氨芐西林在雞組織中的殘留消除規(guī)律

孫禮瑞，謝 星，謝愷舟*，張小杰，王劍鋒，崔璐璐，劉建宇，張跟喜，戴國俊，王金玉

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009；2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚州 225009；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

氨芐西林在雞組織中的殘留消除規(guī)律

孫禮瑞1,2，謝 星3，謝愷舟1,2*，張小杰1,2，王劍鋒1,2，崔璐璐1,2，劉建宇1,2，張跟喜1,2，戴國俊1,2，王金玉1,2

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009；2.江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，揚州 225009；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

旨在研究氨芐西林在雞組織中殘留消除規(guī)律。雞組織樣品經(jīng)磷酸二氫鈉溶液提取，乙腈去蛋白質(zhì)，正己烷去脂肪，飽和二氯甲烷萃取，上清液經(jīng)甲醛在酸性條件下沸水浴衍生化后，在激發(fā)波長327 nm、發(fā)射波長409 nm處用高效液相色譜熒光檢測器檢測。結(jié)果顯示：該方法測定雞組織中氨芐西林的檢測限為3.5 μg·kg-1(S/N=3)、定量限為10.0 μg·kg-1(S/N=10)。氨芐西林在雞組織樣品中平均回收率在75.31%～85.87%，變異系數(shù)均低于10.20%。各試驗組京海黃雞分別按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量內(nèi)服氨芐西林，每天1次，連續(xù)7 d給藥后，休藥4 h(零休藥期)，各組織中氨芐西林的殘留量最高，并在休藥后第3天迅速降低。休藥第5天后所有組織中氨芐西林殘留量均低于最高殘留限量(50 μg·kg-1)，休藥第9天各組織中氨芐西林殘留量均低于檢測限。休藥后相同時間點雞肌肉中藥物殘留量最低，肝中的藥物殘留量最高；氨芐西林在腎中殘留比肌肉、肝消除緩慢且消除時間長。氨芐西林在雞肌肉、肝和腎中的殘留量均與給藥劑量呈正相關(guān)。根據(jù)WT1.4軟件按95%置信區(qū)間計算所得，建議黃羽肉雞按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量給藥，每天1次，連續(xù)7 d后，其休藥期(WT)分別為4和5 d。

氨芐西林；高效液相色譜熒光檢測法；殘留消除；雞組織

氨芐西林(ampicillin，AMP)又稱氨芐青霉素，為半合成青霉素，對大多數(shù)革蘭陰性菌(如大腸桿菌、變形桿菌、沙門菌、嗜血桿菌、布魯菌和巴氏桿菌等)均有較強(qiáng)的作用，與氯霉素、四環(huán)素相似或略強(qiáng)，但毒性作用小于氯霉素、四環(huán)素，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。這種廣泛應(yīng)用導(dǎo)致AMP在可食性組織及環(huán)境中的污染，導(dǎo)致人群過敏及細(xì)菌耐藥性等問題[1-2]。因此中國[3]和歐盟[4]均對家禽組織中的AMP最高殘留限量(MRLs)作出規(guī)定，規(guī)定雞組織中的MRLs不超過50 μg·kg-1。此外，歐盟和日本等國家將AMP列入進(jìn)口動物源性食品的必檢項目[4-6]，所以研究動物組織中AMP的殘留檢測方法及其殘留消除規(guī)律具有重要的意義。

目前，國內(nèi)外關(guān)于雞組織中AMP的殘留檢測方法及藥物代謝研究雖有報道[2,7-9]，也已制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 20755-2006)，但雞組織中AMP的殘留消除規(guī)律的研究尚未見報道。本試驗在國內(nèi)飼養(yǎng)條件下，連續(xù)7 d，每天1次，按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量分別給京海黃雞內(nèi)服AMP，測定停藥后不同時間雞組織中AMP殘留量的變化，研究AMP在雞組織中的殘留消除規(guī)律，為AMP的臨床合理用藥以及休藥期的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

