鄰苯三酚自氧化法測定血漿超氧化物歧化酶的方法學(xué)評價及臨床應(yīng)用探討

張 凡，李興武，鐘政榮

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是生物體內(nèi)特異性的清除自由基的首要物質(zhì)，SOD 水平的高低可反映機體內(nèi)自由基的含量。常用于對心、腦、肝臟等重要臟器病變引起的過氧化物損傷進行監(jiān)測［1］。目前對于SOD 的研究十分活躍，SOD 測定方法有多種［2］，如黃嘌呤氧化酶法、鄰苯三酚自氧化法、腎上腺素法、核黃素－NBT 法、細胞色素C 還原法等，目前多數(shù)實驗室此項目的檢測多采用黃嘌呤氧化酶法、鄰苯三酚自氧化法。我院于2014年3月開展了血漿SOD檢測，選用了鄰苯三酚自氧化法。為探討此方法優(yōu)劣及SOD 的臨床應(yīng)用價值，本文特對鄰苯三酚自氧化法測定SOD 進行了實驗探討，進行了相關(guān)的方法學(xué)評價和比較，現(xiàn)將整個檢測過程報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 健康對照組為我院體檢中心經(jīng)健康體檢合格的正常人。對照組共42 例，其中男29 例，女13 例，平均年齡42歲。疾病組:選擇與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)疾病患者1580 例，其中肝臟疾病277 例，腎臟疾病281 例，消化系統(tǒng)疾病174 例，呼吸系統(tǒng)疾病133 例，心血管疾病673 例，糖尿病患者42 例。疾病組中，男940 例，女640 例，平均年齡57.9 歲。

1.2 方法(1)儀器:為日本產(chǎn)為Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀。試劑為北京華宇億康生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)的鄰苯三酚自氧化法定量測定試劑盒;校準品和質(zhì)控品為試劑配套使用，批號為131221 和20140407，均在效期內(nèi)使用。(2)樣本來源:利用質(zhì)控品、校準品及混合血漿配制相關(guān)方法學(xué)評價用的樣本;(3)試驗方法:有以下幾種:

1.2.1 精密度試驗 依照CLSI 的EP5-A2［3］文件要求，取高、中值質(zhì)控血漿，其中20 份用于批內(nèi)精密度試驗，即1 d 測定20 次;另外20 份用于做批間精密度試驗，即每天分別取高、低值質(zhì)控各1 支，連續(xù)測定20 d。

1.2.2 準確性試驗 依照CLSI 的EP9-A2［4］文件的要求，檢測SOD 定值標準血清，連續(xù)測量3 d，每天測量3 次，計算絕對偏移和相對偏移，和試劑盒準確性標準的要求進行比較。

1.2.3 線性試驗 按照CLSI 的EP6 A［5］文件的要求，取批號為131221 的標準品干凍血清，按照試劑盒提供的線性范圍，對標準品進行系列濃度的稀釋或濃縮，即高(H)、低(L)濃度樣品，配制成6 管系列樣品:5L、4L+ 1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H，分別測定三次取均值。以X 表示各樣品的理論值，以Y 表示各樣品的實測值進行回歸分析，得到Y(jié)=bX+a，若r2＞0.95，則可判斷線性范圍驗證成功［5］。

1.2.4 回收試驗 在兩份新鮮血漿中按比例加入高、低不同濃度的標準液，得到4 份回收血漿，每一濃度均檢測3 次，取均值。

1.3 臨床應(yīng)用評價 對氧化應(yīng)激相關(guān)疾病患者及42 名健康體檢者進行比較，疾病組分為肝臟疾病組、腎臟疾病組、消化系統(tǒng)疾病組、呼吸系統(tǒng)疾病組、心血管疾病組、糖尿病患者。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 2 組之間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料以±s 表示。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗 按要求對標本測定后，然后對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示:批內(nèi)精密度高、中值的CV%分別為1.57%、1.82%，批間精密度高、中值的CV%分別為2.17%，2.21%，結(jié)果均小于5%的臨床要求。見表1。

