肌注馬波沙星在犢黃牛體內(nèi)的藥動學及半體內(nèi)抗菌后效應研究

曹長福，孫美珍，盧 燕，曾慶林，劉 偉，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/國家獸藥殘留基準實驗室，廣州 510642)

肌注馬波沙星在犢黃牛體內(nèi)的藥動學及半體內(nèi)抗菌后效應研究

曹長福，孫美珍，盧 燕，曾慶林，劉 偉，曾振靈*

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/國家獸藥殘留基準實驗室，廣州 510642)

旨在研究單次肌內(nèi)注射馬波沙星在犢黃牛體內(nèi)的藥動學及馬波沙星對多殺性巴氏桿菌的抗菌后效應。選用5頭健康犢黃牛按體重以2 mg·kg-1的劑量給藥，用高效液相色譜法測定馬波沙星的血藥濃度，使用WinNolin6.2藥物動力學軟件提供的非房室模型處理血藥濃度-時間數(shù)據(jù)。并測定馬波沙星對多殺性巴氏桿菌在預定時間點收集血清中的抗菌后效應(PAE)。馬波沙星在犢牛血清中的主要藥動學參數(shù)：Cmax2.04 μg·mL-1、Tmax0.83 h、AUC15.03 h·μg·mL-1、AUMC138.67 h·h·μg·mL-1、MRT9.17 h、t1/2β9.00 h、Vd1.80 L·kg-1、CL/F0.14 L·(h·kg)-1。當血清中馬波沙星濃度大約在2MIC、4MIC、8MIC時，其PAE的值分別為1.90、2.65、3.50 h。結果表明，犢牛肌注馬波沙星后，吸收相對較為迅速，分布廣泛，消除緩慢；對多殺性巴氏桿菌在血清中具有較長的抗菌后效應，且與暴露藥物呈明顯的濃度依賴性。

馬波沙星；犢黃牛；藥代動力學；多殺性巴氏桿菌；抗菌后效應

馬波沙星(marbofloxacin)又名麻保沙星，為喹諾酮類化合物第3代產(chǎn)品，是一種動物專用的新型氟喹諾酮類抗菌藥，最早由羅氏公司研制，Vetoquinol公司進一步開發(fā)并于1995年首次在英國上市，隨后相繼在法國、美國和歐洲上市[1-2]。目前，歐洲藥品評價局獸藥委員會已經(jīng)批準馬波沙星用于狗、貓、兔、牛和豬[3]。馬波沙星的抗菌作用機制主要是通過抑制細菌脫氧核糖核酸(DNA)合成酶而使細菌DNA的復制及蛋白質(zhì)的合成受到干擾，使細菌細胞不能再進行分裂，進而起到殺菌作用[4-5]，其對大部分革蘭陰性菌(如溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌)，部分革蘭陽性菌及支原體，甚至胞內(nèi)寄生菌(如布魯氏桿菌)、衣原體等具有廣泛的抗菌活性，但對厭氧菌效果較差[6]。馬波沙星的藥代動力學已經(jīng)在多種動物體內(nèi)進行了廣泛的研究，如豬[7]、牛[8-9]、狗[10]、奶牛[11]、羊[12]、貓[13]、家禽[5]等。本教研室已對成年期魯西黃牛進行了藥動學研究[9]，但是，對犢黃牛體內(nèi)的藥動學研究還未有報道。

抗生素后效應(PAE)是細菌和抗生素短暫接觸，當藥物清除后，細菌生長仍受到持續(xù)抑制的效應，是抗菌藥物對其作用細菌特有的效應[14]。PAE的提出為研究抗菌藥物藥效學和設計合理給藥方案提供了重要的參數(shù)。目前PAE主要有體外和體內(nèi)測定方法：體外PAE的測定方法是將一定濃度的藥物與細菌作用一定時間后，將藥物去除，觀察細菌恢復生長的情況；體內(nèi)PAE的測定方法是制造動物細菌感染模型，同時監(jiān)測動物體內(nèi)藥物濃度和感染部位的組織或體液細菌含量，如無中性粒細胞小鼠感染模型[15]、兔子組織籠感染模型[16]等。作者參考半體內(nèi)藥動藥效(exvivoPK/PD)同步模型的方法[9]，即肌注馬波沙星后，將不同時間點采集到的血清樣品與多殺性巴氏桿菌作用一定時間，去除藥物后，觀察細菌恢復生長情況。以其探討生物樣品基質(zhì)血清測定的PAE大小，以及暴露藥物濃度與PAE大小的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。去纖維綿羊血，購自廣州蕊特生物科技有限公司。