選取16周齡健康京海黃雞126羽，公、母各半，隨機(jī)分為3 組，分別為氨芐西林正常劑量組(54羽)、氨芐西林雙倍劑量組(54羽)、空白對照組(18羽)。試驗雞均單籠飼養(yǎng)，給藥前分別稱重、編號。試驗前預(yù)飼1周，飼喂不含任何抗菌藥物的全價飼料(于江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司飼料廠自制)，自由飲水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑及其配制

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，德國Labor Dr.Ehrenstorfer Schaefers，批號C10243080；氨芐西林原粉：純度97.62%(實測含量)，江蘇倍康藥業(yè)有限公司；乙腈：色譜純，美國Sigma公司；磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、二氯甲烷、三氯乙酸和甲醛：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水：ELGA公司超純水儀制備，電阻率為18.2 MΩ，符合國家試驗室用水規(guī)格(GB 6682-1992)。

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取AMP標(biāo)準(zhǔn)品10.10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，配制成 1.00 mg·mL-1的AMP標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-34 ℃保存，可穩(wěn)定保存2個月。

0.01 mg·L-1的KH2PO4溶液：稱取KH2PO41.36 g，用適量的超純水溶解，稀釋至1 000 mL，并用0.1 mg·L-1KOH溶液調(diào)pH至5.5。

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)工作液：將標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用超純水稀釋至需要的相應(yīng)質(zhì)量濃度，4 ℃保存，每次配制后使用3 d。

20%三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱取三氯乙酸20 g于100 mL容量瓶中，然后用超純水定容。

提取液：即NaH2PO4溶液(0.01 mg·L-1)，稱取1.20 g(精確到0.01 g)NaH2PO4，用適量的超純水溶解，定容到1 000 mL，用0.1 mg·L-1的NaOH溶液調(diào)pH至 4.5，4 ℃保存。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀(Waters515，配備兩臺515型高壓泵、2475型熒光檢測器、柱溫箱和色譜工作站等，美國Waters公司)；熒光分光光度計(日立F-4500，日本日立公司)；紫外分光光度計(UV-2401，日本島津公司)；高速冷凍離心機(jī)(5810R型，德國Eppendof公司)；高速離心機(jī)(5804R型，德國Eppendof公司)；電子分析天平(Ax 205型，AE260S型，瑞士 Mettler Toledo公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-8型，江蘇金壇市中大儀器廠)；超聲波清洗器(KQ-300DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；漩渦混合器(G560E型，美國Scientific Industries有限公司)；超純水制備儀(Purelab Option，英國ELGA公司)；恒溫磁力攪拌器(521-2型，上海司樂儀器有限公司)；無油真空泵(AP-01型，天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；溶劑過濾器(1 L，天津津騰實驗設(shè)備有限公司)；pH計(DELTA 320型，瑞士 Mettler Toledo公司)；組織勻漿機(jī)(ART MICCRA D-9型，德國ART-moderne Labortechnik e.k.公司)等。

1.4 給藥劑量、途徑及樣品采集

各試驗組雞給藥劑量分別按體重以120 、240 mg·(kg·d)-1給藥。投藥時將AMP原粉用無菌超純水配成凈含量為50 mg·mL-1的水溶液。每天上午8:00～9:00將藥液通過胃管直接注入到雞的嗉囊中，每天1次，連續(xù)7 d，于停藥后4 h(即零休藥期)、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d 共9個時間點分別屠宰各試驗組雞6 羽，分別取兩側(cè)胸肌肉、全肝和全腎，于-34 ℃冰箱中保存待測。

