3種癲癇模型的制備及應(yīng)用分析*

陳中瑋, 周 鑫, 王麗琨, 伍國鋒

(貴陽醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

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3種癲癇模型的制備及應(yīng)用分析*

陳中瑋, 周 鑫, 王麗琨, 伍國鋒

(貴陽醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 探討不同癲癇模型的制備及其在癲癇研究方面的應(yīng)用。方法： 選擇成年雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為杏仁核慢點(diǎn)燃組、杏仁核快點(diǎn)燃組、注射匹羅卡品組，每組20只動物，觀察各組大鼠的點(diǎn)燃率，模型大鼠癲癇發(fā)作級別及癲癇行為Racinel 評分，同時(shí)觀察模型大鼠癲癇發(fā)作時(shí)的腦電圖。結(jié)果： 成功獲得各組癲癇模型動物，各組Racinel評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中慢點(diǎn)燃組動物持續(xù)時(shí)間較長，快點(diǎn)燃組出現(xiàn)典型癲癇行為較早，匹羅卡品組動物存活時(shí)間長。結(jié)論： 與杏仁核電點(diǎn)燃模型相比，匹羅卡品點(diǎn)燃癲癇動物成功率高，癲癇行為保持時(shí)間較久，能更好的為臨床所應(yīng)用，但匹羅卡品所致癲癇大鼠癇性發(fā)作持續(xù)時(shí)間變異較大，這可能為臨床篩藥帶來了一定的不便。

癲癇；疾病模型，動物；匹羅卡品；大鼠，Sprague-Dawley

癲癇是一種以大腦局部病灶突發(fā)性的異常高頻放電并向周圍組織擴(kuò)散為特征的大腦功能障礙，同時(shí)可伴隨短暫的運(yùn)動、感覺、意識及自主神經(jīng)功能異常，具有病因多樣性、發(fā)作反復(fù)性、癥狀復(fù)雜性、表現(xiàn)形式刻板性等特點(diǎn)[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界有5千萬的癲癇患者，且其平均每年發(fā)病率為0.5‰～1‰[2]。發(fā)作時(shí)的臨床表現(xiàn)可分為全面強(qiáng)直-陣攣發(fā)作(大發(fā)作)、單純部分發(fā)作、復(fù)雜部分發(fā)作、失神發(fā)作(小發(fā)作)、癲癇持續(xù)狀態(tài)[3-5]。既往多采用苯巴比妥、丙戊酸鈉等藥物治療癲癇，但服藥期間部分病例出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙及肝臟損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此，尋求療效滿意且不良反應(yīng)小的廣譜抗癲癇藥物，成為目前研究的熱點(diǎn)[6-7]。本研究結(jié)合目前癲癇模型制備常用的技術(shù)手段，擬采用同批次SD大鼠實(shí)驗(yàn)動物，通過不同方式獲得癲癇模型，分析模型動物的表現(xiàn)、腦電圖描記數(shù)據(jù)及模型動物的存活時(shí)間等，以期發(fā)現(xiàn)不同制備方法獲得的癲癇模型的特征，為臨床藥物研究和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

60只成年雄性SD大鼠均購自動物研究中心，7～8周齡，平均體質(zhì)量(223.5±1.3)g，隨機(jī)分為杏仁核慢點(diǎn)燃組、杏仁核快點(diǎn)燃組、注射匹羅卡品組，每組20只動物，所有動物均首先置于實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立空間內(nèi)，保持屋內(nèi)溫度濕度恒定，采用單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食的方式飼養(yǎng)1周讓動物適應(yīng)環(huán)境，開始實(shí)驗(yàn)前至少禁食12 h。

1.2 動物模型制備

1.2.1 杏仁核慢點(diǎn)燃模型 將大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射(4 mL/kg)麻醉后固定于腦立體定位儀上，在右側(cè)杏仁基底外側(cè)核的顱骨表面投射點(diǎn)鉆孔，將直徑為0.1 mm的雙極螺旋漆包鎳鉻電極植入右側(cè)杏仁基底外側(cè)核(杏仁核坐標(biāo)定位：前囟后2.8 mm，中線旁開4.9 mm，顱骨表面下8.6 mm)術(shù)后第7天，開始對大鼠右側(cè)杏仁核進(jìn)行電刺激。刺激強(qiáng)度從20 μA開始，每次在原來刺激強(qiáng)度的基礎(chǔ)上增加20%，刺激頻率60 Hz，波寬1.0 ms，串刺激；間隔5 min刺激1次，直至出現(xiàn)時(shí)程>3 s的杏仁核后放電，此時(shí)電流強(qiáng)度即為點(diǎn)燃前后放電閾值(ADT)。測定ADT后10 min進(jìn)行點(diǎn)燃刺激，大鼠連續(xù)出現(xiàn)3次5級發(fā)作定義為點(diǎn)燃成功。動物連續(xù)出現(xiàn)3次大發(fā)作間歇24 h后，用點(diǎn)燃前方法測定點(diǎn)燃后ADT。根據(jù)Racine分級法進(jìn)行發(fā)作強(qiáng)度判定。1.2.2 杏仁核快點(diǎn)燃模型 手術(shù)同前，刺激強(qiáng)度從20 μA開始，每次在原來刺激強(qiáng)度的基礎(chǔ)上增加20 μA，刺激頻率16 Hz，波寬1.0 ms，串刺激；間隔2 min刺激1次，直至出現(xiàn)時(shí)程>3 s的杏仁核后放電，此時(shí)電流強(qiáng)度即為ADT。測定ADT后10 min進(jìn)行點(diǎn)燃刺激，刺激方式為串刺激，刺激頻率16 Hz，波寬1.0 ms，波間隔61.50 Hz，強(qiáng)度500 μA，間隔7 min再次刺激，直至大鼠連續(xù)出現(xiàn)3次5級發(fā)作，定義為點(diǎn)燃成功。根據(jù)Racine分級法進(jìn)行發(fā)作強(qiáng)度判定。

