施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法的建立

張永強(qiáng)，吳曉東，趙永剛，王志亮

(中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法的建立

張永強(qiáng)，吳曉東，趙永剛，王志亮*

(中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

擬建立施馬倫貝格病毒(SBV)S基因焦磷酸測序檢測方法，用于施馬倫貝格病毒病的快速檢測和確診。通過對公開發(fā)表的SBVS基因序列與布尼病毒科其他11種病毒S基因進(jìn)行比對，找出不同病毒變異區(qū)域集中且變異區(qū)域兩側(cè)保守的序列片段，基因合成，體外轉(zhuǎn)錄，作為基因擴(kuò)增模板。在特異性變異序列兩端的保守區(qū)域設(shè)計擴(kuò)增引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。在保守區(qū)域設(shè)計雙向測序引物，對RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向焦磷酸測序。通過比對測序結(jié)果，確定是否為SBV核酸序列；優(yōu)化條件，確定檢測方法的敏感性、特異性和重復(fù)性，建立SBVS基因焦磷酸測序檢測方法。結(jié)果：建立的施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法擴(kuò)增基因片段長度為166 bp；敏感性為可檢測到104個拷貝；每一條測序引物可準(zhǔn)確測出50 bp左右核酸序列，雙向測序可準(zhǔn)確測出100 bp左右核酸序列，具有較好特異性，完全滿足施馬倫貝格病毒病確診要求；重復(fù)測序3次，均能準(zhǔn)確測出100 bp左右核酸序列。本研究建立的施馬倫貝格病毒病焦磷酸測序檢測方法，可用于施馬倫貝格病毒病的檢測和確診，整個檢測過程可在1 d內(nèi)完成，大大縮短了確診時間。

焦磷酸測序；施馬倫貝格病毒；S基因

施馬倫貝格病毒病是由施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)引起的蟲媒病毒性傳染病，因最早于2011年11月在德國西部施馬倫貝格小鎮(zhèn)被發(fā)現(xiàn)而得名。SBV是有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)[1]。SBV主要感染綿羊、牛(包括野牛)和山羊等反芻動物，不感染人[2]。該病毒可經(jīng)蠓等吸血昆蟲叮咬而傳播[3]，成年牲畜感染后表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、乏力等癥狀，產(chǎn)奶量降低；而懷孕期動物感染后往往導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)和死產(chǎn)，新生幼畜發(fā)生關(guān)節(jié)彎曲積水性無腦綜合征(arthrogryposis hydranencephaly syndrome， AHS)，表現(xiàn)為畸形、大腦發(fā)育不全、脊柱彎曲、關(guān)節(jié)無法活動等病癥[4-5]。該病自2011年發(fā)現(xiàn)以來，不斷有新的疫情報告，現(xiàn)已蔓延至歐洲中部、北部大部分國家，引起了歐盟和OIE等國際組織的高度重視。

傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷技術(shù)包括病毒分離與鑒定、RT-PCR、實時PCR等方法，這些方法都具有較好的敏感性和特異性，在疫病的診斷上發(fā)揮了巨大的作用，但同時也具有自身的一些缺陷。病毒分離和鑒定，耗時長，對檢測人員和檢測設(shè)備要求高；RT-PCR、實時PCR可能出現(xiàn)假陽性，需要通過測序進(jìn)行確診，延長了確診時間。

在分子生物學(xué)領(lǐng)域，最精確的診斷方法是基因測序。自1985年，焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencing technology，PSQ)[6]逐漸應(yīng)用于病原的快速確診，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶的級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光而實現(xiàn)檢測，其最大優(yōu)點是可以實現(xiàn)高通量、快速，自該技術(shù)發(fā)明以來，已廣泛應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析、細(xì)菌、真菌和病毒的分型、突變位點的檢測等。但其也有局限性，由于該項技術(shù)能測出的序列較短，要求目的序列變異區(qū)域相對集中，以便于測出完整變異區(qū)域；變異區(qū)域兩側(cè)需高度保守，以便于設(shè)計測序引物并確?？梢耘c所有基因型結(jié)合。本研究針對SBVS基因，比對包括SBV在內(nèi)的布尼病毒科12種病毒近千條序列，找出了符合上述要求的區(qū)域，建立SBVS基因的焦磷酸測序檢測方法，為該病的快速確診提供了技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit，T7 Transcription Kit購自Roche公司，膠回收試劑盒、DNA Marker購自大連寶生物有限公司、引物由大連寶生物有限公司合成，Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID購自Biotage AB公司，PyroMark Q96 MD儀器購自QIAGEN。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank BLAST結(jié)果，與SBVS片段具有較高同源性的病毒有Simbu virus、Shamonda virus、Sathuperi virus、Sango virus、Sabo virus、Peaton virus、Douglas virus、Aino virus、Oropouche virus、Akabane virus和Rift valley fever virus。下載上述病毒所有S片段基因序列，應(yīng)用Mega5.0軟件進(jìn)行比對，找出符合焦磷酸測序擴(kuò)增和測序引物設(shè)計要求的區(qū)域，運用PSQ Assay Design軟件設(shè)計SBV S擴(kuò)增引物以及正向和反向測序引物，并在相應(yīng)的擴(kuò)增引物5′端標(biāo)記生物素。詳見表1。