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品的提取與凈化 準(zhǔn)確稱取3.0 g剪碎后的雞肌肉(或肝或腎)組織，置于50 mL的具塞離心管中，添加0.01 mg·L-1的NaH2PO4溶液(pH 4.5)3 mL，17 000 r·min-1勻漿30 s。添加8 mL乙腈沖洗勻漿刀頭并轉(zhuǎn)入勻漿液中，振蕩混勻，水浴超聲輔助萃取15 min。4 ℃下10 700×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至另一干凈離心管。殘渣再加入2 mL磷酸二氫鈉溶液重復(fù)提取一次，勻漿后再添加8 mL乙腈振蕩混勻，超聲萃取10 min，合并上清液。添加5 mL用75%乙腈飽和的正己烷，振蕩混勻后靜置并去除上層溶液，重復(fù)去脂一次。添加15 mL超純水飽和的二氯甲烷溶液，振蕩，10 700×g離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至10 mL玻璃管。

1.5.2 樣品的衍生化 將玻璃管中收集的上清液超聲脫氣15 min，然后置于真空干燥器中濃縮至干。向玻璃離心管中加入超純水1 mL，然后分別加入20%三氯乙酸溶液200 μL、甲醛20 μL，漩渦混勻20 s，100 ℃水浴加熱30 min。反應(yīng)后取出樣品，水浴冷卻，將樣品轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，并用磷酸二氫鉀/乙腈(V∶V=60∶40)混合溶液洗滌玻璃管兩次，合并到2 mL離心管中，并定容至2 mL。12 100×g離心15 min，取上清液供高效液相色譜分析。

1.5.3 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：CNW?Athena C18WP柱，粒徑5 μm，4.6 mm ×250 mm i.d.；保護(hù)柱：C18，5 μm；流動相-乙腈：KH2PO4溶液(0.01 mol·L-1，pH 5.5)=40∶60(V/V)；流速：1.0 mL·min-1；激發(fā)波長327 nm，發(fā)射波長409 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：200 μL。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，依次用空白基質(zhì)提取液稀釋成質(zhì)量濃度分別為25(0.5MRL)、50(1MRL)、100(2MRL)、150(3MRL)、250(5MRL)、500(10MRL)、1 000(20MRL) μg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各濃度點準(zhǔn)確量取1 mL，按衍生化反應(yīng)步驟衍生，得到系列質(zhì)量濃度的AMP衍生產(chǎn)物，在選定的色譜條件下，按質(zhì)量濃度從低到高的順序分別進(jìn)樣200 μL作HPLC分析，每個質(zhì)量濃度重復(fù)4次，取平均值。以所得峰面積為縱坐標(biāo)(A)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此曲線作為待測樣品的定量曲線，并求出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5.5 回收率及精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，取剪碎的空白組織(雞肌肉、肝、腎)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，添加適宜質(zhì)量濃度的AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，使組織樣品中藥物質(zhì)量濃度分別為10、25、50和100 μg·kg-1，室溫下靜置30 min，作為空白添加試樣，每個質(zhì)量濃度水平設(shè)置6個平行，經(jīng)1.5.1、1.5.2的方法處理后，供HPLC測定，外標(biāo)法定量，計算出回收率。將回收率檢測剩余的樣品按4個高低質(zhì)量濃度合并成4份，得到4組不同藥物質(zhì)量濃度的樣品。在1 d內(nèi)不同時間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺高效液相色譜儀6次重復(fù)測定4組藥物質(zhì)量濃度的樣品，求得日內(nèi)(批內(nèi))精密度。在1周內(nèi)不同天用不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺高效液相色譜儀6次重復(fù)測定4組藥物質(zhì)量濃度的樣品，求得日間(批間)精密度。

1.5.6 檢測限和定量限的測定 分別用空白肌肉、肝、腎按1.5.1步驟制取空白基質(zhì)提取液，再分別向其添加一定質(zhì)量濃度的AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5.2步驟對樣品進(jìn)行衍生化，取上清液進(jìn)行HPLC分析，以信噪比(S/N)為3和10分別作為藥物在雞組織中的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，并計算LOQ質(zhì)量濃度點的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，驗證其可靠性。