1.1.2 菌種 試驗菌：牛多殺性巴氏桿菌CVCC1669，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；質(zhì)控菌：大腸桿菌ATCC25922，購自美國菌種保藏中心。

1.1.3 受試藥物 馬波沙星對照品，純度99.0%，批號：14755000，德國Dr.Ehenstorfer GmbH公司。氧氟沙星對照品，純度 98.2%，批號：130454-201104，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。馬波沙星原料藥(純度99.0%)和馬波沙星注射液(規(guī)格：50 mL，5 g)由河北遠征藥業(yè)有限公司惠贈。

1.1.4 動物 魯西黃牛犢牛5頭，大約8月齡，體重(145±24)kg，來自華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，試驗期間自由采食干青飼草和飲水，每天飼喂一定比例的精料(不含抗菌藥物)。試驗前臨床觀察2周。

1.2 給藥及采樣

每頭牛按體重以2 mg·kg-1的劑量于臀部肌內(nèi)注射給藥，血清樣品分別于給藥前和給藥后 0.083、0.167、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24、30、36和48 h從牛左側頸靜脈采集血樣 5 mL 左右，置于不含抗凝劑的塑料離心管中，室溫下靜置30 min 并避免陽光照射，在 4 ℃冰箱放置 2 h 以加速血塊凝縮，然后在4 ℃條件下4 000 r·min-1離心10 min 分離血清。血清樣品分裝成兩份保存于-20 ℃條件下，一份用于血藥濃度的檢測，一份用于半體內(nèi)抗菌后效應(PAE)的測定。

1.3 血清樣品預處理

血清自然解凍后，準確量取 500 μL至15 mL 塑料離心管中，精密加入 2 μg·mL-1內(nèi)標(氧氟沙星)溶液25 μL，旋渦混勻，加入6 mL 三氯甲烷，置振蕩器上水平振蕩 25 min，6 000 r·min-1離心10 min，吸取下層全部有機相于10 mL玻璃離心管中，在40 ℃水浴中氮氣吹干，用1 mL流動相溶解，15 000 r·min-1離心10 min后，經(jīng)0.22 μm的一次性針式濾器過濾，取50 μL供HPLC測定。

1.4 色譜條件

高效液相色譜儀：Waters Alliance 2695 型，美國 Waters 公司。2475多波長熒光檢測器，檢測波長：激發(fā)波長295 nm；發(fā)射波長500 nm。色譜柱：Hypersil BDS-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)。流動相：四丁基溴化銨-磷酸氫二銨緩沖液(pH 2.7)∶甲醇(75∶25)；流速：0.8 mL·min-1。

1.5 標準曲線的制備

取適量馬波沙星儲備液，以超純水稀釋成系列工作液，之后量取一定體積的空白血清，然后進行系列添加，得到一系列標準添加濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5 μg·mL-1的樣品，旋渦混勻，靜置30 min后，按照上述樣品測定方法處理，將馬波沙星與內(nèi)標的色譜峰面積之比值(S)與相對應的藥物濃度(C)作線性回歸，用最小二乘法求得標準曲線方程和相關系數(shù)。

1.6 回收率及變異系數(shù)的測定

量取一定體積的空白血清，添加系列濃度的工作液，制得0.01、0.5和 5 μg·mL-1的低、中、高三個不同濃度的添加樣品。每批每個濃度均同時重復5個樣品，且均做3個批次，按照上述樣品測定方法處理，同時直接制得3個相當濃度的標準工作液，并直接進樣。將經(jīng)過預處理的血清樣品的藥物峰面積與直接進樣的藥物峰面積進行比較，計算馬波沙星批內(nèi)和批間的絕對回收率的平均值和標準差，并計算馬波沙星批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.7 血清中MIC 的測定

采用試管二倍稀釋法測定[9]。

1.8 馬波沙星對多殺性巴氏桿菌在血清中半體內(nèi)PAE的測定

根據(jù)預試驗藥動學的結果，將采集到的空白血清樣品和3、6、9、12、24 h采集的血清樣品解凍后，使用孔徑為 0.22 μm 的滅菌針式濾器過濾除菌。將對數(shù)期的菌懸液10 μL加入到500 μL預溫處理后的血清樣品中，制得的細菌濃度大約為107CFU·mL-1，置37 ℃的培養(yǎng)箱孵育1 h。采用離心除藥法(3 500 r·min-1，15 min)，離心后，去除上清450 μL，再用450 μL空白血清重懸，重復3次，相當于藥物稀釋1 000倍。然后取400 μL重懸的樣品血清加入到1.6 mL的預溫處理后空白血清中重建。置于37 ℃的培養(yǎng)箱孵育，此時為重建后的零時。重建后0、1、2、3、4、5、6、7和8 h分別取菌液0.1 mL作系列稀釋，于瓊脂平板上進行菌落計數(shù)，重復3次，取平均值。

