豬腎細(xì)胞源三種蛋白質(zhì)對豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制的調(diào)節(jié)作用

張 輝，唐青海，黃立平，危艷武，劉長明*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，哈爾濱 150001；2.南陽師范學(xué)院 南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，南陽 473061)

豬腎細(xì)胞源三種蛋白質(zhì)對豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制的調(diào)節(jié)作用

張 輝1，唐青海2*，黃立平1，危艷武1，劉長明1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/豬傳染病研究室，哈爾濱 150001；2.南陽師范學(xué)院 南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心/昆蟲生物反應(yīng)器河南省工程實(shí)驗(yàn)室，南陽 473061)

為了驗(yàn)證豬腎細(xì)胞系(PK-15)源3種蛋白質(zhì)基因(AP2α2、Elf4和ISCU)表達(dá)水平對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)復(fù)制的調(diào)節(jié)作用，采用RT-PCR擴(kuò)增這3種蛋白質(zhì)編碼基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體；同時設(shè)計(jì)這3種蛋白質(zhì)的RNAi片段，分別插入到pGPU6-GFP載體構(gòu)建shRNA干擾載體。以熒光定量PCR法檢測干擾效率，選取干擾效率較高的干擾載體，利用G418篩選轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體或干擾載體后的PK-15細(xì)胞。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)法檢測PCV2 LG毒株在這些細(xì)胞中的復(fù)制效率。結(jié)果表明，Elf4蛋白和ISCU蛋白基因過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)PCV2的復(fù)制；而AP2α2蛋白基因過表達(dá)對PCV2的復(fù)制無顯著影響。AP2α2、ISCU和Elf4這3種蛋白質(zhì)基因被干擾表達(dá)后均可降低PCV2復(fù)制效率，表明這3種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)對該病毒復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用。

豬圓環(huán)病毒2型；復(fù)制；AP2α2；Elf4；ISCU

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是斷奶后多系統(tǒng)消耗綜合征(PMWS)、皮炎和腎炎綜合征的主要病原[1-4]。PCV2基因組是一個環(huán)狀的、長約1.7 kb單鏈DNA。病毒基因組包含2個主要開放閱讀框(ORFs)起始于兩個相反的方向，其中ORF1位于正鏈編碼兩個復(fù)制蛋白(Rep和Rep’)，對通過滾環(huán)復(fù)制機(jī)制進(jìn)行復(fù)制的病毒是必須的[5-6]，而ORF2編碼衣殼蛋白(Cap)是病毒唯一的結(jié)構(gòu)成分和主要免疫原[7-11]。由于病毒基因組小，編碼能力有限，因此病毒復(fù)制循環(huán)依賴于宿主細(xì)胞酶類；Rep和Cap蛋白可能不僅分別具有復(fù)制酶和病毒包裝的功能，在病毒與宿主之間相互作用機(jī)制中起重要作用。I.Tischer等[12]報道PCV復(fù)制具有細(xì)胞周期依賴性的，其DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞周期的S期。E.Steiner等[13]試驗(yàn)表明PCV2復(fù)制效率和細(xì)胞自身的DNA復(fù)制無關(guān)。Q.Tang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PCV2的復(fù)制依賴于細(xì)胞周期S期和G2/M期，S期主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)Cyclin A的過表達(dá)能夠抑制PCV2的復(fù)制。S.Timmusk等[15]確定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子c-myc和中間絲蛋白(類似于人類的肌肉萎縮蛋白)與PCV2 Rep相互作用。這些數(shù)據(jù)說明，宿主分子參與了PCV2基因組的復(fù)制調(diào)節(jié)過程。