1.5.7 雞組織中氨芐西林的測定 按外標(biāo)法，將雞組織(肌肉、肝、腎)中所測的AMP色譜峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到雞組織中AMP的殘留量。

2 結(jié) 果

2.1 色譜分離

在優(yōu)化的色譜條件下，測得雞肌肉、肝、腎中AMP的保留時間分別約為7.31、7.30、7.31 min，色譜峰峰形較佳，峰間隔時間較長，且均為基線分離峰?？瞻滋崛∫涸谏鲜鰰r間無干擾峰出現(xiàn)，以雞肌肉色譜圖為例，見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以AMP的色譜峰面積(A)對進(jìn)樣前AMP的質(zhì)量濃度(C，μg·kg-1)作圖，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線。AMP在25～1 000 μg·kg-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，且線性關(guān)系良好。AMP線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

2.3 樣品的回收率及精密度

AMP在雞肌肉、肝及腎中的回收率及精密度測定結(jié)果見表2。

由表2可見，在添加水平分別為10、25、50、100 μg·kg-1時，雞肌肉樣品中AMP的平均回收率在76.53%～85.87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.48%～8.82%；雞肝樣品中AMP的平均回收率在75.31%～83.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.29%～10.20%；雞腎樣品中AMP的平均回收率為78.76%～84.26%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.46%～9.29%。通過對樣品精密度進(jìn)行測定顯示，AMP在雞肌肉、肝、腎中的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于8.77%、9.21%和8.99%；日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于12.78%、11.64%和12.54%，結(jié)果表明該方法可靠，重復(fù)性高。

A.甲醛；B．AMP(75 μg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)品； C．空白雞肌肉；D．添加AMP標(biāo)準(zhǔn)品的空白雞肌肉； E．AMP給藥后的雞肌肉A.Formaldehyde；B.Standard sample of AMP (75 μg·mL-1)；C.Blank chicken muscle；D.Blank chicken muscle added with AMP；E.Chicken muscle after oral administration of AMP圖1 雞肌肉中AMP的高效液相色譜分析Fig.1 High performance liquid chromatograms of AMP in chicken muscle

表1 氨芐西林線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

Table 1 The linear regression equation，correlation coefficient and linear range of AMP

樣品Sample回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient線性范圍/(μg·kg-1)Linearrange肌肉MuscleA=0.7787C-0.67410.999825～1000肝LiverA=0.9763C-0.25860.999425～1000腎KidneyA=0.8246C-0.43210.999725～1000

表2 氨芐西林在雞肌肉、肝及腎中的回收率(n=6)

Table 2 Recoveries and precision of AMP in chicken muscle，liver and kidney

樣品Sample添加值/(μg·kg-1)Addedlevel回收率/%Recovery相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Intra-dayRSD日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%Inter-dayRSD肌肉Muscle10255010076.53±6.7581.65±5.6183.36±5.6785.87±4.718.826.876.805.488.776.747.236.8612.7810.5610.109.25肝Liver10255010075.31±7.6878.64±6.8780.45±5.6683.31±5.2410.208.747.046.299.218.748.147.9310.3811.649.339.26腎Kidney10255010078.76±7.3283.41±4.7483.63±4.5784.26±6.929.295.685.466.468.998.627.376.2412.5410.3710.249.66

2.4 靈敏度

應(yīng)用本試驗建立的檢測方法，測得雞組織(肌肉、肝、腎)中AMP的檢測限、定量限均分別為3.5 μg·kg-1(S/N=3)、10.0 μg·kg-1(S/N=10)。通過表2可見，添加質(zhì)量濃度為10.0 μg·kg-1時，AMP在雞組織中的回收率均大于70%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%，表明該LOD的可靠性。該方法靈敏度高，完全能滿足AMP在雞組織中殘留檢測的需要。