1.2.3 匹羅卡品模型 大鼠腹腔注射氯化鋰125 mg/kg,18～20 h后再給予匹羅卡品30 mg/kg腹腔注射,30 min后如無發(fā)作按同樣劑量注射，直至發(fā)4～5級大發(fā)作，最多可注射4次藥，發(fā)作90 min后用安定進(jìn)行鎮(zhèn)靜。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)觀察 按照Racinel 經(jīng)典的癲癇發(fā)作行為評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分:無任何癲癇發(fā)作行為記0分; 凝視發(fā)作記1分; 規(guī)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動，伴有或不伴有面部抽動記2分; 出現(xiàn)一側(cè)前肢震顫記3分; 站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭記4分; 雙前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身性強(qiáng)直一陣攣性發(fā)作記5分; 發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡記6分[8]。各組大鼠給予視頻錄像監(jiān)測，連續(xù)觀測30 d，統(tǒng)計(jì)1 d、3 d、7 d、14 d的動物行為并評分記錄。

1.3.2 腦電圖觀察 在模型動物大腦植入電極接入刺激裝置，參考電極放置右耳，連接于生理記錄儀。杏仁核快點(diǎn)燃模型制備完成，大鼠休息1星期時(shí)，開始刺激大鼠，分別記錄大鼠點(diǎn)燃前正常腦電，后放電腦電及點(diǎn)燃后4級以上發(fā)作腦電；快慢杏仁核點(diǎn)燃模型，均按此記錄腦電；匹羅卡品組制備前、后1 h記錄動物的腦電變化，每組大鼠接受處理前后各描記腦電圖1 h，首先連續(xù)記錄15 min，然后每隔5 min 記錄10 min，1 h 內(nèi)完成。腦電圖資料用隨機(jī)軟件計(jì)算出癇樣放電潛伏期、頻率和波幅。根據(jù)Racine 分級，4級以上發(fā)作，腦電圖在尖波或棘波的基礎(chǔ)上出現(xiàn)陣發(fā)性或持續(xù)性異常放電為模型成功，以成功率表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料間的比較采用t檢驗(yàn)，各組之間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，各組成功率兩兩比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物模型結(jié)果

慢點(diǎn)燃組20只大鼠，電極掉落3只，麻醉死亡2只，點(diǎn)燃10只， 未點(diǎn)燃5只，平均點(diǎn)燃周期20 d；快點(diǎn)燃組20只大鼠，電極掉落5只，麻醉死亡1只，未點(diǎn)燃2只，點(diǎn)燃12只，平均點(diǎn)燃周期5 d；匹羅卡品組20只大鼠，17只當(dāng)天3～5級發(fā)作，1只死亡，2只未點(diǎn)燃，1周后死亡2只，有自發(fā)性癲癇的有15只(有自發(fā)性點(diǎn)燃確定為點(diǎn)燃)，各組癲癇模型點(diǎn)燃率的比較見表1，匹羅卡品組的點(diǎn)燃率明顯高于其它兩組(P<0.05)。

表1 3種方法癲癇模型點(diǎn)燃率比較Tab.1 Comparison of epilepsy burning rates among the three methods

(1)與匹羅卡品組比較，P<0.05

2.2 行為學(xué)觀察

各組癲癇發(fā)作級別及行為評分結(jié)果見表2、表3所示，第1天慢3組大鼠行為評分結(jié)果與未點(diǎn)燃組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，快點(diǎn)燃組評分明顯高于其它各組(P<0.05)，提示3種方法均能獲得成功；快點(diǎn)燃獲得模型的時(shí)間較短，癲癇行為比較典型，但是隨著時(shí)間的推移，癲癇行為的表現(xiàn)會逐漸降低，而慢點(diǎn)燃組第14天時(shí)癲癇行為比其它各組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠癲癇點(diǎn)燃成功時(shí)癲癇發(fā)作情況Tab.2 Epileptic seizure conditions of rats when burning successfully in the three groups

