內(nèi)皮素3在不同毛色綿羊皮膚中的差異表達(dá)

楊?yuàn)檴?，白俊明，范瑞文，耿建軍，焦丁興，周 英，董常生*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.河北省清河縣農(nóng)業(yè)局，清河 054000)

內(nèi)皮素3在不同毛色綿羊皮膚中的差異表達(dá)

楊?yuàn)檴?#，白俊明1#，范瑞文1，耿建軍1，焦丁興2，周 英1，董常生1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801；2.河北省清河縣農(nóng)業(yè)局，清河 054000)

本研究旨在探討內(nèi)皮素3在綿羊皮膚毛色中的作用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting和免疫組織化學(xué)對(duì)內(nèi)皮素3在黑色和白色綿羊皮膚中的表達(dá)差異進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，內(nèi)皮素3在黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量較高，是其在白色綿羊皮膚中的表達(dá)量的2.89倍，且差異極顯著(P<0.01)；Western blotting結(jié)果顯示，內(nèi)皮素3在黑色綿羊皮膚總蛋白中的表達(dá)量極顯著高于其在白色綿羊皮膚總蛋白中的表達(dá)量(P<0.01)；免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，內(nèi)皮素3在白色綿羊皮膚毛囊的毛乳頭上方、毛球底部及外根鞘呈陽(yáng)性表達(dá)，而在黑色綿羊皮膚毛囊的毛球底部和部分外根鞘呈陽(yáng)性表達(dá)。綜上表明，內(nèi)皮素3可能參與綿羊毛色形成。

內(nèi)皮素3；皮膚；綿羊

內(nèi)皮素(Endothelin，Edn)是由21個(gè)氨基酸組成的多肽，存在于血管內(nèi)皮和各種組織及細(xì)胞中，參與心血管功能的調(diào)節(jié)，在維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)方面有著重要作用。內(nèi)皮素包含3種異構(gòu)體：Edn1、Edn2和Edn3[1]。在這3種內(nèi)皮素異構(gòu)體中，Edn3對(duì)來(lái)源于神經(jīng)脊(NC)細(xì)胞的黑素細(xì)胞的發(fā)育有著主要作用[1]。在胚胎發(fā)生過(guò)程中，Edn3不僅控制起源神經(jīng)嵴黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)化的開(kāi)始并可以維持其表型；在體外Edn3可以促進(jìn)培養(yǎng)的正常的人體黑色素細(xì)胞、痣細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[2]。越來(lái)越多的研究表明：Edn3在促進(jìn)黑色素細(xì)胞增殖的同時(shí)對(duì)黑色素的合成也有重要的調(diào)節(jié)作用。另有研究證明內(nèi)皮素信號(hào)在黑色素細(xì)胞的發(fā)育和存活的過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用[3]。目前，人們對(duì)Edn3在黑色素細(xì)胞中黑色素生成和皮膚色素沉積的研究?jī)H僅局限在體外對(duì)人、鼠[4-6]、鵪鶉[7]等少數(shù)動(dòng)物，而對(duì)毛用動(dòng)物體內(nèi)的研究甚少。

綿羊是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的毛用動(dòng)物，毛色是綿羊的重要性狀之一，化學(xué)染色是羊毛實(shí)現(xiàn)色彩多樣性的主要手段，對(duì)人類(lèi)健康以及環(huán)境保護(hù)產(chǎn)生不良影響。因此，從分子水平改變綿羊毛色將具有重要的意義，而發(fā)掘毛色基因及其功能將為此提供理論依據(jù)。動(dòng)物毛色由黑色素的含量與分布決定，由多個(gè)基因調(diào)控[8]。關(guān)于Edn3在綿羊不同毛色形成過(guò)程中的作用未見(jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)以白色和黑色綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)Edn3在皮膚中的表達(dá)進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取白色和黑色成年雄性綿羊各3只。選取綿羊背側(cè)皮膚，凈毛后，用取皮器取綿羊皮膚組織3塊(0.8 cm2)。其中兩塊置于液氮中，分別用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting； 1塊置于4% 的Bouin’s固定液中，固定24 h，石蠟包埋，切成5 μm的切片，用于免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

兔抗內(nèi)皮素3多克隆抗體(博奧森)，山羊抗兔二抗(康為世紀(jì))，DAB顯色試劑盒(武漢博士德)，Trizol Reagent(Invitrogen)，2×Es Taq MasterMix(康為世紀(jì))，DL2000 DNA Marker(TaKaRa)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)，SYBR?PrimeSciptTM RT-PCR Kit(Life)。