2.5 雞組織中氨芐西林殘留量的測定

雞組織中AMP的殘留量測定結(jié)果見表3，殘留消除曲線見圖2。

由表3和圖2可見，試驗組雞分別按體重以120、240 mg·(kg·d)-1的劑量給藥，每天1次，連續(xù)7 d內(nèi)服給藥，休藥后4 h(零休藥期)，各組織中AMP的殘留量最高；休藥后第3天AMP殘留量迅速降低；休藥后第5天所有組織中AMP殘留量均低于最高殘留限量(50 μg·kg-1)，雞肝AMP殘留量低于定量限；休藥后第7天，雞肌肉、雞肝中AMP的殘留量均低于檢測限(5 μg·kg-1)，腎中AMP的殘留量低于定量限；休藥后第9天，腎中AMP殘留量也低于檢測限(5 μg·kg-1)。相同時間點雞肝中的藥物殘留量在3種組織中最高，雞肌肉中殘留量最低。AMP在雞腎中殘留比雞肌肉、肝消除緩慢且消除時間長。AMP在雞肌肉、肝和腎中的殘留量均與給藥劑量呈正相關(guān)。

2.6 氨芐西林休藥期的計算

采用WT1.4軟件按95%置信區(qū)間計算AMP在雞肌肉、肝和腎中的休藥期，計算結(jié)果顯示AMP 120、240 mg·(kg·d)-1AMP劑量組在雞肌肉中的理論休藥期分別為2.81和3.36 d；在雞肝分別為3.50和4.80 d；在雞腎中分別為3.82和4.76 d。AMP在雞腎中的休藥期數(shù)據(jù)擬合圖見圖3。

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗采用Waters公司2475型熒光檢測器檢測，然而氨芐西林的母體β-內(nèi)酰胺沒有發(fā)光基團(tuán)，需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使其產(chǎn)生熒光基團(tuán)，才能被熒光檢測器檢測到。AMP的氨基(-NH2)結(jié)構(gòu)，在酸性條件下加熱可以與醛基生成熒光發(fā)光物，常用的反應(yīng)試劑有甲醛和水楊醛[11-12]，本試驗對比了兩者的衍生效果，發(fā)現(xiàn)AMP在與兩者衍生后均能被檢測到，但AMP與甲醛的衍生產(chǎn)物在同等條件下比其與水楊醛衍生的產(chǎn)物熒光性更強(qiáng)，因此選擇甲醛作為衍生試劑。熒光檢測器合適的激發(fā)波長及發(fā)射波長會提高待檢物的靈敏度，上機(jī)前對AMP衍生產(chǎn)物使用日立-F4500型熒光光度計進(jìn)行掃描，確定最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為327、409 nm。本試驗選擇0.01 mol·L-1的KH2PO4溶液(pH5.5)與乙腈溶液為流動相，對比不同比例的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)60∶40體積比等度洗脫效果最佳，各組織空白加標(biāo)樣(肌肉、腎、肝)中AMP色譜峰與干擾峰分離效果良好，峰間隔時間較長，峰型較佳，均為基線分離峰。

μg·kg-1

ND.未檢測到；-.未檢測

ND.Not detected；-.Not measured

A.120 mg·(kg·d)-1劑量組；B.240 mg·(kg·d)-1劑量組A.120 mg·(kg·d) -1 dose group；B.240 mg·(kg·d) -1 dose group圖2 雞組織中氨芐西林殘留消除曲線Fig.2 Residues eliminate curve of AMP in chicken tissues

A.120 mg·(kg·d)-1劑量組；B.240 mg·(kg·d)-1劑量組A.120 mg·(kg·d) -1 dose group；B.240 mg·(kg·d) -1 dose group圖3 氨芐西林在雞腎中休藥期擬合分析Fig.3 Plot of the withdrawal time calculation for AMP in chicken kidney at the time when the one-sided 95% upper tolerance limit is below the MRL for AMP (μg·kg-1) after administration of AMP