作者此前采用酵母單雜交技術(shù)從PK-15細(xì)胞cDNA文庫中篩選到一組與PCV2基因組頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列相互作用的宿主蛋白質(zhì)[16]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)擬克隆其中3種蛋白質(zhì)基因——豬配體相關(guān)的蛋白復(fù)合體α2亞基AP2α2(adaptor-related protein complex 2，alpha 2 subunit)、ETS相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Elf4(ETS-related transcription factor，Elf4)和鐵硫簇組裝酶ISCU(iron-sulfur cluster assembly enzyme，ISCU)基因，闡明這3種基因表達(dá)水平與PCV2復(fù)制效率之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究PCV2的復(fù)制、致病性與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)之間的作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株、質(zhì)粒及主要試劑

豬腎細(xì)胞系(PK-15)用于PCV2增殖，細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM營養(yǎng)液，含10%滅活胎牛血清，青、鏈霉素100 U(μg)·mL-1。PCV2 LG株、PCV2陽性、陰性血清和單克隆抗體(mAb)1D2為本實(shí)驗(yàn)室保存。pEGFP-C1真核細(xì)胞表達(dá)載體購自Clontech(Mountain View，CA，USA)，大腸桿菌DH5α細(xì)胞購自天根生物技術(shù)(北京)有限公司。SYBR real-time PCR 試劑盒和PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 基因克隆與序列分析

采用Trizol法提取PK-15細(xì)胞的總RNA，取2 μg總RNA，采用Prime Script Ⅱ First Strand cDNA Synthesis Kit 合成第一鏈cDNA。取2 μL產(chǎn)物采用引物AP2α2 F1/R1[根據(jù)AP2α2基因序列(GenBank No.XR_242779.2)設(shè)計(jì)]、Elf4 F/R[根據(jù)豬的Elf4基因序列(GenBank No.XM_005673902.1)設(shè)計(jì)]和ISCU F1/R1[根據(jù)豬的ISCU基因序列(GenBank No.XM_005674454.1)設(shè)計(jì)]進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和序列測定。通過GenBank中的BLAST進(jìn)行核酸序列比對分析。

1.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)重組質(zhì)粒pMD18T-AP2α2、pMD18T- Elf4和pMD18T-ISCU基因序列分別設(shè)計(jì)3對引物AP2α2-f1/r1、Elf4-f1/r1和ISCU-f1/r1(表1)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。利用AP2α2-f1/r1、Elf4-f1/r1和ISCU-f1/r1分別擴(kuò)增AP2α2、Elf4和ISCU三個基因的開放閱讀框(ORF)。將PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和BamHⅠ雙酶切后膠回收，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將AP2α2和ISCU基因分別克隆至pEGFP-C1載體；將PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1經(jīng)SalⅠ和SmaⅠ雙酶切后膠回收，T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將Elf4基因克隆至pEGFP-C1載體，獲得重組真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測序分析鑒定。

表1 PCR引物寡核苷酸序列設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件

Table 1 Oligonucleotide sequences of PCR primer and reaction conditions

引物名稱Name引物(5′?3′)Primer退火溫度/℃AnnealingtemperatureAP2α2?FCGGCCCAGAAAGCGGCGCTGGGACCCTGAG68AP2α2?RTAAAAATTGATCCCAAGATCCACCTTCTGCElf4?FATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGTGACCTGATCTTTGAGTTTG68Elf4?RTCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATGAGGGAAGTAGGGTISCU?FATGGCGTACTCCTCATCTCCATCGCTCTCACTCAC68ISCU?RTCATGTCTTCTCGGCCTCTCCTTTCTTGGGTTCTTAP2α2?f1ACGCGTCGACCCGGCCGTGTCCAAGGGGGACGGGAT68AP2α2?r1CGGGATCCCTAGGCGCCCTCTCGCCCCCGCCCCCACAGGCTElf4?f1ACGCGTCGACGCTATTACCCTGCAGCCCAGTGACCTGA64Elf4?r1TCCCCGCGGTCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATGAGGGAAGTAGGGISCU?f1ACGCGTCGACGCGGCGGCTGGCGCCGGCCGTCTAA68ISCU?r1CGGGATCCTCATGTCTTCTCGGCCTCTCCTTTCTTGGGTTCTTqAP2α2?F139GACAAGGCTCTGGACGGCT53qAP2α2?R275TGCTTCTCGGTGTATCTGqElf4?F888GGTGGTGATTGAAGACG56qElf4?R1146GACAAGCACGGTAGAGGTqISCU?F93GGCTCGGCTCTATCACAA53qISCU?R190CCAATCCGGTTCCAACATqACTB?F604CACGCCATCCTGCGTCTGGA62qACTB?R983AGCACCGTGTTGGCGTAGAG