1.3 引物設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)GenBank上的各個(gè)物種Edn3序列進(jìn)行Blast后，獲取保守序列并利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)熒光定量PCR擴(kuò)增引物，通過(guò)NCBI初步檢測(cè)引物的特異性。引物由華大基因公司合成。引物見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列和退火溫度

Table 1 Primer sequences and annealing temperature of PCR amplification of target genes

目的基因Targetgene引物序列(5′?3′)Primersequence產(chǎn)物/bpProductsEdn3F：TTTGCCTCTTCTTCCTTA，R：TATTCTCGGTAGTGTCCC163β?actinF：CCTGACCGGGAAGAGGAATC，R：AAAACAGGGGGTTGAACTC150

1.4 RNA提取和cDNA合成

用Trizol法提取總RNA。各取白色和黑色綿羊皮膚總RNA 1 μL，快速電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行綿羊皮膚cDNA合成，反應(yīng)體系：Oligo dT(50 μmol·L-1)或Random 6 mers(50 μmol·L-1)1 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1each)1 μL，總RNA ≤5 μg，用RNase free水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束，立即置于冰上冷卻。在此體系中再加入5×PrimeScript II Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL，PrimeScript II RTase(200 U·μL-1)1 μL，用RNase free水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃30～60 min，95 ℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后，置于冰上冷卻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照Life試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣本設(shè)3次重復(fù)，依次在冰上加樣：SYBR?Select Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA 1 μL，用RNase free水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，55 ℃30 s，72 ℃10 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因同樣反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束，由熔解曲線(xiàn)判定PCR反應(yīng)的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)以及熒光曲線(xiàn)的Ct值計(jì)算定量結(jié)果。數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件，應(yīng)用方差分析進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同樣本的2-△△CT法[9]用單因子方差分析，分析結(jié)果用“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SE)”表示，內(nèi)皮素3 mRNA的表達(dá)差別倍數(shù)用2-△△CT表示。

1.5 免疫組織化學(xué)

固定24 h后的綿羊皮膚進(jìn)行脫水透明后，在石蠟中進(jìn)行包埋，然后切片烘干進(jìn)行免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。試驗(yàn)步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，每張切片滴加一滴3%H2O2，置于37 ℃烘箱中，20 min用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶[8]；PBS清洗3次，滴加5%牛血清白蛋白，37 ℃烘箱放置20 min進(jìn)行封閉，甩掉封閉液，滴加1∶100兔抗Edn3多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜；取出后，25 ℃反應(yīng)30 min，PBS清洗3次。濾紙吸干PBS，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次。滴加DAB顯色試劑，顯色5 min，根據(jù)顯色情況終止顯色。脫水、透明后，用中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。用PBS取代一抗作為陰性比照，對(duì)染色結(jié)果的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.6 總蛋白的提取與Western blotting檢測(cè)

提取液氮內(nèi)剩余的綿羊皮膚組織的總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔總蛋白上樣量為100 μg，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫封閉1.5～2.0 h；將PVDF膜放入含有稀釋好的一抗的平皿中，4 ℃搖床過(guò)夜孵育；用TBST洗膜，每次10 min，共3次；加入二抗，37 ℃ 搖床孵育30 min，BST洗膜，加入ECL發(fā)光劑[9]，用顯影劑和定影粉進(jìn)行膠片曝光處理。用Image proplus 6.0軟件(Olympus)對(duì)綿羊皮膚組織總蛋白中的Edn3和β-actin免疫印跡結(jié)果進(jìn)行半定量分析：蛋白總量=條帶面積×灰度值，Edn3與內(nèi)參蛋白β-actin對(duì)比。數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同樣本的光密度用單因子方差分析，所得結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SE)”表示。

2 結(jié) 果

2.1Edn3基因的mRNA表達(dá)結(jié)果

從擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)上看，本研究結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形熒光增長(zhǎng)曲線(xiàn)，目的基因Edn3和內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)整體平行性較好，基線(xiàn)無(wú)明顯上揚(yáng)趨勢(shì)(圖1A)。從擴(kuò)增熔解曲線(xiàn)上看，曲線(xiàn)為單峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過(guò)程中，沒(méi)有非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，熒光強(qiáng)度均來(lái)于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，目的基因Edn3及內(nèi)參基因β-actin沒(méi)有非特異性擴(kuò)增及引物二聚體產(chǎn)生(圖1B)。結(jié)果表明，在mRNA水平，Edn3基因在黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量是白色綿羊皮膚的2.89倍。且二者表達(dá)差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