表1 2 組標本的精密度測定結(jié)果(U/ml)(CV%，±s)

表1 2 組標本的精密度測定結(jié)果(U/ml)(CV%，±s)

項目批內(nèi)精密度均值及標準差變異系數(shù)批間精密度均值及標準差變異系數(shù)高值202.30 ±3.181.57212.00 ±4.592.17中值150.05 ±2.741.82152.00 ±3.362.21

2.2 準確性試驗 按要求對標本測定后，計算絕對偏移和相對偏移，和試劑盒說明書準確性標準的要求1/4 的進行比較。該血清SOD 測試準確度試驗符合相關(guān)技術(shù)要求和臨床實際要求。結(jié)果見表2。

表2 SOD 準確度試驗結(jié)果(n=9)

2.3 線性 對標準品所稀釋的6 管系列濃度值做圖，理論值為X 軸，實測值為Y 軸，進行回歸分析，得出R2為0.9978，在0～250 U/ml 內(nèi)具有良好線性。見圖1。

圖1 SOD 線性分析

2.4 回收試驗 將2 份基礎(chǔ)血清1 ml 分別加入0.1 ml 濃度為250 U/ml 和150 U/ml 的校準液進行測定，分別對基礎(chǔ)血清及回收樣本進行測定，計算回收率，得出其回收率為96.2%～103.4%，平均回收率為98.7%，見表3。

表3 血清標本回收試驗測定結(jié)果

2.5 臨床應(yīng)用評價 對疾病組(肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病患者)分別與正常對照組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)。表4。

表4 不同疾病血漿SOD 水平與正常對照組的比較(±s)

表4 不同疾病血漿SOD 水平與正常對照組的比較(±s)

組別例數(shù)SOD肝臟疾病組277120.98 ±24.27腎臟疾病組281144.79 ±37.44消化系統(tǒng)疾病組173118.00 ±28.22呼吸系統(tǒng)疾病組13395.95 ±18.46心血管疾病組673134.88 ±31.98糖尿病組42121.31 ±30.35正常對照組42178.76 ±15.42

3 討論

近年來研究表明［6-9］，SOD 用于催化超氧陰離子自由基(O2－)發(fā)生歧化反應(yīng)，它對平衡機體氧化與抗氧化系統(tǒng)、免除自由基損傷起著主要的作用。在病理情況下，自由基產(chǎn)生過多，就會引起DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子的損傷，引起機體發(fā)生多種疾病。人體中自由基含量與SOD 水平呈負相關(guān)，SOD 水平的高低可反映機體內(nèi)自由基的含量。SOD 常用在對心、腦、肝、腎等重要臟器病變以及炎癥、放射性損傷、藥物中毒、放化療等引起的過氧化物損傷，并運用自由基清除藥物進行治療。

我院于2014年3月開展了血漿SOD 檢測，選用了鄰苯三酚自氧化法。從本試驗方法學(xué)的原理來看，在堿性條件下鄰苯三酚能迅速自氧化，釋放出O2－，加入SOD 則抑制其自氧化速度，且減弱的程度與SOD 的濃度相關(guān)，此反應(yīng)屬于酶促反應(yīng)，其具有操作簡便、快速、試劑便宜且用量小，適用于自動生化分析儀。SOD 測定方法有多種，如黃嘌呤氧化酶法、腎上腺素法、核黃素－ NBT 法、細胞色素C 還原法等，有報道認為［2］，黃嘌呤氧化酶法特異性強，結(jié)果穩(wěn)定，但試劑昂貴，反應(yīng)時間長。而其他幾種方法干擾因素多，穩(wěn)定性差。