引物AP2α2-f1、Elf4-f1和ISCU-f1下劃線序列均為SalⅠ酶切位點(diǎn)，AP2α2-r1和ISCU-r1下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，Elf4-r1下劃線序列為SmaⅠ酶切位點(diǎn)

Primer sequences underlined for AP2α2-f1，Elf4-f1 and ISCU-f1 areSalⅠenzyme recognize sites，for AP2α2-r1 and ISCU-r1 areBamH Ⅰ enzyme recognize sites，for Elf4-r1 areSmaⅠ enzyme recognize sites

1.4 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

為了抑制PK-15細(xì)胞中Elf4、AP2α2和ISCU內(nèi)源基因的表達(dá)，根據(jù)AP2α2、Elf4和ISCU基因序列在蘇州基因制藥公司Co.，Ltd(蘇州)分別設(shè)計(jì)了3個shRNA表達(dá)質(zhì)粒。將這3個基因片段(AP2α2-179-200、AP2α2-845-865、AP2α2-1511-1531、Elf4-47-67、Elf4-156-176、Elf4-906-927、ISCU-99-119和ISCU-292-312)分別克隆至pGPU6-GFP載體構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒pGPU6-GFP/AP2α2-179、pGPU6-GFP/AP2α2-845、pGPU6-GFP/AP2α2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-47、pGPU6-GFP/Elf4-156、pGPU6-GFP/Elf4-906、pGPU6-GFP/ISCU-292和pGPU6-GFP/ISCU-99，插入的序列見表2。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立

將處于指數(shù)生長期的PK-15細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時，更換新鮮的MEM 培養(yǎng)液，2 h后根據(jù)說明書將重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染試劑TurboFect(Fermentas，Glen Burnie，MD，USA)轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞，將8 μL的轉(zhuǎn)染試劑加到4 μg溶解的DNA中輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，以適當(dāng)密度傳代(1∶8～1∶10比例)，并加入終質(zhì)量濃度為1 500 μg·mL-1抗生素G418細(xì)胞培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)。間隔2 d 更換含相同質(zhì)量濃度的G418 細(xì)胞培養(yǎng)液1次，觀察細(xì)胞生長及死亡情況。同設(shè)未轉(zhuǎn)染的健康細(xì)胞為對照。待對照孔的細(xì)胞全部死亡后，將具有G418 抗性的陽性細(xì)胞持續(xù)在含有終濃度為800 μg·mL-1G418的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)20 d。熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