圖1 Edn3基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(A)和熔解曲線(xiàn)(B)Fig.1 PCR amplification plot(A)and dissociation curve(B) of Edn3 and β-actin gene

**.P<0.01。下同**.P<0.01.The same as below圖2 Edn3 mRNA在不同毛色綿羊皮膚中的表達(dá)Fig.2 Edn3 mRNA expression in sheep skins with different hair color

2.2 綿羊皮膚中Edn3蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，綿羊皮膚總蛋白中存在與兔抗Edn3多克隆抗體發(fā)生免疫陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白條帶，且分子質(zhì)量符合實(shí)際大小。對(duì)不同毛色的綿羊皮膚內(nèi)Edn3蛋白表達(dá)進(jìn)行定性分析。從圖中可以看出在黑色綿羊皮膚中，Edn3蛋白水平表達(dá)較顯著，而在白色綿羊皮膚中檢測(cè)到的信號(hào)較弱(圖3A)。應(yīng)用Inage proplus 6.0軟件對(duì)Edn3、內(nèi)參β-actin的免疫印跡進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示，Edn3蛋白在白色綿羊皮膚中的平均蛋白含量為0.18±0.074；在黑色綿羊皮膚中的平均蛋白含量為1.47±0.12，兩者差異極顯著(P<0.01)(圖3B)。

2.3 綿羊Edn3蛋白在皮膚組織中的分布

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Edn3在白色綿羊皮膚和黑色綿陽(yáng)皮膚的毛囊中均有免疫陽(yáng)性反應(yīng)，但不同毛色的綿羊皮膚毛囊其表達(dá)部位不同(圖4)。在白色綿羊中(圖4A、B)，Edn3免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞分布在皮膚毛囊的毛乳頭上方，毛球底部和外根鞘；在黑色綿羊中(圖4C、D)，Edn3免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在皮膚毛囊的毛球底部和部分外根鞘。

A.1～3、4～6.白色和黑色綿羊皮膚總蛋白中的陽(yáng)性印跡信號(hào)；B.印跡條帶的平均光密度分析。內(nèi)參為β-actin，數(shù)據(jù)用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示A.The bands were the positively blotting signal with the rabbit Edn3 polyclonal antibody and goat anti-rabbit IgG conjugated HRP as the second antibody.1-3 from sheep skins with white hair color and 4-6 from sheep skins with black hair color；B.The average intensity of blotting band was analyzed.The level of protein was normalized relative to β-actin.Bars in each panel represent the mean ± standard error圖3 Edn3蛋白在綿羊皮膚中的表達(dá)Fig.3 Edn3 protein expression in sheep skin

A和B.Edn3在白色綿羊皮膚中的定位；C和D.Edn3在黑色綿羊皮膚中的定位；A和C.陰性對(duì)照；B和D.試驗(yàn)組。1.毛乳頭上方；2.毛球；3.外根鞘A，B.Edn3 localization in sheep skin with white hair color；C，D.Edn3 localization in sheep skin with black hair color.A，C.Negative control；B，D.Experiment groups；1.Upper hair dermal papilla；2.Hair bulb；3.Outer root sheath圖4 Edn3蛋白在綿羊皮膚中的定位40×Fig.4 Localization of Edn3 protein in sheep skin 40×

3 討 論

哺乳動(dòng)物被毛的顏色主要是由沉著在皮膚內(nèi)黑色素的量及其種類(lèi)決定的，黑色素主要包括真黑色素(Eumelanin)和褐黑色素(Pheomelanin)兩類(lèi)，真黑色素和褐黑色素的相對(duì)數(shù)量決定了動(dòng)物皮膚與被毛顏色[10]。黑色素細(xì)胞是哺乳動(dòng)物毛色形成的基礎(chǔ)，在胚胎發(fā)育過(guò)程中黑色素細(xì)胞由神經(jīng)嵴細(xì)胞分化并定向遷移到全身各個(gè)組織，其定向分化、遷移與MITF、FGF-2、內(nèi)皮素以及諸多因子有關(guān)[11]。