表1 引物名稱及序列

Table 1 Name and sequence of primers

焦磷酸測序引物TypeofPyrosequencing引物名Primer序列(5'→3')SequenceForwardPyrosequencingSBV-FFGCATATGTGKCATTTGASBV-FR(Biotin)Biotin-GGRAAATGGTTATTAACCSeq-FGAGTCTTCTTCCTYAAReversePyrosequencingSBV-RF(Biotin)Biotin-GCATATGTGKCATTTGASBV-RRGGRAAATGGTTATTAACCSeq-RTTRAGGAAGAAGACTC

1.3 模板制備

合成選取的SBVS基因片段，體外轉(zhuǎn)錄制備RNA，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR條件優(yōu)化

以制備的RNA為模板，以不同退火溫度進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，優(yōu)化反應(yīng)條件。RT-PCR產(chǎn)物一式兩份，一份送交公司測序，一份用于焦磷酸測序反應(yīng)。

1.5 焦磷酸測序反應(yīng)

1.5.1 測序單鏈模板的制備 根據(jù)Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應(yīng)操作說明制備測序單鏈模板。將45 μL RT-PCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的孔中，并加入測序引物，并在85 ℃的烘箱中放置2 min，取出冷卻后就可進(jìn)行焦磷酸測序。

1.5.2 測序反應(yīng) 根據(jù)PSQTM 96MA System儀器的軟件說明在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTPs和酶混合物(DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)；然后將試劑艙和PSQ 96板放入PSQ TM 96 MD Sys tem儀器中，進(jìn)行Pyrosequencing反應(yīng)。

1.6 敏感性試驗

分別用Roche、Invitrogen和TaKaRa公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒，以10倍稀釋的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，確定最優(yōu)反應(yīng)試劑和敏感性。

1.7 特異性試驗

優(yōu)化測序反應(yīng)，提高準(zhǔn)確測出的堿基序列，使測出的序列長度滿足待測樣品是否為SBVS基因序列的確診要求。

1.8 重復(fù)性試驗

將擴(kuò)增的RT-PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行3次焦磷酸測序，比較每次測得的序列結(jié)果，確定試驗的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR反應(yīng)

采用優(yōu)化的RT-PCR反應(yīng)條件以體外轉(zhuǎn)錄的

RNA為模板，用SBV擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出與目的條帶大小相符的特異性條帶，沒有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，滿足進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)的需要(圖1) 。

M.DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.SBV S 基因片段；2.陰性對照M.DL2000 DNA marker；1.SBV S gene segment；2.Negative control圖1 SBV S基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification of SBV S gene

2.2 焦磷酸測序反應(yīng)

對SBVS基因片段焦磷酸測序反應(yīng)正向和逆向測序均能準(zhǔn)確測出50 bp左右，雙向測序能準(zhǔn)確測出100 bp左右，完全滿足確診需要。靶序列的焦磷酸測序結(jié)果與普通測序結(jié)果完全一致，符合率為100%，證明該試驗具有很好的特異性(圖2)。

縱坐標(biāo)：峰的高度(光信號強(qiáng)度)用來判斷堿基的數(shù)目；橫坐標(biāo)：每個循環(huán)的堿基種類；正向測序結(jié)果顯示，共測出58個堿基，其中48個堿基完全可信，另外10個堿基比較可信；反向測序結(jié)果顯示，共測出51個堿基，其中49個完全可信，另外2個比較可信Y-axis is indicate the peak value of sequencing (optical signal strength) in order to identy the DNA base amount.X-axis is indicate the gene sequence.The forwarcl pyrosequencing result shows that 58 base were sequencing,48 base among them were confirmed correctly and the other 10 bases were relatively confirmed.The reverse pyrosequening result shows that 51 bases were sequencing,49 bases among them were confirmed correctly and the other 2 bases were relatively confirmed圖2 焦磷酸測序技術(shù)檢測SBV病毒S基因Fig.2 Detection molecular marker of S gene in SBV