表2 干擾表達(dá)質(zhì)粒中的插入序列

Table 2 Inserted sequences in shRNA-expressing plasmids

載體名稱Plasmids插入序列(5′?3′)Inserts(5′?3′)pGPU6?GFP/AP2α2?179CACCGCAAGCTGCTCTTCATCTTCCTTCAAGAGAGGAAGATGAAGAGCAGC?TTGCTTTTTTGpGPU6?GFP/AP2α2?845CACCGCCTGGAGACGATTCTGAACATTCAAGAGATGTTCAGAATCGTCTCCA?GGCTTTTTTGpGPU6?GFP/AP2α2?1511CACCGGGAGTTTGGGAACTTGATAGTTCAAGAGACTATCAAGTTCCCAAACT?CCCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?47CACCGCAACGGGAATGGATGACATCCTTCAAGAGAGGATGTCAGTCCATTC?CGTTGCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?156CACCGCTGGACGATGTTCACAATGGTTCAAGAGACCATTGTTGAACATCGTC?CAGCTTTTTTGpGPU6?GFP/Elf4?906CACCGGACGAGAGAAGCGAAGTTACTTCAAGAGAGTAACTTCGCTTCTCTCG?TCCTTTTTTGpGPU6?GFP/shNCCACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAA?TTTTTTGpGPU6?GFP/ISCU?99CACCGCTCTATCACAAGAAGGTTGTTTCAAGAGAACAACCTTCTTGTGATAG?AGCTTTTTTGpGPU6?GFP/ISCU?292CACCGCAATTGCCTCCAGCTCATTATTCAAGAGATAATGAGCTGGAGGCAA?TTGCTTTTTTG

1.6 Western blot檢測

以真核表達(dá)載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，取細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次；加入裂解液，200 μL·孔-1，37 ℃孵育15 min；將裂解產(chǎn)物12 000 g離心5 min；取上清樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜上；用2%脫脂乳-PBS溶液封閉2 h；PBS-T(含0.05%Tween-20的0.01 mol·L-1PBS，pH7.2)洗膜3次，加入一抗(按1∶10 000比例用0.01 mol·L-1PBS稀釋的抗GFP標(biāo)簽的單抗)，在搖床上孵育1 h；棄一抗用PBS-T洗膜3次； 加入二抗(按1∶5 000比例用0.01 mol·L-1PBS稀釋的DyLightTM羊抗鼠IgG)避光孵育1 h，用PBS-T洗膜3次；采用Odyssey Infrared Imaging System系統(tǒng)顯示結(jié)果。

1.7 總RNA提取與熒光定量PCR

收集瞬時轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，根據(jù)使用說明書采用TRIzol-苯酚-氯仿提取法分離總RNA。為了定量AP2α2、Elf4和ISCU的mRNA，使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將2 μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。使用SYBR real-time PCR 試劑盒在熒光定量PCR系統(tǒng)上對cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，PCR程序：95 ℃ 10 s，52 ℃ 20 s，40個循環(huán)；95 ℃ 5 min。每個樣品通過與豬持家基因β-actin的閾值(Ct)的比值來標(biāo)準(zhǔn)化基因組含量。設(shè)計(jì)引物qAP2α2-F139/R275、qElf4-F888/R1146、qISCU-F93/R190和qACTB-F604/R983分別擴(kuò)增AP2α2、Elf4、ISCU和β-actin，引物序列見表1。

1.8 過表達(dá)與抑制表達(dá)細(xì)胞系對病毒增殖影響測定

以構(gòu)建的過表達(dá)細(xì)胞系pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和 pEGFP-ISCU，抑制表達(dá)細(xì)胞系 pGPU6-GFP/AP2α2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-906和pGPU6-GFP/ISCU-99及對照組pGPU6-GFP/shNC、pEGFP-C1細(xì)胞系和PK-15細(xì)胞分別與感染復(fù)數(shù)(moi)為1個TCID50/cell的PCV2 LG株，于37 ℃孵育96 h，細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清測定毒價。參考文獻(xiàn)[17]，用捕獲ELISA(一抗采用抗PCV2 Cap蛋白的1D2單抗)在405 nm波長下測定吸光光度值定量PCV2 LG的濃度；參考文獻(xiàn)[18]，在PK-15細(xì)胞中通過IPMA方法測定。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差異顯著性計(jì)算分析，差異顯著水平為*，P<0.05，差異顯著水平為**，P<0.01。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以PK-15細(xì)胞cDNA為模板，用PCR擴(kuò)增出這3種蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物(AP2α2、Elf4和ISCU)與預(yù)期大小2 601、1 989和919 bp相一致，如圖1顯示的特異性條帶，表明獲得了這3個蛋白質(zhì)的編碼基因。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．AP2α2基因；2．Elf4基因；3．ISCU 基因M.DNA marker；1．AP2α2 gene；2．Elf4 gene；3．ISCU gene圖1 AP2α2、Elf4和ISCU基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplification of AP2α2，Elf4 and ISCU genes by RT-PCR

