牛囊胚ICM克隆多能性標(biāo)記基因與表面標(biāo)記的研究

崔莉莎，趙學(xué)明，郝海生，杜衛(wèi)華，馬友記，朱化彬*，王宗禮*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛囊胚ICM克隆多能性標(biāo)記基因與表面標(biāo)記的研究

崔莉莎1，2，趙學(xué)明2，郝海生2，杜衛(wèi)華2，馬友記1，朱化彬2*，王宗禮1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

本研究旨在探究牛類(lèi)胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES)的多能性標(biāo)記基因與表面標(biāo)記，為優(yōu)化牛類(lèi)ES細(xì)胞培養(yǎng)條件和相關(guān)研究提供依據(jù)。利用2i/LIF培養(yǎng)液，通過(guò)全胚接種及機(jī)械傳代法分離培養(yǎng)牛囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)，免疫熒光染色法檢測(cè)其多能性標(biāo)記基因與表面標(biāo)記；qRT-PCR檢測(cè)免疫磁珠法分選的牛囊胚ICM和滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophectoderm cell，TE)的多能性標(biāo)記基因的差異表達(dá)結(jié)果。試驗(yàn)成功分離出了牛囊胚ICM克隆，并體外培養(yǎng)至第10代，且各代克隆均呈現(xiàn)出了典型的干細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，ICM表面標(biāo)記SSEA1、SSEA4和TRA-1-60染色為陽(yáng)性，且多能性標(biāo)記基因OCT4、SOX2和NANOG在其中均有表達(dá)；OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表達(dá)存在差異(P<0.05)，其中SOX2 的差異極顯著(P<0.01)。綜上表明，2i/LIF培養(yǎng)液有助于牛囊胚ICM的培養(yǎng)；SOX2可能成為牛ICM克隆的候選多能性標(biāo)記基因。

牛；ICM；多能性標(biāo)記；qRT-PCR

胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ES)是來(lái)源于附植前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)、保持未分化狀態(tài)并能自我增殖的多能性細(xì)胞[1]。ES 細(xì)胞具有分化為機(jī)體所有細(xì)胞的潛力，所以可用于早期胚胎發(fā)育的研究[2]。自從M.J.Evans等[3]1981年建立了第1個(gè)小鼠 ES 細(xì)胞系后，陸續(xù)獲得了獼猴[4]、人[5]和大鼠[6]的ES細(xì)胞系，牛類(lèi)ES細(xì)胞系也相繼建立[1，7-15]，但是牛ES細(xì)胞系尚未成功建立。這主要是由于牛ES細(xì)胞多能性維持機(jī)理尚不清楚，迄今為止，主要還是借鑒研究小鼠和人ES細(xì)胞系的方法研究牛ES細(xì)胞。近年來(lái)，小鼠和人ES細(xì)胞研究取得了巨大進(jìn)展，其培養(yǎng)條件日趨成熟，ES細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)(如多能性基因和表面標(biāo)記等)也已比較完善[3，5]。階段特異性胚胎抗原(Stage-specific embryonic antigen，SSEAs)是ES細(xì)胞的重要多能性表面抗原標(biāo)記，其中 SSEA-1已被確認(rèn)為小鼠 ES 細(xì)胞的表面標(biāo)記，而OCT4、SOX2、NANOG等是可以鑒定小鼠ES細(xì)胞的特異多能性基因[3，16]。人ES細(xì)胞的表面標(biāo)記有SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，特異多能性基因有OCT4、SOX2、NANOG等[5]。由于物種間存在差異，這些分子標(biāo)記并不能鑒定牛ES細(xì)胞[17]。因此，探索牛ES細(xì)胞的多能性標(biāo)記基因及其表面標(biāo)記，揭示維持牛ES細(xì)胞多能性的機(jī)制，有助于找到適合牛類(lèi)ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件，促進(jìn)牛ES細(xì)胞系的成功建立[18]。