2.3 敏感性試驗結(jié)果

以合成基因制備的RNA為模板，10倍系列稀釋后，分別用不同試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，Invitrogen公司RT-PCR試劑盒最為敏感，為102，經(jīng)計算其最低檢測出的拷貝數(shù)為104，其它兩種試劑盒最低檢測敏感性為103個拷貝。見圖3。

1～9分別為以109、108、107、106、105、104、103、102、101拷貝的RNA為模板；A.Invitrogen公司RT-PCR試劑盒；B.Roche公司RT-PCR試劑盒；C.TaKaRa公司RT-PCR試劑盒1-9 is 109，108，107，106，105，104，103，102，101 copies RNA templates.A.The results of RT-PCR kit made in Invitrogen Company；B.The results of RT-PCR kit made in Roche Company;C.The results of RT-PCR kit made in TaKaRa Company圖3 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity of the method

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

對每個RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行3次重復(fù)性檢測，檢測的結(jié)果均一致，證明該方法有很好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.5 特異性試驗結(jié)果

通常情況下，該測序反應(yīng)準(zhǔn)確和較準(zhǔn)確測出的堿基數(shù)為20～30 bp。作者經(jīng)優(yōu)化測序反應(yīng)后，提高了準(zhǔn)確測出的堿基序列，使正向和逆向測序反應(yīng)中準(zhǔn)確和較準(zhǔn)確測出的序列分別達(dá)到50 bp左右(圖2)，因此準(zhǔn)確測出序列可達(dá)100 bp左右，完全滿足證明待測樣品是否為SBVS基因序列的確診要求，證明該方法具有很好的特異性。

3 討 論

SBV主要感染綿羊、牛(包括野牛)和山羊等反芻動物[7]，主要經(jīng)蠓等吸血昆蟲叮咬傳播[8]，成年牲畜感染后表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、乏力等癥狀，產(chǎn)奶量降低；而懷孕期動物感染后往往導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎，新生幼畜發(fā)生AHS[9-10]，與赤羽病具有相似的臨床癥狀[11]。該病自2011年底發(fā)現(xiàn)以來，不斷有新的疫情報告，截止目前已在二十幾個國家發(fā)生[12]。中國目前尚無相關(guān)疫情，但隨著國際交流的進(jìn)一步深入，該病有傳入的風(fēng)險，因此急需建立必要的檢測技術(shù)。

焦磷酸測序技術(shù)是1985年發(fā)展起來的一種能夠通過對基因序列測定實現(xiàn)檢測和確診的新型檢測技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點[13]，其基本原理是設(shè)計帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增引物，通過PCR反應(yīng)生成含有生物素標(biāo)記的目的基因片段，然后制備測序單鏈模板。將待測單鏈模板與測序引物雜交結(jié)合，放入PSQTM96MD System中進(jìn)行測序反應(yīng)。與普通RT-PCR和real-time RT-PCR等檢測技術(shù)相比，該技術(shù)無需將PCR產(chǎn)物送交公司測序以便確診，從而大大減少了病原確診時間。同時，該項技術(shù)也有嚴(yán)格的應(yīng)用要求，首先片段不能太長，最好在100～200 bp；其次該項技術(shù)能準(zhǔn)確測出的序列較短，需要待測核酸的特異性變異區(qū)域比較集中，同時在該變異區(qū)域前面或后面的序列高度保守，以便于設(shè)計擴(kuò)增和測序引物。

布尼病毒科的成員通常利用S基因建立核酸檢測方法，如A.A.Chengula等建立了RVFS基因分子生物學(xué)檢測方法并進(jìn)行了應(yīng)用[13]，Y.Stram等建立了赤羽病和艾諾病毒的RT-PCR檢測方法[14]。本研究通過對GenBank中發(fā)表的布尼病毒科十余種病毒千余條S基因序列的比對分析，找出S基因67—233區(qū)域符合焦磷酸測序設(shè)計要求，S片段67—80 bp、217—233 bp區(qū)域在布尼病毒科中為高度保守區(qū)域，可以設(shè)計上下游擴(kuò)增引物，提高方法擴(kuò)增環(huán)節(jié)的敏感性；119—134 bp區(qū)域高度保守，用于設(shè)計正向和逆向測序引物，而79—118和135—181 bp區(qū)域在布尼病毒中高度變異，測出該區(qū)域的核酸序列即可確定待測病原為何種病毒。

總之，本研究所建立的SBV焦磷酸測序方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，為SBV的快速檢測和確診提供了一種可行方法，為防止施馬倫貝格病毒病傳入中國奠定了防控基礎(chǔ)。

[1] WALTER C T，BARR J N.Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses [J].JGenVirol，2011，92(Pt 11):2467-2484.