3.2 氨芐西林的穩(wěn)定性分析

AMP是在6-氨基青霉烷酸(6-APA)基礎(chǔ)上研制的，6-APA結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致其極不穩(wěn)定，易被水解。目前，關(guān)于AMP的穩(wěn)定性試驗大部分研究溫度的影響，很少涉及到pH對其穩(wěn)定性的影響[13-14]。本試驗配制20 mg·mL-1的AMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過磷酸鹽和氫氧化鈉調(diào)整pH，建立9個梯度(pH=3～11)，在-32 ℃的冰箱中保存，每天在合適的色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測，連續(xù)7 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMP在強(qiáng)堿(pH=8～11)、強(qiáng)酸(pH=3～5)條件下，降解較快，在pH為5時最穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)明顯的降解，進(jìn)一步探索了pH在5.1～5.9范圍內(nèi)的作用效果，pH為5.5時，AMP最穩(wěn)定。S.M.Mitchell等[15]探討了AMP在pH4～9范圍內(nèi)，不同溫度下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在堿性環(huán)境下抗生素最容易降解，其次中性環(huán)境，在酸性環(huán)境(pH=5～6)中最穩(wěn)定，與本試驗研究結(jié)果相似。因此本試驗的提取液、流動相的pH分別設(shè)置為4.5、5.5，以保證AMP在整個前處理及分析過程的穩(wěn)定性。AMP在3～100 μg·kg-1的添加質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，肌肉、肝、腎組織中的平均回收率分別為76.53%～85.87%、75.31%～83.31%、78.76%～84.26%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10.20%，日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.24%～9.21%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差在9.25%～12.78%，滿足獸藥殘留分析要求[16]。

3.3 氨芐西林在雞組織中的殘留消除規(guī)律

試驗組雞按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量給藥，每天1次，連續(xù)7 d，在休藥后4 h(零休藥期)到第15天的不同時間點測定肌肉、肝、腎中藥物殘留量，研究AMP在雞組織中的殘留消除規(guī)律。結(jié)果表明，休藥4 h(零休藥期)，各組織中AMP的殘留量最高，并在休藥后第3天迅速降低。休藥第5天后所有組織中AMP殘留量均低于最高殘留限量(50 μg·kg-1)，休藥第9天各組織中AMP殘留量均低于檢測限。休藥后相同時間點雞肉中藥物殘留量最低，雞肝中的藥物殘留量最高。AMP在腎中殘留比肌肉、肝消除緩慢，且消除時間長，與腎為藥物代謝與排泄器官有關(guān)。AMP在肌肉、肝和腎中的殘留量均與給藥劑量呈正相關(guān)。

3.4 氨芐西林在雞組織中的休藥期

農(nóng)業(yè)部278號文件規(guī)定[17]，AMP在肉雞臨床的休藥期是7 d，根據(jù)AMP在雞組織中的殘留檢測值，采用WT1.4軟件按95%置信區(qū)間計算AMP在京海黃雞肌肉、肝和腎中的休藥期，計算結(jié)果顯示120、240 mg·(kg·d)-1劑量組AMP在肌肉中的理論休藥期分別為2.81 d和3.36 d；在肝中分別為3.50和4.80 d；在腎中分別為3.82和4.76 d。參考中國和歐盟規(guī)定的AMP在雞組織中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(50 μg·kg-1)，為保障人民的生命健康，建議黃羽肉雞按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量內(nèi)服給藥，每天1次，連續(xù)7 d后，其休藥期(WT)分別為4和5 d。

4 結(jié) 論

黃羽肉雞分別按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量給藥，每天1次，連續(xù)7 d內(nèi)服給藥后，休藥4 h(零休藥期)，各組織中氨芐西林的殘留量最高，并在休藥后第3天迅速降低。休藥第5天后所有組織中氨芐西林殘留量均低于最高殘留限量(50 μg·kg-1)，休藥第9天各組織中氨芐西林殘留量均低于檢測限。休藥后肌肉中藥物殘留量最低，肝中的藥物殘留量最高，腎中殘留時間最長；各組織中AMP的殘留量與給藥劑量呈正相關(guān)。參考中國和歐盟規(guī)定的氨芐西林在雞組織中的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(50 μg·kg-1)，建議黃羽肉雞按體重以120、240 mg·(kg·d)-1劑量給藥，每天1次，連續(xù)7 d后，其休藥期分別為4和5 d。