各個時間點的試驗組CFU·mL-1增加1個對數(shù)數(shù)量級所需時間(T)，與空白樣品組CFU/mL增加1個對數(shù)數(shù)量級所需時間(C)的差值，即為PAE(單位h)，即PAE=T-C。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每頭犢牛的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用WinNonlin 6.2藥動學程序處理，用非房室模型分析方法計算藥動學參數(shù)。用Microsoft excel做非線性回歸分析。

2 結 果

2.1 馬波沙星在黃牛犢的藥動學研究

在上述檢測條件下，血清中雜質(zhì)峰幾乎沒有，并能將馬波沙星、內(nèi)標氧氟沙星色譜峰完全分離。將馬波沙星與內(nèi)標的色譜峰面積之比值(S)與相對應的藥物濃度(C)作線性回歸，在0.01～5 μg·mL-1范圍內(nèi)標準曲線線性關系良好(R2=0.999)，回歸方程為C=0.402 9×S+0.014 4。在空白血清中添加0.01、0.5和5 μg·mL-1三個不同濃度的絕對回收率在88.65%～101.23%，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均<10%。

藥物動力學參數(shù)：黃牛犢以2 mg·kg-1單劑量臀部肌內(nèi)注射馬波沙星注射液后，馬波沙星在血清中的血藥濃度-時間曲線見圖1，其數(shù)據(jù)采用 WinNolin6.2藥動學軟件提供的非房室模型進行處理。馬波沙星在犢黃牛血清中的藥物動力學參數(shù)見表1。

表1 犢牛肌注馬波沙星(2 mg·kg-1)后血清的藥動學參數(shù)(n=5)

Table 1 The pharmacokinetics parameters of marbofloxacin in serum after single i.m.administration in infancy yellow cattle(2 mg·kg-1)(n=5)

藥動學參數(shù)Pharmacokineticsparameterx-±sCmax/μg·mL-12．04±0．46Tmax/h0．83±0．30t1/2β/h9．00±0．57AUC0-∞/h·μg·mL-115．03±3．16AUC24/h·μg·mL-113．52±3．09AUMC0-∞/h·h·μg·mL-1138．67±34．76MRT/h9．17±0．63Vd/L·kg-11．80±0．43CL/F/L·(h·kg)-10．14±0．03

圖1 犢牛以2 mg·kg-1單劑量肌注馬波沙星后血清藥物濃度-時間曲線Fig.1 The concentration-time curves of marbofloxacin in serum after single i.m.administration in infancy yellow cattle(2 mg·kg-1)

2.2 馬波沙星在血清中半體內(nèi)的抗菌后效應研究

馬波沙星對多殺性巴氏桿菌在血清中的最小抑菌濃度(MIC)為0.075 μg·mL-1。經(jīng)不同時間點采集的血清樣品與多殺性巴氏桿菌(CVCC1669)孵育1 h重建后的生長曲線和抗菌后效應PAE的值分別如圖2、表2。對多殺性巴氏桿菌暴露在每個時間點采集的血清樣品后AUC/MIC與抗菌后效應的值(PAE)進行非線性回歸分析如圖3。

括號內(nèi)為相應時間點的藥物濃度(μg·mL-1)。log(cfu·mL-1)為平均值(n=5)Values(μg·mL-1) in brackets are the corresponding marbofloxacin concentration in the samples at different time points.Values of log(cfu·mL-1) are mean(n=5)圖2 犢黃牛單次肌內(nèi)注射2 mg·kg-1馬波沙星后血清樣品與多殺性巴氏桿菌(CVCC1669)孵育1 h后重建的生長曲線Fig.2 Regrowth curves of Pasteurella multocida(CVCC1669)exposed to serum samples for 1 h after i.m.administration at a dosage of 2 mg·kg-1

由此可見，馬波沙星對牛多殺性巴氏桿菌具有明顯的抗菌后效應，隨著暴露濃度的增加，抗菌后效應也隨著增加，但是，達到一定暴露濃度后，抗菌后效應PAE值不再隨暴露濃度增加而增大。為了便于比較，由圖3可知，當馬波沙星濃度在2MIC、4MIC、8MIC時，抗菌后效應PAE的值分別為1.90、2.65、3.50 h。