2.2 重組真核表達(dá)載體的鑒定

重組載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU 雙酶切和凝膠電泳圖譜表明，從重組質(zhì)粒中切下了與AP2α2、Elf4和ISCU序列長度一致的片段(圖2)，表明目的基因成功克隆至pEGFP載體。測序結(jié)果表明，克隆的AP2α2蛋白基因編碼的氨基酸序列與GenBank下載序列No.XM_003122395.3同源性比對顯示(圖3A)：第20位氨基酸異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸；68位氨基酸序列缺失谷氨酸；805位氨基酸后插入17個氨基酸序列?？寺〉腅lf4蛋白基因編碼的氨基酸序列與GenBank下載的序列No.XP_003135417.1同源性比對，僅發(fā)生3處單個氨基酸突變：213位氨基酸苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸；392位氨基酸蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?03位組氨酸突變?yōu)榫彼?圖3B)。克隆的ISCU蛋白基因序列與GenBank下載的No.XP_003359187.1完全一致(圖3C)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1．重組載體pEGFP-AP2α2經(jīng)Sal Ⅰ和BamHⅠ雙酶切；2．重組載體pEGFP-Elf4經(jīng)SalⅠ和SmaⅠ雙酶切；3．重組載體pEGFP-ISCU經(jīng)SalⅠ和SmaⅠ雙酶切M.DNA marker；1．Recombinant plasmid pEGFP-AP2α2 digested by SalⅠ and BamHⅠ；2．Recombinant plasmid pEGFP-Elf4 digested by SalⅠ and SmaⅠ；3．Recombinant plasmid pEGFP-ISCU digested by SalⅠ and SmaⅠ圖2 重組表達(dá)載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid of pEGFP-AP2α2，pEGFP-Elf4 and pEGFP-ISCU by enzymes digestion

2.3 AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質(zhì)表達(dá)的Western blot檢測

將重組載體pEGFP-AP2α2、pEGFP-Elf4和pEGFP-ISCU轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)AP2α2、Elf4和ISCU 的細(xì)胞系。Western blot檢測表明，AP2α2、Elf4、ISCU和EGFP融合蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小依次約為120、100和46 ku(圖4)。而EGFP大小約為30 ku，推斷豬AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質(zhì)大小依次為90、70和16 ku。

2.4 shRNA干擾效果分析

采用熒光定量PCR檢測AP2α2、Elf4和ISCU的干擾效率，pGPU6-GFP/AP2α2-179、pGPU6-GFP/AP2α2-845和pGPU6-GFP/AP2α2-1511細(xì)胞中AP2α2 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量依次為1.0、0.7和0.5(圖5A)，其中pGPU6-GFP/AP2α2-1511的干擾效率為50%；pGPU6-GFP/Elf4-47、pGPU6-GFP/Elf4-156和pGPU6-GFP/Elf4-906細(xì)胞中Elf4 mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量依次為0.23、1.0和0.15(圖5B)，其中pGPU6-GFP/Elf4-47和pGPU6-GFP/Elf4-906的干擾效率分別為77%和85%； pGPU6-GFP/ISCU-99和pGPU6-GFP/ISCU-292細(xì)胞中ISCUmRNA的相對轉(zhuǎn)錄量分別為0.30和0.39(圖5C)，二者的干擾效率分別為70%和61%。因此分別選取干擾效率較高的pGPU6-GFP/APα2-1511、pGPU6-GFP/Elf4-906和pGPU6-GFP/ISCU-99 shRNA轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后得到穩(wěn)定抑制轉(zhuǎn)錄AP2α2、Elf4和ISCU的細(xì)胞系。