內(nèi)皮素是參與黑色素細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的主要旁分泌因子之一，在其早期發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在白色綿羊皮膚毛囊的毛乳頭上方、毛球底部及外根鞘和黑色綿羊皮膚毛囊的毛球底部及外根鞘均存在Edn3陽(yáng)性免疫反應(yīng)物。而毛球是向毛干提供黑色素的部位，其含有大量黑色素細(xì)胞，胞質(zhì)中含有黑色素顆粒[13]。在哺乳動(dòng)物黑色素細(xì)胞中，G蛋白偶聯(lián)內(nèi)皮素受體B(Ednrb) 途徑功能的丟失或突變都會(huì)導(dǎo)致胚胎中黑色素細(xì)胞前體的數(shù)量減少，從而引起毛色的改變[14]。Edn3是Ednrb的配體[15]。說(shuō)明長(zhǎng)期的Edn3通過(guò)激活Ednrb2可以促進(jìn)黑色素細(xì)胞的分化。另有資料報(bào)道，Ednrb與MITF具有一定的機(jī)制關(guān)聯(lián)性[16]，MITF 可結(jié)合到與黑色素合成有主要關(guān)系的TYRP2 啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)控制它們的轉(zhuǎn)錄，TYRP2可以直接參與黑色素生成調(diào)控過(guò)程，調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的發(fā)育、生存和功能。證明Edn3結(jié)合Wnt3a 和 Kit-配體(Kitl、SLF和SCF)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞表達(dá)生黑素標(biāo)記物，Mitf 和Sox10，產(chǎn)生黑色素小體，從而產(chǎn)生黑色素[17]。因此，筆者認(rèn)為Edn3的表達(dá)差異使Ednrb和KIT差異性調(diào)控MITF的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控黑色素合成路徑上TYRP2和TYR的表達(dá)，導(dǎo)致黑色綿羊皮膚中色素含量升高。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)黑色綿羊皮膚中Edn3基因的表達(dá)水平顯著高于白色綿羊，可能支持Edn3與毛色相關(guān)的結(jié)論。

在體內(nèi)，缺失Ednrb或Kit信號(hào)肽都會(huì)引起部分成黑色素細(xì)胞的丟失，Edn3與Kit1共同作用可以促進(jìn)黑色素細(xì)胞的增殖、分化和存活。只有在Edn3和Kit1同時(shí)存在的條件下，才會(huì)引起成黑素細(xì)胞數(shù)量的顯著增加和產(chǎn)生具有功能完全的黑色素細(xì)胞[12]。KIT的激活作用可以快速引起MAPK介導(dǎo)的MITF磷酸化，與激活因子家族相互作用進(jìn)而調(diào)控MITF的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控黑色素沉著。但Edn3蛋白是否在毛囊的黑色素細(xì)胞中通過(guò)上調(diào)KIT和Ednrb表達(dá)，促使KIT和Ednrb與MITF作用，上調(diào)毛囊黑色素細(xì)胞中MITF蛋白的表達(dá)，參與綿羊毛色的形成，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

Edn3定位于綿羊皮膚毛囊中黑色素細(xì)胞分布的部位，且在不同毛色的綿羊皮膚中存在差異性表達(dá)，結(jié)果說(shuō)明Edn3與綿羊毛色形成過(guò)程具有一定的相關(guān)性。

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(編輯 程金華)

The Different Expression of Endothelin 3 in Sheep Skins

YANG Shan-shan1#，BAI Jun-ming1#，F(xiàn)AN Rui-wen1，GENG Jian-jun1，JIAO Ding-xing2，ZHOU Ying1，DONG Chang-sheng1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China；2.QingheCountyAgriculturalBureauofHebeiProvince，Qinghe054000，China)

To investigate the function of endothelin 3(Edn3) in sheep skins and the regulation of hair color formation，the differential expression of Edn3 in skins of black versus white sheep was examined.Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)，Western blotting and immunohistochemistry methods were performed.The results showed that the quantity expression of Edn3 mRNA in black sheep was 2.89 times than in white sheep(P<0.01)；the average protein expression of Edn3 in black sheep skin was higher than in white sheep skin on the optical density(P<0.01).The results of immunohistochemistry revealed that Edn3 was localized in the hair dermal papilla，lower of hair bulb and outer root sheath in hair follicles of sheep with white hair color，but was localized in lower of hair bulb and outer root sheath in hair follicles of sheep with black hair color.The differential expression and localization of Edn3 in skin of white versus black sheep suggests a potential role in hair color regulation.

endothelin3(Edn3)；skin；sheep

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.026

2015-01-08

國(guó)家“863”計(jì)劃(2013AA102506)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303119)；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2011-Z33)

楊?yuàn)檴?1987-)，女，河北石家莊人，博士生，主要從事羊駝毛色研究，E-mail：shanshan0321@163.com；白俊明(1984-)，男，山西忻州人，碩士，主要從事羊駝毛色研究，E-mail：baibai84aa@163.com。楊?yuàn)檴櫯c白俊明為并列第一作者

*通信作者：董常生，教授，主要從事生物工程研究，E-mail：cs-dong@sxau.edu.cn

S852.1

A

0366-6964(2015)11-2111-06