[2] TARLINTON R，DALY J，DUNHAM S，et al.The challenge of Schmallenberg virus emergence in Europe [J].VetJ，2012，194(1):10-18.

[3] DE REGGE N，DEBLAUWE I，DE DEKEN R，et al.Detection of Schmallenberg virus in different Culicoides spp.by real-time RT-PCR [J].TransboundEmergDis，2012，59(6):471-475.

[4] HERDER V，WOHLSEIN P，PETERS M，et al.Salient lesions in domestic ruminants infected with the emerging so-called Schmallenberg virus in Germany [J].VetPathol，2012，49(4):588-591.

[5] DE REGGE N，VAN DEN BERG T，GEORGES L，et al.Diagnosis of Schmallenberg virus infection in malformed lambs and calves and first indications for virus clearance in the fetus [J].VetMicrobiol，2013，162(2-4):595-600.

[6] ELAHI E，RONAGHI M.Pyrosequencing：a tool for DNA sequencing analysis [J].MethodsMolBiol，2004，255：211-219.

[7] ELBERS A R，MEISWINKEL R，VAN WEEZEP E，et al.Schmallenberg virus in Culicoides spp.biting midges，the Netherlands，2011[J].EmergInfectDis，2013，19(1):106-109.

[8] MANSFIELD K L，LA ROCCA S A，KHATRI M，et al.Detection of Schmallenberg virus serum neutralising antibodies[J].JVirolMethods，2013，188(1-2)：139-144.

[9] LOEFFEN W，QUAK S，DE BOER-LUIJTZE E，et al.Development of a virus neutralisation test to detect antibodies against Schmallenberg virus and serological results in suspect and infected herds [J/OL].ActaVetScand，2012，54：44.[2014-12-10].http://www.actavetscand.com/content/54//44.

[10] GARIGLIANY M M，BAYROU C，KLEIJNEN D，et al.Schmallenberg virus：a new Shamonda/Sathuperi-like virus on the rise in Europe[J].AntiviralRes，2012，95(2)：82-87.

[11] HECHINGER S，WERNIKE K，BEER M.Evaluating the protective efficacy of a trivalent vaccine containing Akabane virus，Aino virus and Chuzan virus against Schmallenberg virus infection [J/OL].VetRes，2013，44：114.[2014-12-10].http://www.veterinaryresearch.org/content/44/1/114.

[12] OIE.OIE Immediate notification report(Schmallenberg-Virus).[EB/OL] http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=11514，2014-03-26.

[13] CHENGULA A A，KASANGA C J，MDEGELA R H，et al.Molecular detection of Rift Valley fever virus in serum samples from selected areas of Tanzania[J].TropAnimHealthProd，2014，46(4)：629-634.

[14] STRAM Y，KUZNETZOVA L，GUINI M，et al.Detection and quantitation of akabane and aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR[J].JVirolMethods，2004，116(2)：147-154.

(編輯 白永平)

Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang*

(ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032,China)

The aim of the present study was to establish a pyrosequencing method targetingSgene for detection and identification of schmallenberg virus (SBV).In alignment with published more than 10 virusesSgene sequences which belong to Bunyaviridae and are highly homogenous with SBV.Adaptive sequence for pyrosequencing was synthesized andinvitrotranscripted to cRNA as the RT-PCR templates.After RT-PCR reaction，the products were detected with forward and reverse pyrosequencing and identified by genomic alignment.Results showed that the RT-PCR products were 166 bp.The sensitivity of the method that the minimum copies could be detected was 104 copies.The specificity that sequencing length by pyrosequencing was around 100 bp which could make a definite diagnosis for SBV.The results presented here demonstrate that the detection and identification method for SBV by pyrosequencing was established.The method can be used in fast diagnosis for SBV.

pyrosequencing；schmallenberg virus;Sgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

2014-05-26

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(奶牛)(NYCYTX-0305)

張永強(qiáng)(1977- )，男，山東鄒平人，博士，助理研究員，主要從事病毒分子生物學(xué)研究，Tel：0532-87839922，E-mail:zhangyq_l@163.com

*通信作者：王志亮(1966-)，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：zlwang111@163.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)01-0174-05