免疫磁珠分選法可根據(jù)細(xì)胞特異表面標(biāo)記分選細(xì)胞，利用這種方法可以獲得高純度的 ICM和滋養(yǎng)層細(xì)胞(Trophoblastic cell，TE)[19]。而采用qRT-PCR對(duì)獲得的高純度ICM和TE 細(xì)胞進(jìn)行分析，有助于探索牛ICM多能性維持基因[20]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始利用 2i/LIF培養(yǎng)液培養(yǎng)牛類(lèi)ES細(xì)胞，并建立了牛類(lèi)ES細(xì)胞系[14，20-21]，而對(duì)所建立的牛類(lèi)ES細(xì)胞系進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)多能性基因和表面標(biāo)記的表達(dá)，有助于探索牛ES細(xì)胞的多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，本研究采用全胚接種結(jié)合機(jī)械傳代法分離牛囊胚ICM，并通過(guò)免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)其多能性標(biāo)記基因與表面標(biāo)記。qRT-PCR檢測(cè)免疫磁珠法分選獲得的ICM和TE細(xì)胞，篩選ICM特異多能性基因，旨在探究牛類(lèi)ES細(xì)胞多能性標(biāo)記基因及表面標(biāo)記，為牛ES細(xì)胞研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與溶液配制

TCM199、DMEM和FBS購(gòu)自Gibco，LH和FSH 購(gòu)自BIONICHE公司，其余試劑均購(gòu)自 Sigma公司。卵母細(xì)胞成熟液：TCM199+10% FBS+1 μg·mL-1雌二醇+5 μg·mL-1FSH+5 μg · mL-1LH；小鼠胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS+100 U·mL-1青霉素+0.05 mg·mL-1鏈霉素。

1.2 體外受精囊胚的生產(chǎn)

1.2.1 牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng) 將從屠宰場(chǎng)取得的牛卵巢置于32～35 ℃生理鹽水中，保溫2～3 h送到實(shí)驗(yàn)室后，用真空蠕動(dòng)泵(12號(hào)針頭)抽取卵巢表面可見(jiàn)卵泡。撿出含3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)后，分別用卵母細(xì)胞洗液和卵母細(xì)胞成熟液洗兩遍，移入四孔板成熟培養(yǎng)液中(每孔750 μL成熟液，50枚COCs)，在5% CO2、37.5 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h。

1.2.2 體外受精 體外受精程序參照文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。在35 mm的培養(yǎng)皿中做50 μL的受精微滴，放入培養(yǎng)箱中平衡2 h。將在成熟液中培養(yǎng)22～24 h的卵母細(xì)胞移至平衡2 h的受精滴中，每滴15枚。然后取冷凍精液，在38 ℃水中解凍后，用受精液洗兩遍(1 800 r·min-1，每次8 min)后，棄上清液，用受精液懸浮，調(diào)整精子密度為1×106mL-1。取50 μL精子懸浮液加入到已放入卵母細(xì)胞的50 μL受精微滴中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h (5%CO2、38.5 ℃、飽和濕度)。

1.2.3 胚胎體外培養(yǎng) 用0.25%的透明質(zhì)酸酶消化受精8 h的受精卵，脫除顆粒細(xì)胞，用終止液(M199+10% FBS)和胚胎培養(yǎng)液(mCR1aa)[23]各洗2遍后，移入預(yù)平衡2 h以上的mCR1aa微滴中培養(yǎng)。48 h后，更換培養(yǎng)液為mCR1aa + 10% FBS，以后隔天半量換液。

1.3 飼養(yǎng)層的制備1.3.1 小鼠胎兒成纖維細(xì)胞系的建立 將12.5～13.5 d 的孕鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取其胚胎，去除胎鼠的頭、尾、四肢、內(nèi)臟，將剩余部分置于無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS中沖洗1～2次；然后將其剪成1 mm3以下的組織碎塊，加入0.05% trypsin-EDTA，放入培養(yǎng)箱(37.5 ℃、5% CO2、飽和濕度)中消化5 min，待消化完成后反復(fù)吹吸混勻。在消化液中加入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液[24]，終止消化。將單細(xì)胞懸液鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱(37.5 ℃、5% CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)。每日觀察，隔天換液，3～4 d后傳代。

1.3.2 飼養(yǎng)層的制備 用10 μg·mL-1的絲裂霉素C處理第2代的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞2～3 h。處理完成后用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS沖洗3～5次，0.25% 的trypsin-EDTA消化1～2 min后，用含有10% FBS的DMEM終止消化，再將細(xì)胞懸液離心3 min(1 000 r·min-1)。去上清，加入凍存液(DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1)，按合適密度凍存于液氮中備用。在全胚接種或者牛ICM克隆傳代前一天，將細(xì)胞接種于0.1%明膠涂層的6孔板中，放入培養(yǎng)箱(37.5 ℃、5%CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)，用作飼養(yǎng)層。