A～C.AP2α2、Elf4 和 ISCU推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列依次與GenBank參考序列比對A-C.Results of comparisons of amino acid sequence (AP2α2，Elf4 and ISCU ) with the reference sequences from GenBank，respectively圖3 AP2α2、Elf4和ISCU蛋白質(zhì)氨基酸序列比對Fig.3 Comparisons of amino acid sequence of AP2α2，Elf4 and ISCU

M．蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～3.融合蛋白EGFP-AP2α2、EGFP-Elf4和EGFP-ISCUM．Protein marker；1-3.EGFP-AP2α2，EGFP-Elf4 and EGFP-ISCU fusion proteins，respectively圖4 穩(wěn)定細(xì)胞系中EGFP-EAP2α2、EGFP-Elf4和EGFP-ISCU融合蛋白質(zhì)表達(dá)的Western blot鑒定Fig.4 Identification of fusion protein EGFP-AP2α2，EGFP-Elf4 and EGFP-ISCU expressed in stable cell lines by Western blot

2.5 三種蛋白質(zhì)過表達(dá)對PCV2復(fù)制的影響

采用IPMA和ELISA方法檢測PCV2 LG毒株在不同細(xì)胞株中的增殖效率，如圖6所示，PCV2 LG的復(fù)制效率在轉(zhuǎn)染pEGFP-ISCU的細(xì)胞系中極顯著增強(qiáng) (P<0.01)，轉(zhuǎn)染pEGFP-Elf4后的細(xì)胞系中也有顯著增加(P<0.05)。而相對于對照組PK-15和pEGFP-C1細(xì)胞系，AP2α2的過表達(dá)對PCV2 LG的復(fù)制沒有顯著影響。

2.6 三種蛋白質(zhì)沉默表達(dá)對PCV2復(fù)制的影響

ELISA和IPMA檢測結(jié)果(圖7)均顯示，AP2α2和ISCU沉默表達(dá)均能極顯著地抑制PCV2 LG的增殖(P<0.01)；如圖7A所示，相對于對照組PK-15和pGPU6-GFP/shNC，抑制Elf4的表達(dá)并沒有影響PCV2 LG的復(fù)制水平，而IPMA測定結(jié)果顯示，PCV2 LG在上述干擾細(xì)胞中的復(fù)制效率均極顯著降低(P<0.01) (圖7B)。

A～C.AP2α2 mRNA、Elf4 mRNA和ISCU mRNA在不同shRNA干擾細(xì)胞系中的相對轉(zhuǎn)錄量A-C.AP-2α2 mRNA，Elf4 mRNA and ISCU mRNA levels in different shRNA expression cell lines圖5 shRNA干擾細(xì)胞系中mRNA的相對轉(zhuǎn)錄量Fig.5 Relative mRNA levels in different shRNA expression cell lines

A．捕獲ELISA方法測定PCV2 LG的含量；B．IPMA方法測定PCV2 LG毒價A．Detection of PCV2 LG by capture-ELISA； B．Titration of PCV2 LG by IPMA圖6 過表達(dá)AP2α2、Elf4或ISCU后對PCV2復(fù)制的影響Fig.6 The effect of AP2α2，Elf4 or ISCU overexpression on PCV2 propagation

A．ELISA方法測定PCV2 LG的含量；B．IPMA捕獲方法測定PCV2 LG的毒價A．Detection of PCV2 LG by capture-ELISA； B．Titration of PCV2 LG by IPMA圖7 AP2α2、Elf4或者ISCU沉默表達(dá)對PCV2復(fù)制的影響Fig.7 The influence of AP2α2，Elf4 or ISCU down-regulation by shRNA on PCV2 propagation efficiency