[1] 張正芹．注射氨芐西林舒巴坦鈉引起過敏性休克1例的急救與護(hù)理[J]．中國誤診學(xué)雜志，2009，9(29)：7246． ZHANG Z Q.Emergency care and nursing of 1 case with allergic shock caused by injection of ampicillin sodium and sulbactam sodium[J].ChineseJournalofMisdiagnostics,2009,9(29):7246.(in Chinese)

[2] MACAROV C A，TONG L，MARTNEZ-HUéLAMO M，et al.Multi residue determination of the penicillins regulated by the European Union，in bovine，porcine and chicken muscle，by LC-MS/MS[J].FoodChem，2012，135(4)：2612-2621.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S]//農(nóng)業(yè)部公告第235號(附錄4).北京：農(nóng)業(yè)部，2002. Ministry of Agricalture of the People’s Republic of China.Maximum residue limit of Veterinary drugs in animal derived food[S]//Announcement No.235 of the Ministry of Agricalture of PRC.Beijing,2002.(in Chinese)

[4] Commission Regulation.Commission Regulation(EU)No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in food stuffs of animal origin[S]．2009.

[5] 葛志榮.食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品殘留限量-藥品卷(日本肯定列表制度)[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006. GE Z R.Positive list system in Japan,Maxium residue limits of agricaltural chemicals in food volume of agricultural chemicals[M].Beijing:Standard Press of China,2006.(in Chinese)

[6] 李 瑋， 艾連峰，郭春海，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶和奶粉中的青霉素類藥物及其主要酶解代謝產(chǎn)物[J].色譜，2013，31(10)：946-953. LI W,AI L F,GUO C H,et al.Simultaneous determination of penicillin and their major enzymatic metabolites in milk powder by high performance liguid chromatographytondem mass spectrometry[J].ChineseJournalofChromatography,2013,31(10):946-953.(in Chinese)

[7] GRANELLI K，BRANZELL C．Rapid multi-residue screening of antibiotics in muscle and kidney by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J]．AnalChimActa，2007，586(1-2)：289-295．

[8] 陳錦鳳．LC-ToF-MS和LC-QqQ-MS測定動物肌肉組織中的青霉素[J]．華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，46(3)：300-303． CHEN J F.Determination of penicillins in animal muscle tissues using LC-ToF-MS and LC-QqQ-MS[J].JournalofCentralChinaNormalUniversity(NaturalSciences),2012,46(3):300-303.(in Chinese)

[9] LIU W L，WU C Y，LI Y T，et al．Penicillin analyses by capillary electrochromatography-mass spectrometry with different charged poly monoliths as stationary phases[J]．Talanta，2012，101：71-77．

[10] GAMBA V，DUSI G．Liquid chromatography with fluorescence detection of amoxicillin and ampicillin in feeds using pre-column derivatization[J]．AnalChimActa，2003，483(1-2)：69-72．

[11] LUO W，HANSEN E B，ANG C Y W，et al.Simultaneous determination of amoxicillin and ampicillin in bovine milk by HPLC with fluorescence detection[J].JAgrFoodChem， 1997，45(4)：1264-1268.

[12] RIEDIKER S，RYTZ A，STADLER R H.Cold-temperature stability of fiveβ-lactam antibiotics in bovine milk and milk extracts prepared for liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry analysis[J].JChromatogrA，2004，1054(1-2)：359-363.