本文遵照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會CLSI 文件EP5－A2［3］、EP9－A2［4］和EP6－A［5］的要求對SOD 測定試劑盒進行評價，SOD 不屬于常規(guī)化學(xué)的檢測項目，因此對于此類新項目的評價和論證就顯得尤重要。從本文的試驗結(jié)果看，SOD 精密度試驗無論是批內(nèi)還是批間精密度均符合要求。批內(nèi)精密度為1.57%和4.8%，批間精密度為2.17 和2.21%。本次評價結(jié)果滿意，反映了實際工作中臨床該項目標本隨機分配及儀器、試劑天間誤差而帶來的不確定度。本次試驗準確性試驗的相對偏倚為:1.6%和2.4%，試劑廠商提供的1/4相對偏倚為5%，表明該試驗的準確性好。本次試驗所用的校準品是試劑配套的校準品，廠家對其進行了嚴格的定值，但是由于該項目較新，不屬于常規(guī)化學(xué)的檢測項目，所以不同實驗室及試驗方法間的可比性就有待進一步探討;本次線性試驗，在0～250 U/ml 內(nèi)R2 為0.9978，表明在0～250 U/ml 范圍內(nèi)該項目線性良好。對于線性試驗，關(guān)鍵在于制備高、低濃度的樣本，本試驗根據(jù)廠家提供的校準品配制。本次回收試驗的回收率為96.2%～103.4%，表明該實驗的系統(tǒng)誤差小，完全滿足臨床檢測的需要。本次試驗選用了2 份基礎(chǔ)血清分別加入2 個濃度的校準液進行測定，目的是為了得到不同醫(yī)學(xué)決定水平的樣本，試驗結(jié)果非常令人滿意。

對于本次試驗臨床應(yīng)用評價方面，選用了大量的疾病組血清SOD 水平與正常對照進行對比，本次臨床標本驗證結(jié)果表明肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及糖尿病患者的血清SOD 活性水平均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與有關(guān)報道相符［6-9］。在病理狀態(tài)下，生成過多的自由基或者清除障礙都可引起機體損傷，體內(nèi)抗氧化物質(zhì)平衡失調(diào)。肝臟能有效的清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，抑制或阻止脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)［10］。本次研究中，肝臟疾病的SOD 活性水平顯著低于健康對照組(P＜0.01)。表明體內(nèi)SOD 水平的確發(fā)生了變化，與上述論證相符。對于腎臟疾病和糖尿病患者，本次研究表明患者體內(nèi)的超氧陰離子過多。另外，本次研究表明在心血管疾病中，體內(nèi)SOD 水平也顯著下降。有報道表明［6］，心血管疾病以心肌缺血為主。心肌缺血時，氧氣供應(yīng)不足，心肌細胞內(nèi)ATP 分解加速，使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，此酶催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸和大量氧自由基，消耗抗氧化酶。使體內(nèi)自由基消除劑減少或缺乏。因此，監(jiān)測SOD 活性水平對與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療均有積極意義。對于消化系統(tǒng)疾病，SOD 活性水平也顯著下降，其原因有報道認為［8］，是消化道黏膜細胞在化學(xué)刺激或者機體缺氧等情況下，產(chǎn)生過多的氧自由基而不能及時清除，損傷消化道黏膜細胞.導(dǎo)致消化道疾病組織中SOD 活性水平降低。而對于呼吸系統(tǒng)疾病，本次研究133 例，其中包括肺部感染、肺功能不全、肺氣腫、肺炎、肺腫物，肺栓塞等。試驗結(jié)果表明患者體內(nèi)自由基含量過多，存在過度氧化情況，與現(xiàn)有報道一致［11］。

綜上所述，鄰苯三酚自氧化法測定血清SOD 適用于生化分析儀，方法學(xué)評價優(yōu)良，對于肝臟疾病、腎臟疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病以及糖尿病患者均有價值，對于患者病程轉(zhuǎn)歸，實時動態(tài)監(jiān)測以及如何運用氧自由基清除劑等方面開辟了廣泛的前景。

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