3 討 論

鑒于PCV2基因組小，編碼蛋白質(zhì)能力有限，推測該病毒復(fù)制需要宿主細(xì)胞源酶類分子的參與，究竟哪些蛋白質(zhì)參與其中尚不清楚。前期以酵母單雜交技術(shù)篩選出3種PK-15細(xì)胞源宿主蛋白質(zhì)(AP2α2、ETS-4和ISCU)與PCV2基因組頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列相互作用。為進(jìn)一步闡明這3種蛋白質(zhì)基因表達(dá)水平對PCV2復(fù)制調(diào)節(jié)的作用，本研究從PK-15細(xì)胞中克隆AP2α2、Elf4和ISCU基因，構(gòu)建針對AP2α2、Elf4和ISCU基因的過表達(dá)和抑制表達(dá)細(xì)胞系，旨在闡明這3種蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)水平與PCV2復(fù)制的相關(guān)性。

PCV2在過表達(dá)細(xì)胞系pEGFP-AP2α2和抑制表達(dá)細(xì)胞系pGPU6-GFP/AP2α2-1511中的增殖滴度檢測結(jié)果表明，AP2α2蛋白在PK-15細(xì)胞中過表達(dá)對PCV2復(fù)制影響不顯著；而采用shRNA降低細(xì)胞內(nèi)源性AP2α2的表達(dá)量，干擾病毒復(fù)制效率達(dá)50%以上，極顯著地抑制了PCV2復(fù)制(P<0.01)。AP2蛋白復(fù)合體含有4個亞基(α2、β2、μ2和σ2)，其主要功能是作為配體將受體蛋白與網(wǎng)格蛋白連接，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用[19]。AP2α已被證明能夠負(fù)調(diào)節(jié)1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的復(fù)制效率，采用siRNA干擾AP2α的表達(dá)能夠顯著上調(diào)HIV的復(fù)制，這可能與該蛋白質(zhì)妨礙了HIV基因組DNA正常進(jìn)入細(xì)胞核有關(guān)[20]，且AP2α介導(dǎo)的HIV復(fù)制調(diào)控可能與未知的HIV-1基因組的DNA片段有關(guān)[21]。R.Chaudhuri等發(fā)現(xiàn)，HIV-1 Nef蛋白與AP2-網(wǎng)格蛋白互作加速CD4內(nèi)吞，從而下調(diào)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞受體CD4的表達(dá)，這是激發(fā)HIV-1感染者轉(zhuǎn)變?yōu)锳IDS的重要原因之一[22]。其過表達(dá)對PCV2的復(fù)制沒有影響，被干擾后反而有抑制作用。據(jù)此推測，該蛋白質(zhì)可能與PCV2基因組的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，可能是AP2α2負(fù)責(zé)將PCV2基因組由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。正常情況下，一定數(shù)量病毒感染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)AP2α2足夠把溶酶體中脫去衣殼蛋白的PCV2裸露DNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核中，一旦被RNAi之后，其運(yùn)輸能力受限，導(dǎo)致PCV2復(fù)制被抑制。

PCV2在Elf4蛋白過表達(dá)細(xì)胞系中的復(fù)制顯著增強(qiáng)。反之，以shRNA沉默細(xì)胞內(nèi)源性Elf4蛋白表達(dá)，干擾病毒復(fù)制效率達(dá)85%以上，表明PCV2的復(fù)制被顯著抑制。采用ELISA方法檢測結(jié)果表明，PCV2的復(fù)制沒有受到顯著影響。Elf4是一個轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠起始多種基因的轉(zhuǎn)錄，該蛋白質(zhì)還與自然殺傷細(xì)胞的形成和天然免疫功能有關(guān)[23]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Elf4在Ⅰ型干擾素IFNα/β應(yīng)答反應(yīng)中起重要調(diào)節(jié)作用[24]，這對機(jī)體的抗病毒感染防御十分重要[25]。Rep蛋白是PCV2基因組復(fù)制的主要復(fù)制酶[6，26-27]，有報道表明，干擾PCV2和PCV1Rep基因后，病毒在PK-15細(xì)胞中的增殖能力顯著下降[28]。綜合本研究數(shù)據(jù)，作者推測Elf4蛋白功能有可能是通過促進(jìn)PCV2 Rep蛋白的轉(zhuǎn)錄作用來提高PCV2復(fù)制效率。令人感興趣的是，鑒于ELISA測定值代表Cap蛋白含量，不是感染性的病毒粒子，推測Cap蛋白的轉(zhuǎn)錄與Elf4蛋白表達(dá)量無關(guān)。