表3 3各組大鼠Racinel行為評分Tab.3 Racinel behavior scores of rats in the three groups

(1)與同時(shí)期未點(diǎn)燃組比較，P<0.05；(2)與同時(shí)期快點(diǎn)燃組比較，P<0.05；(3)與同時(shí)期慢點(diǎn)燃組比較，P<0.05

2.3 腦電圖觀察

慢點(diǎn)燃組、快點(diǎn)燃組、匹羅卡品組腦電圖監(jiān)測異常率分別為95%、95%、94%，所有有行為學(xué)異常表現(xiàn)的大鼠腦電圖上均有異常表現(xiàn)，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為大鼠正常腦電圖， B為杏仁核點(diǎn)燃大鼠癲癇發(fā)作時(shí)后放電腦電圖， C為5級癲癇大發(fā)作時(shí)腦電圖，D為匹羅卡品組大鼠癲癇發(fā)作時(shí)腦電圖

3 討論

癲癇是一種以大腦局部病灶突發(fā)性的異常高頻放電并向周圍組織擴(kuò)散為特征的大腦功能障礙，可伴有明顯腦電圖改變，可能伴隨著短暫性的運(yùn)動、感覺、意識及自主神經(jīng)功能異常，癲癇模型在癲癇的病理生理研究和抗癲癇藥物的研究中發(fā)揮著重要的作用[9]。

較理想的癲癇模型應(yīng)具有和人類癲癇相似的發(fā)生、發(fā)展過程，才能用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，獲得的研究數(shù)據(jù)才具有臨床參考價(jià)值[10]。目前較為公認(rèn)的癲癇動物模型至少應(yīng)具備以下幾種特點(diǎn)：首先具有諸如神經(jīng)細(xì)胞丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、軸突絲狀芽生和突觸重建等與人類癲癇相似的病理學(xué)基礎(chǔ)，其二是在初始刺激與自發(fā)性癲癇發(fā)作之間有較為固定的潛伏期( 維持?jǐn)?shù)天至數(shù)周)；其三是所獲得的動物模型在一定時(shí)間內(nèi)保持大腦神經(jīng)元興奮性持續(xù)增高[11-15]。

本研究用不同的方法制備癲癇模型，杏仁核是癲癇模型點(diǎn)燃最敏感的區(qū)域[16]。本實(shí)驗(yàn)在相同條件下檢測癲癇模型的特點(diǎn)，比以往研究中觀察單一模型的臨床特點(diǎn)有了一定的進(jìn)步，同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合腦電圖檢測，使獲得的模型及分析結(jié)果更具有客觀性，排除主觀因素的影響[17-20]。快點(diǎn)燃和慢點(diǎn)燃的區(qū)別主要在于刺激參數(shù)的設(shè)置及刺激間隔時(shí)間的長短，通過大量查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)摸索找到了較準(zhǔn)確的刺激參數(shù)。杏仁核慢點(diǎn)燃動物模型的癲癇行為學(xué)表現(xiàn)時(shí)間最長，模型穩(wěn)定性好，模型點(diǎn)燃后自發(fā)性強(qiáng)，并且能最大限度的接近人類癲癇發(fā)作時(shí)腦電的特征，適合于臨床耐藥性、臨床藥物的篩選或者用藥劑量的研究；而快點(diǎn)燃模型動物出現(xiàn)癲癇行為較早，可用于外傷或者急性毒性藥物的研究；匹羅卡品組動物損傷較小，動物存活時(shí)間長，可以用于神經(jīng)性藥物或急性藥物對癲癇影響的研究。3種模型的同時(shí)制作和對比，能更好的幫助模擬人類癲癇發(fā)作時(shí)的發(fā)作狀態(tài)及發(fā)病后大腦腦電的改變，也為往后更深入的實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)支持。

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(2015-02-12收稿，2015-04-03修回)

中文編輯： 周 凌；英文編輯： 趙 毅

Analysis of Preparation and Application of 3 Epilepsy Models

CHEN Zhongwei, ZHOU Xin， WANG Likun， WU Guofeng

(AffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the preparation of different epilepsy models and its application in epilepsy research. Methods: Sixty adult male SD rats were randomly divided into amygdala kindling slow group, amygdala kindling fast group, and pilocarpine injection group with 20 rats in each. Observing seizure grade of epilepsy rats and epileptic behavior Racinel scores, and EEG of rats during seizure. Results: Various epilepsy animal models were successfully obtained, Racinel scores were significantly different among each group (P<0.05). In which, epilepsy of slowly burning animals continued for a longer time, quick burning group showed typical epileptic seizure behavior earlier, and the pilocarpine animals lived longer time. Conclusion: The pilocarpine injection group showed higher success rate and epilepsy behavior lasted longer, which can better serve clinical purpose. However, pilocarpine triggered epileptic seizure time varies greatly, which might cause certain inconvenience for clinical screening.

epilepsy; disease models, animal; pilocarpine; rats, Sprague-Dawley

時(shí)間：2015-05-21

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150521.1313.030.html

R742.1

A

1000-2707(2015)05-0482-04