轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的高活性酯，然后再與多肽的氨基反應。其中以18F-NFP（4-nitrophenyl-2-18F-fluoropropionate）和18F-SFB（N-succinimidyl-4-18F-fluorobenzoate）最為常用，Chin等［13］用18F經(jīng) 親 核 取代、水解、活化等步驟得到18F-NFP，其與多肽再經(jīng)多步驟反應合成了18F-FPP（RGD）2，總共耗時170min，衰變校正后的總放化產(chǎn)率為16．9%。Tang等［14］經(jīng)氟化、水解、衍生化，三步一鍋法完成了18F-SFP的合成，再標記蛋白質(zhì)Avastin，總耗時90min，衰變校正后的總放化產(chǎn)率為18%。所以18F標記活化羧基輔基標記多肽整個過程繁瑣耗時且總體標記率低。Chang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，多肽質(zhì)量濃度為3g／L、溫度為60℃、反應30min時，成腙的放化產(chǎn)率為90%。雖醛與多肽氨氧基或聯(lián)氨基縮合的方法化學選擇性和反應性好，但合成步驟長，引入的輔基比較大，所以多肽的活性可能受影響。標記輔基與多肽巰基反應選擇性好，反應性好，可以在水溶液中反應，是18F標記含巰基多肽的較好方法。但制備18F標記輔基，需要多步合成，總標記產(chǎn)率不高，并且引入的輔助基大，對多肽的結(jié)構(gòu)影響可能比較大。

1．2 固相標記法

Julie等［16］在2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯（o-（7-azabenzotriazol-1-yl）-N，N，N′，N′-te-tramethyluronium hexafluorophosphate，HATU）和N，N-二異丙基乙胺（N，N-diisopropylethylamine，DIPEA）條件下，用固相標記法完成18F-FBA（18F-fluorobenzaldehyde）對多肽的18F標記。18F-FBA與保護的多肽反應3min，再與三氯乙酸反應7min，裂解釋放出18F標記多肽，反應時間短，衰變校正后的放化產(chǎn)率為70%～80%。但標記過程中需要對多肽的羧基或氨基進行保護，標記完后需要脫保護，增加了很多處理步驟，不容易實現(xiàn)自動化合成。

1．3 點擊化學法

點擊化學法（click chemistry）于2001年由諾貝爾化學獎獲得者美國化學家Sharpless提出，包括環(huán)加成、親核開環(huán)等反應，由于反應快捷，反應位點準確，引起了廣泛關注［17］。2006年Marik等［18］將點擊化學運用于放射性藥物的合成及標記中，成功的實現(xiàn)了多肽的18F標記［19］。主要有兩種標記途徑：1）帶炔基的18F標記輔基與帶疊氮基團的多肽反應；2）帶疊氮基團的18F標記輔基和帶炔端的多肽反應。Ramenda等［20］用帶有疊氮的多肽與帶有18F標記的末端炔在硫酸銅催化下，40℃反應20min，得到18F標記的多肽，總反應時間45min，衰變校正后的放化產(chǎn)率為69%±11%。利用點擊化學將炔和疊氮化合物進行環(huán)加成反應，進行多肽的18F標記，雖然點擊化學標記率高（大于80%），但是該方法需要多步合成和分離，耗時長。另外，在生物分子上引入硅基團也可以實現(xiàn)18F一步標記。但是所形成的標記物不穩(wěn)定，必須在硅上引入特丁基，修飾基團增大了化合物的脂溶性，同時降低了化合物和靶標的特異性結(jié)合。所以點擊化學法的標記產(chǎn)率高，選擇性好，對氧氣和水不敏感。但是該方法需要多步反應引入末端炔基或疊氮基團。

1．4 18F-AlF絡合標記法

18F-易與金屬（如鋁）結(jié)合，生成的18F-鋁配合物（18F-Al）可與螯合基團（如1，4，7-三乙酰唑胺環(huán) 壬 烷-1，4，7-三乙酸鹽（1，4，7-triaza cyclononane-1，4，7-triacetic acid，NOTA））連接。2009年，Mc Bride等［21］用18F-KF和AlCl3反應形成（18F-AlF）2＋，然后跟連接在多肽上的NOTA配體發(fā)生絡合反應，形成標記絡合物。在45min內(nèi)完成多肽化合物的18F標記和高效液相層析（high performance liquid chromatography，HPLC）分離，標記率達到50%。（18F-AlF）2＋絡合多肽NOTA修飾化合物在體外血清實驗中具有良好的穩(wěn)定性［22-23］。