PK-15細(xì)胞源ISCU蛋白過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)PCV2復(fù)制；而采用shRNA降低細(xì)胞內(nèi)源性ISCU的表達(dá)量，干擾病毒復(fù)制效率達(dá)70%以上，表明其能夠極顯著地抑制PCV2復(fù)制。ISCU為鐵硫簇組裝酶，屬于一種金屬酶，它在電子傳遞、底物結(jié)合與激活等方面起關(guān)鍵作用，且參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控[29-30]。T.Finsterbusch等研究證明有3種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(ZNF265、TDG和VG5Q)與Rep蛋白發(fā)生互作，這些蛋白質(zhì)與病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)[31]。據(jù)此推測，ISCU蛋白可能直接調(diào)控PCV2基因的轉(zhuǎn)錄，亦可能通過催化、調(diào)節(jié)Rep蛋白的酶活性實(shí)現(xiàn)PCV2 復(fù)制的調(diào)控。

本研究闡明了PK-15細(xì)胞源AP2α2、Elf4和ISCU3個基因表達(dá)量對PCV2復(fù)制的調(diào)節(jié)作用，三者可能在PCV2復(fù)制過程中不同的關(guān)鍵環(huán)節(jié)以不同的方式進(jìn)行調(diào)控，具體調(diào)節(jié)分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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(編輯 白永平)

Regulation Effect of Three Proteins Derived from Porcine Kidney Cells on Porcine Circovirus Type 2 Replication

ZHANG Hui1，TANG Qing-hai2*， HUANG Li-ping1，WEI Yan-wu1，LIU Chang-ming1*

(1.DivisionofSwineInfectiousDiseases，StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology，HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China；2.CenterforNanyangVeterinaryBiologicalEngineeringTechnology，HenanProvincialEngineeringLaboratoryofInsectBio-reactor，NanyangNormalUniversity，Nanyang473061，China)

To investigate the regulative effect of expression level of three proteins gene (AP2α2，Elf4 andISCU) derived from porcine kidney cell line (PK-15) on porcine circovirus type 2 (PCV2) propagation efficiency,the genes of three proteins were amplified by RT-PCR and then three eukaryotic expression vectors were constructed.The RNAi fragments of these proteins were designed and cloned into pGPU6-GFP vector to construct shRNA vectors respectively.The efficiency of interference was determined by real-time PCR and three shRNA expression plasmids with higher efficiency of interference were determined.The PK-15 cells transfected with eukaryotic expression vectors or shRNA were screened by antibiotics of G418.The propagation efficiency of strains PCV2 LG in the cell lines was investigated using a capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and an immunoperoxidase monolayer assay (IPMA).The results showed that Elf4 and ISCU overexpression increased PCV2 replication.In contrast，overexpression of AP2α2 exhibited no significant influence on PCV2 replication.In contrast，AP2α2，ISCU and Elf4 down-regulation by shRNA resulted in decreased PCV2 propagation，which demonstrated that these three proteins play a regulative role in PCV2 replication.

porcine circovirus type 2； replication；AP2α2；Elf4；ISCU

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.017

2014-12-19

國家自然基金青年基金(31101837)

張 輝(1987-)，女，山東泰安人，博士生，主要從事動物病毒學(xué)研究

*通信作者：唐青海，E-mail：qinghaitang109@126.com；劉長明，E-mail：lcm@hvri.ac.cn，F(xiàn)ax:0451-82733132

S852.659.2

A

0366-6964(2015)11-2040-10