1.4 囊胚的接種

提前0.5 h將飼養(yǎng)層更換為胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液[25]，然后將培養(yǎng)7 d的IVF囊胚接種到飼養(yǎng)層上。置于培養(yǎng)箱(38.5 ℃ 5%CO2，飽和濕度)中培養(yǎng)，隔天半量更換培養(yǎng)液，等貼壁后可全量換液。

1.5 ICM的分離與傳代培養(yǎng)

接種7～10 d后，用機(jī)械分離法進(jìn)行第1次傳代：用1 mL注射器的針頭將ICM形成的細(xì)胞團(tuán)塊挑出，并分離為較小的細(xì)胞團(tuán)塊，轉(zhuǎn)移至新的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。之后每隔5～7 d進(jìn)行傳代，方法同1.4。

1.6 堿性磷酸酶染色和免疫熒光染色

利用ES細(xì)胞鑒定試劑盒(Millipore，USA﹠Canada)進(jìn)行AP染色和免疫熒光染色。

1.6.1 堿性磷酸酶染色 在中低密度下培養(yǎng)ICM克隆5 d后，用4%多聚甲醛固定1～2 min；棄固定液，1×Rinse buffer沖洗；染色劑(Fast Red Violet Solution∶Naphthol∶Water = 2∶1∶1)在室溫、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)ICM克隆15 min；棄染色劑，1×Rinse buffer沖洗；加入1×PBS后在顯微鏡下觀察陽(yáng)性克隆數(shù)。

1.6.2 免疫熒光染色 室溫下，4%的多聚甲醛固定ICM克隆15～20 min，1×Rinse buffer洗兩遍(每次5～10 min)；0.1%的Triton X-100透化細(xì)胞10 min，1×Rinse buffer洗兩遍(每次5～10 min)；封閉液(3%～5%BSA/TBST)封閉細(xì)胞30 min；再用封閉液把一抗稀釋到工作濃度(SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60的稀釋比例為1∶10～1∶50，OCT4、SOX2和NANOG的稀釋比例為1∶100～1∶1 000)，室溫下用一抗培養(yǎng)ICM克隆1 h；1×Rinse buffer洗3遍(每次5～10 min)；用1×PBS稀釋二抗(Rabbit Anti-mouse IgG-Fc/FITC、Goat Anti-mouse IgM/FITC和Mouse Anti-rabbit IgG/PE，稀釋比例均為1∶100～1∶1 000)，用二抗培養(yǎng)ICM克隆30～60 min；1×Rinse buffer洗3遍(每次5～10 min)；加入1×PBS覆蓋細(xì)胞后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 牛囊胚ICM和TE的分選

利用免疫磁珠分選法分選牛囊胚ICM和TE，具體參照文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行，略有改動(dòng)。

用結(jié)合有FITC的伴刀豆蛋白(ConA)標(biāo)記已去除透明帶的囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞；然后置于含有1 mmol·L-1EDTA 的DPBS (Invitrogen)中5 min，再移入trypsin-EDTA 溶液中，38.5 ℃下培養(yǎng)15 min；渦旋器將其分解成單細(xì)胞后，用含有1 mmol·L-1EDTA 和10% FBS 的DPBS來(lái)終止；細(xì)胞過(guò)濾器(BD Biosciences)過(guò)濾，收集通過(guò)過(guò)濾器的單個(gè)細(xì)胞；加入MACS buffer，500 g離心5 min，110 μL MACS buffer 重懸囊胚細(xì)胞；再加入10 μL結(jié)合有小鼠anti-FITC IgG1 的磁珠，在冰上、黑暗條件下，培養(yǎng)15 min；MACS 緩沖液洗3次后加入500 μL MACS 緩沖液重懸細(xì)胞，使其通過(guò)吸附在磁力架上的磁珠分離柱，并收集到離心管中，再用MACS 緩沖液沖洗兩遍磁力柱(每次500 μL)，從而獲得FITC陰性細(xì)胞(ICM)；將分離柱從磁力架上拿下后，用MACS 緩沖液沖洗3遍，并收集細(xì)胞懸液，從而獲得 FITC陽(yáng)性細(xì)胞(TE)。將分離得到的ICM和TE置于-80 ℃保存。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)牛囊胚ICM和TE多能性基因的差異表達(dá)