表2 經(jīng)不同時間點采集的血清樣品與多殺性巴氏桿菌(CVCC1669)孵育1 h后，AUC1 h/MIC的值與抗菌后效應PAE的值(n=5)

Table 2 The values of marbofloxacin concentration，AUC1 h/MIC and PAE afterPasteurellamultocidaexposed to serum samples collected at different time points(n=5)

采樣時間點/hTimepointsofsamplecollecting濃度(與暴露1h后的AUC相等)/(μg·mL-1)ConcentrationAUC1h/MIC(相當于×MIC)/hPAE/h000031．286±0．2817．142±3．733．76±0．9960．818±0．1710．911±2．673．69±0．9290．503±0．136．704±1．733．43±1．03120．327±0．084．361±1．072．98±0．41240．092±0．031．224±0．400．46±0．49

曲線代表最佳數(shù)據(jù)擬合模型。R2為相關系數(shù)The lines represent the best model fits of the data.R2 is the correlation coefficient圖3 AUC1 h/MIC的值與抗菌后效應PAE的關系Fig.3 Relationships between AUC1 h/MIC and post-antibiotic effects(PAE)

3 討 論

3.1 肌注馬波沙星在犢黃牛體內(nèi)的藥動學特征

據(jù)報道，馬波沙星在各動物體內(nèi)吸收快，如羊[6]、牛[8]、駱駝[17]、水牛[18]等，其達峰時間大約在0.5～1 h。本文犢黃牛肌注馬波沙星后，吸收相對較快(Tmax=0.83 h)，但比成年期魯西黃牛吸收慢(t1/2Ka=0.18 h，Tmax=0.43 h)[9]。峰濃度Cmax為2.04 μg·mL-1，這與P.K.Sidhu等[19]報道的一致，但是比其他動物的高[6，11-12，18-19]，包括成年期魯西黃牛(Cmax=1.68 μg·mL-1)[9]。藥時曲線下面積AUC為15.03 h·μg·mL-1，同等劑量下肌內(nèi)注射，比荷斯坦奶牛(AUC=10.11 h·μg·mL-1[11])、成年期魯西黃牛(AUC=12.46 h·μg·mL-1[9])、水牛(AUC=9.86 h·μg·mL-1[18])、羊(AUC=4.19 h·μg·mL-1[6])的高，但比自然發(fā)病的牛低(AUC=25.25 h·μg·mL-1[8])。馬波沙星在犢黃牛體內(nèi)消除較慢，消除半衰期(t1/2β)為9.00 h，比成年期魯西黃牛(t1/2β=5.20 h)[9]、荷斯坦奶牛(t1/2β=4.33 h)[11]、水牛(t1/2β=5.75 h)[18]、羊(t1/2β=3.96 h)[6]的長，但與自然發(fā)病的牛相當(t1/2β=8 h)[8]。很明顯，犢黃牛以上藥物的動學參數(shù)均大于成年期的魯西黃牛，這可能是由于不同年齡階段機體器官組織的功能狀態(tài)不同，尤其與肝藥物代謝酶系統(tǒng)和腎功能密切相關。

根據(jù)馬波沙星對牛呼吸系統(tǒng)常見病原菌如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌藥動藥效整合模型(PK/PD)的研究，我們可以通過下列公式估算出在犢黃牛肌注2 mg·kg-1給藥劑量的MIC折點值：AUC24 h÷PK/PDindex。根據(jù)Q.Shan等報道的馬波沙星在血清中清除多殺性巴氏桿菌的PK/PD折點值為109.62 h[9]，由14.093÷109.62=0.13 μg·mL-1，可知推薦劑量肌注2 mg·kg-1給藥劑量多殺性巴氏桿菌的MIC折點為0.13 μg·mL-1。同理，根據(jù)P.K.Sidhu等報道的馬波沙星在血清中清除溶血性曼氏桿菌的PK/PD折點值為119.6 h[6]，由14.093÷119.6=0.12 μg·mL-1，可知推薦劑量肌注2 mg·kg-1給藥劑量相對于溶血性曼氏桿菌的MIC折點為0.12 μg·mL-1。又因為感染動物的AUC要比正常動物的AUC大得多(26.1 h·μg·mL-1& 12.31 h·μg·mL-1)[8]，據(jù)此，以上兩種病原菌的MIC折點值要也大于上述估算值。由S.Kroemer等在歐洲關于牛呼吸系統(tǒng)病原菌敏感性調(diào)查報告，可知多殺性巴氏桿菌的MIC90、溶血性曼氏桿菌的MIC80為0.12 μg·mL-1[20]。由此可見，肌注2 mg·kg-1的給藥劑量對治療臨床上90%以上牛多殺性巴氏桿菌病和80%以上的溶血性曼氏桿菌病有效。