[13] OKERMAN L，VAN HENDE J，DE ZUTTER L.Stability of frozen stock solutions of beta-lactam antibiotics，cephalosporins，tetracyclines and quinolones used in antibiotic residue screening and antibiotic susceptibility testing[J].AnalChimActa，2007，586(1-2)：284-288.

[15] MITCHELL S M， ULLMAN J L， TEEL A L，et al.pH and temperature effects on the hydrolysis of three β-lactam antibiotics:ampicillin，cefalotin and cefoxitin[J].SciTotalEnviron，2014，466-467：547-555.

[16] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范(試行)》的通知[S]//農(nóng)牧發(fā)[2003]1號.北京：農(nóng)業(yè)部，2003. Ministry of Agriculture of People’s Republic of China.Test specification of veterinary drug residues (for trial implementation)[S].Doccment[2003] No.1 of Department of Animal Production of Ministry of Agriculture of PRC.Beijing,2003.(in Chinese)

[17] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．《獸藥停藥期的規(guī)定》[S]//農(nóng)業(yè)部第278號公告．北京：農(nóng)業(yè)部，2003． Ministry of Agriculture of People’s Republic of China.Requirements for drug withdrawal period[S]//Announcement No.278 of the Ministry of Agriculture of PRC.Beijing,2003.(in Chinese)

(編輯 白永平)

Ampicillin Residue Depletion in Chicken Tissues

SUN Li-rui1,2，XIE Xing3，XIE Kai-zhou1,2*，ZHANG Xiao-jie1,2，WANG Jian-feng1,2， CUI Lu-lu1,2，LIU Jian-yu1,2，ZHANG Gen-xi1,2，DAI Guo-jun1,2，WANG Jin-yu1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China； 2.KeyLaboratoryforAnimalGenetic，Breeding，ReproductionandMolecularDesignofJiangsuProvince，Yangzhou225009，China；3.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

A study on ampicillin (AMP) residue depletion was conducted in chicken tissues.AMP was extracted from chicken tissues with sodium dihydrogen phosphate solution.After being deproteinizated with acetonitrile and degreased in n-hexane saturated，the analyte was extracted by saturated dichloromethane.The supernatant was reacted with formaldehyde under acidic and boiling conditions.Finally，AMP was determinated by high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detector.The excitation wavelength was set at 327 nm and emission wavelength was set at 409 nm.The average recovery in chicken tissue was 75.31%-85.87% with coefficients of variation (CV) lower than 10.20%.The limit of detection (LOD) was 3.5 μg·kg-1(S/N=3) and the limit of quantitation (LOQ) was 10.0 μg·kg-1(S/N=10).After the chickens were orally administered successively AMP of 120 mg·kg-1and 240 mg·kg-1of body weight one time every day for 7 days，the maximum residues of AMP in chicken tissues were detected at 4h after final administration.Concentrations of AMP fell sharply at the 3th withdrawal day，all lower than MRL (50 μg·kg-1) at the 5th withdrawal day，and all lower than LOD (5.0 μg·kg-1) at the 9th withdrawal day.At the same time definition，the concentration of AMP in muscle was lowest，but highest in liver.However，AMP in kidney needed more time for depletion.The residues of AMP in chicken tissues were all positively correlated with AMP orally administered doses.The concentration-time dates were analyzed by WT1.4 software to get the withdrawal time (WT) with 95% upper tolerance limit，the WT advised in normal dose group was 4 d，and in double dose group was 5 d.

ampicillin；HPLC with fluorescence detection；residue depletion；chicken tissues

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.017

2014-04-30

國家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-42-G23)；“十二五”國家科技支撐計劃(2014BAD13B02)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目；揚州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”項目

孫禮瑞(1990-)，男，山東青島人，碩士生，主要從事畜產(chǎn)品品質(zhì)、安全與環(huán)境控制的研究，Tel： 0514-87997205，E-mail:yzslr1222@foxmail.com

*通信作者：謝愷舟，E-mail:yzxkz168@163.com

S859.84

A

0366-6964(2015)01-0130-08