將通過(guò)免疫磁珠分選法獲得的ICM和TE進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)水平。采用PureLinkTM RNA Micro 試劑盒(Invitrogen)來(lái)提取RNA，具體方法參照操作手冊(cè)。提取RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增(引物見(jiàn)表1)，用β-actin作內(nèi)參基因。PCR的反應(yīng)體系為25 μL：17.3 μL超純水+2.5 μL 10×buffer + 2.0 μL鎂離子(25 mmol·L-1) + 0.2 μL dNTPs (25 mmol·L-1) + 0.5 μL上游引物(10 μmol·L-1) + 0.5 μL SYBR(20×)+ 0.5 μL下游引物(10 μmol·L-1) + 0.3 μLTaq酶(5 U·μL-1) + 1.2 μL模板(除模板外，均為Invitrogen公司產(chǎn)品)。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法[26]進(jìn)行分析。

表1 qRT-PCR引物

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行分析，并用ANOVA進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛囊胚ICM分離與培養(yǎng)

將培養(yǎng)7 d 的 IVF 囊胚全胚接種至飼養(yǎng)層上，接種培養(yǎng) 7～10 d 后，機(jī)械法將ICM克隆挑出并傳至新的飼養(yǎng)層上，之后每隔5～7 d采用機(jī)械法傳代。本試驗(yàn)將牛囊胚ICM克隆培養(yǎng)至第10代(圖 1)，克隆呈圓頂狀，高度聚集，并有明顯的邊界。

2.2 ICM克隆中多能性標(biāo)記基因及表面標(biāo)記檢測(cè)

堿性磷酸酶染色(圖2)和免疫熒光染色分別檢測(cè)第1代和第10代ICM克隆的多能性基因(OCT4、SOX2和NANOG)和表面標(biāo)記(SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60)的表達(dá)，染色結(jié)果均呈陽(yáng)性(圖3和圖4)。

2.3 牛囊胚 ICM 和 TE 的分選

用磁珠分選法分選牛IVF囊胚得到ICM和TE，經(jīng)檢測(cè)，二者的分離純度均達(dá)到90%以上。

2.4 ICM 和 TE 多能性基因的表達(dá)

qRT-PCR 驗(yàn)證免疫熒光染色中呈陽(yáng)性的多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)情況。結(jié)果如圖 5 所示，3個(gè)基因在 ICM和TE中均可表達(dá)，但I(xiàn)CM的表達(dá)量均高于TE(P<0.05)，其中SOX2基因表達(dá)差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 牛囊胚ICM體外培養(yǎng)及免疫熒光染色

本試驗(yàn)中第1～10代的牛ICM克隆呈現(xiàn)出了典型的干細(xì)胞形態(tài)，這表明2i/LIF培養(yǎng)液有助于維持牛ICM克隆的多能性。此外，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)表面標(biāo)記SSEA1、SSEA4 和 TRA-1-60以及多能性基因OCT4、SOX2和NANOG在牛ICM克隆中的表達(dá)情況，結(jié)果均為陽(yáng)性，這與已有的研究結(jié)果有相同之處[1，12，14-15，21，24]。SSEAs是小鼠和人多能性細(xì)胞表達(dá)的表面抗原，其中SSEA-1 在小鼠ES細(xì)胞中表達(dá)量較高[27]，SSEA-3和SSEA-4在人ES細(xì)胞中特異表達(dá)[28]。此外，OCT4、SOX2和NANOG是小鼠和人多能性細(xì)胞的重要標(biāo)記基因。但是這些多能性分子標(biāo)記在牛類(lèi)ES細(xì)胞中的表達(dá)情況還有待進(jìn)一步的研究[16]。L.Wang等[12]建立的牛類(lèi)ES細(xì)胞系，表達(dá)表面標(biāo)記 SSEA-4 和多能性基因OCT4；G.Gong等[24]研究結(jié)果為在5～7代的牛類(lèi)ES細(xì)胞系中表面標(biāo)記SSEA-1和多能性標(biāo)記 OCT4 和NANOG染色呈陽(yáng)性；而V.Verma等[21]所建立牛類(lèi)ES細(xì)胞系表達(dá)表面標(biāo)記SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60/-81和多能性基因OCT4、SOX2、NANOG、Klf4。T.Furusawa等[14]利用 2i/LIF 培養(yǎng)液建立的牛類(lèi)ES細(xì)胞系表達(dá)SSEA-1、SSEA-4和多能性基因OCT4、SOX2、NANOG。關(guān)于牛類(lèi)ES細(xì)胞多能性分子標(biāo)記的研究存在很大差異，這可能是由多方面的因素所致。比如培養(yǎng)條件、傳代方式、飼養(yǎng)層種類(lèi)以及鑒定方法等[18]。