Liu等［24］用NOTA修飾［c（RGDyK）］2，得到化合物NOTA-RGD2，將其與18F-AlF通過螯合反應獲得標記化合物，制得18F-AlF-NOTARGD2，整個生成過程無需制備前體18F-SFB、18FNFP，無需微量水質(zhì)分析儀（quality moisture analyzer，QMA）柱純化，無需HPLC純化。實現(xiàn)鋁一步法18F標記RGD多肽。Zhan等［25］利用PRGD2肽凍干試劑盒，用一步法便捷合成具有優(yōu)異放化純度和產(chǎn)量的18F-Al-NOTA-PRGD2。在最佳條件下，18F-Al-fatide包括純化在內(nèi)的整個放射合成可在20min內(nèi)完成，放化產(chǎn)率為（42．1±2．0）%，純度大于95%。臨床試驗 表明，18F-Alfatide的PET顯像可清晰顯示腫瘤，平均腫瘤攝取為（2．90±0．10）%ID／g。Mercier等［26］采用18F-AlF鰲合法用一步法實現(xiàn)RGD多肽的18F標記，用Sep-Pak分離柱純化即可使18F-AlFNOTA-PRGD2的放化純度大于95%，與Liu等［24］報道相一致，該肽自標記到純化總的時間僅為40min左右。與傳統(tǒng)的18F-SFB酞化反應標記法相比，此標記方法及純化過程明顯簡化，方便、易行、快捷，提示該法將比較適合于臨床應用，從而大大提高了18F標記RGD多肽向臨床應用的可能性。

醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)18F后，用0．4mol／L碳酸氫鉀溶液淋洗后，用不含有金屬的冰醋酸將其pH調(diào)節(jié)到4．0，隨后加入溶于0．1mmol／L乙酸鈉（pH＝4）的氯化鋁（2mmol／L，3μL）和溶于二甲基亞砜的NOTA-RGD2。以上反應混合物在100℃下反應15～20min，反應結(jié)束后用去離子水稀釋，然后用Sep-Pak分離柱純化。收集含有18F-AlF-NOTA-RGD2的液體并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除溶劑，所獲得的標記化合物用磷酸緩沖液（pH＝7．4）進行稀釋后用0．22μm微孔過濾器除菌備用。

一步法標記18F-AlF-NOTA-RGD2的反應時間為15～20min，用Sep-Pak分離柱純化時間8～12min，總放化合成所需時間約為40min，未經(jīng)衰變校正的放射性標記產(chǎn)率為17%～25%。采用Sep-Pak分離柱純化而無需經(jīng)HPLC純化后18FAlF-NOTA-RGD2的放射化學純度大于95%。

綜上所述，18F標記RGD肽類不僅不會改變多肽空間結(jié)構(gòu)，而且與受體結(jié)合力及親和力都很高，用18F-AlF鰲合法標記制備靶向整合素αvβ3受體的新型顯像劑18F-AlF-NOTA-RGD方法簡便、易行，一步便能完成。其藥代動力學與18F-FPPRGD2極其相似，在小動物PET顯像中也體現(xiàn)了優(yōu)勢［19，27-28］。

2 前景與展望

隨著PET、PET／CT技術的迅速發(fā)展，其中95%以上用于腫瘤診斷，且臨床價值已得到了肯定。然而，目前國內(nèi)應用的腫瘤正電子藥物有非常大的局限性，大多使用眾所周知的18F-FDG，這大大限制了PET的潛在功能及應用［29］。因此，研究和開發(fā)滿足臨床需要的高靈敏、高特異的正電子顯像劑才能真正從根本推動分子影像學的發(fā)展。綜上所述，整合素αvβ3在新生血管內(nèi)皮細胞表面的高表達，RGD肽與整合素結(jié)合的特異性強、親和力高的特性，用放射性核素標記的RGD肽在動物實驗中已經(jīng)取得了一系列的成果，且進行了初步的臨床研究［30］。但RGD肽及其各種不同的修飾結(jié)構(gòu)，作為小分子多肽配體主要存在正常肝、腎組織的攝取較多的問題，這樣將會給轉(zhuǎn)化醫(yī)學帶來困難。所以需要尋找一種更理想的小分子多肽顯像配體，本課題組前期在荷瘤人前列腺癌PC3裸鼠的初步體內(nèi)生物分布實驗及SPECT顯像結(jié)果顯示，應用氯胺-T方法將131I成功標記小分子多肽精氨酰-精氨酰-亮氨酸（arg-arg-leu，RRL），其具有良好生物學［31-32］和藥理學性能，荷瘤動物模型顯像可見131I-RRL特異性地聚集于腫瘤部位［33］，同時用99Tcm標記的RRL在原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤實驗研究均觀察到腫瘤部位可見明顯放射性濃聚，腫瘤病灶顯影清晰［34-35］。用單光子放射性核素標記的小分子多肽可用于腫瘤核醫(yī)學分子功能成像［36］，同時可以考慮用正電子放射性核素18F標記RRL進行活體腫瘤顯像研究［37-39］，以便于此肽在臨床上更好的應用，相信可以為腫瘤靶向血管顯像及靶向生物放射治療提供一種更優(yōu)的手段或方法。

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