3.2 抗菌后效應(PAE)

氟喹諾酮類藥物PAE產(chǎn)生機制是藥物滲透入細菌細胞內(nèi)即與DNA旋轉酶結合，干擾DNA的復制。當藥物去除后，與細菌DNA旋轉酶結合藥物的解離及其功能恢復尚需一段時間，在此期間可使細菌DNA合成速度減慢，所以，仍存在持續(xù)被抑制的效應[14]。本文半體內(nèi)PAE試驗結果表明，馬波沙星在血清中對多殺性巴氏桿菌具有明顯的PAE，且呈濃度依賴性，即暴露濃度越大，PAE值也越大，但當濃度過高時，PAE增加不顯著，逐漸趨于穩(wěn)定，這與A.Pastor等[21]、王睿等[ 22]的報道相似。這可能是因為暴露藥物濃度增加時會占領更多的酶活性位點而造成細菌更嚴重的損傷，但當暴露藥物濃度超過多倍MBC時，酶活性位點達到飽和狀態(tài)而細菌PAE值趨于恒定[23]。當血清中馬波沙星濃度在2MIC、4MIC、8MIC時，其PAE的值分別為1.90、2.65、3.50 h，要比用人工配制培養(yǎng)基測定的PAE值要大得多(濃度在2MIC、4MIC、8MIC時，其PAE的值分別為0.98、1.5、1.8 h)[24]，這可能是生物樣品基質(zhì)如血清中含有一些抑菌或殺菌因子如免疫球蛋白、補體等。這提示用生物樣品基質(zhì)測定的PAE更加接近真實情況。

4 結 論

根據(jù)氟喹諾酮類藥物抗菌活性特征為濃度依賴性，同時結合馬波沙星在健康和發(fā)病牛體內(nèi)的藥動學特征以及抗菌后效應PAE，作者發(fā)現(xiàn)：目前，馬波沙星每天1次，按體重以2 mg·kg-1肌注的給藥方案對治療由多殺性巴氏桿菌或溶血性曼氏桿菌引起的絕大多數(shù)牛呼吸系統(tǒng)感染是有效的。

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(編輯 白永平)

Pharmacokinetic of Marbofloxacin in Infancy Yellow Cattle after Single Intramuscular Administrations andexvivothe Post-antibiotic Effects

CAO Chang-fu，SUN Mei-zhen，LU Yan，ZENG Qing-lin，LIU Wei，ZENG Zhen-ling*

(NationalReferenceLaboratoryofVeterinaryDrugResidues(SCAU)，CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642,China)

This experiment was conducted to study the pharmacokinetics parameters of marbofloxacin after single intramuscular administration in infancy yellow cattle and the Post-antibiotic effects(PAE) of marbofloxacin againstPasteurellamultocidain serum.Marbofloxacin was administered to 5 healthy infancy yellow cattle at a dose of 2 mg·kg-1of body weight，the concentrations of marbofloxacin in serum were determined by high-performance liquid chromatography and marbofloxacin concentration-time data in serum were analyzed using non-compartmental analysis of WinNolin6.2 programme.Furthermore，PAE of marbofloxacin againstPasteurellamultocidawere tested in serum collected at predetermined time point.The main pharmacokinetic parameters intramuscularly were as follows：Cmax=2.04 μg·mL-1，Tmax=0.83 h，AUC=15.03 h·μg·mL-1，AUMC=138.67 h·h·μg·mL-1，MRT=9.17 h，t1/2β=9.00 h，Vd=1.80 L·kg-1，CL/F= 0.14 L·(h·kg)-1.The PAE of marbofloxacin againstP.multocidaat the concentration levels of 2MIC，4MIC，8MIC in serum were 1.90，2.65，3.50 h respectively.It was noted that marbofloxacin was relatively rapidly absorbed，widely distributed and slowly eliminated after intramuscular administration.The PAE of marbofloxacin againstP.multocidain serum was obviously prolonged and dependent on concentration.

marbofloxacin；infancy yellow cattle；pharmacokinetic；Pasteurellamultocida；post-antibiotic effects

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.11.022

2015-03-17

國家自然科學基金(31372480)

曹長福(1986-)，男，山東曹縣人，碩士生，主要從事抗菌藥物的研究，E-mail：caochangfu68@yeah.net

*通信作者：曾振靈，男，教授，主要從事細菌耐藥性、藥動藥效學的研究，E-mail：zlzeng@scau.edu.cn

S859.7

A

0366-6964(2015)11-2078-07