A～C.胚胎接種第3、4、7 天；D～K.第1～8代ICM克隆；L.第10代ICM克隆A-C.The embryo on the third，fourth and seventh day respectively after seeded onto MEF；D-K.The ICM-derived colonies from passage 1 to passage 8；L.The ICM-derived colonies at passage 10圖1 牛ICM克隆各階段培養(yǎng)狀態(tài)圖Fig.1 Morphology of ICM colonies from bovine IVF blastocysts

A、B.第1代牛囊胚ICM克隆；C、D.第10代牛囊胚 ICM 克隆A，B.ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 1；C，D.ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 10圖2 堿性磷酸酶染色Fig.2 Alkaline phosphatase staining

利用免疫熒光染色法檢測(cè)的多能性標(biāo)記SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、OCT4、SOX2和 NANOG。A1～F1、A2～F2和A3～F3.光鏡照片、Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核以及特異抗體反應(yīng)。下同。A1～B3 200×；C1～F3 100×Immunofluorescence staining for SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，OCT4，SOX2 and NANOG in ICM colonies.A1-F1，A2-F2 and A3-F3.Light micrograph images，nuclear staining by Hoechst33342 and specific staining reactions，respectively.The same as below.A1-B3 200×；C1-F3 100×圖3 第1代牛ICM克隆多能性標(biāo)記的表達(dá)Fig.3 Expression of pluripotency markers in ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 1

圖4 第10代牛ICM克隆多能性標(biāo)記的表達(dá) 200×Fig.4 Expression of pluripotency markers in ICM colonies derived from bovine blastocysts at passage 10 200×

3.2SOX2、OCT4和NANOG在ICM和TE上的表達(dá)差異

a，b.P<0.05；A，B.P<0.01圖5 qRT-PCR檢測(cè)3個(gè)基因在ICM和TE上的表達(dá)差異Fig.5 Differences between inner cell mass (ICM) and trophectoderm (TE) in expression of 3 target genes as determined by qRT-PCR

由于目前在牛上關(guān)于SSEA1、SSEA4和TRA-1-60 mRNA信息較少，所以本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)其在ICM和TE上的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。本試驗(yàn)采用免疫磁珠法分離獲得高純度的ICM 和TE細(xì)胞，并通過(guò)qRT-PCR來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證OCT4、SOX2和NANOG在牛囊胚ICM和TE中的表達(dá)。結(jié)果顯示這3個(gè)基因在ICM和TE中的表達(dá)存在差異，其中SOX2的差異極顯著，這表明SOX2最有可能成為牛ICM克隆的候選多能性標(biāo)記。M.D.Goissi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在牛囊胚ICM中特異表達(dá)，并且SOX2表達(dá)量下降會(huì)導(dǎo)致附植前胚胎發(fā)育遲緩，這也表明SOX2有利于維持牛類(lèi)ES細(xì)胞的多能性。而 H.Nagatomo等[16]用 Microarray的方法來(lái)篩選牛囊胚ICM和TE中的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示SOX2在ICM中表達(dá)量顯著上調(diào)；同時(shí)qRT-PCR 驗(yàn)證OCT4和NANOG在ICM和TE中的表達(dá)情況，結(jié)果NANOG在ICM中的表達(dá)量顯著高于在TE中的表達(dá)量，而OCT4在二者中的表達(dá)量沒(méi)有區(qū)別；此研究表明，SOX2在牛囊胚ICM中的作用與其在小鼠囊胚中相似，它極有可能是牛囊胚ICM中的特異多能性標(biāo)記基因。

H.Sumer等[30]研究發(fā)現(xiàn)，僅用OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC不足以將牛成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能性細(xì)胞，而NANOG作為一個(gè)調(diào)節(jié)多能性的關(guān)鍵因子，在這個(gè)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。此外，G.Gong等[24]利用RT-PCR檢測(cè)其所建立的牛類(lèi)ES細(xì)胞系中多能性基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示NANOG和OCT4均有表達(dá)。V.Verma等[21]建立了牛類(lèi)ES細(xì)胞系，經(jīng)RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)顯示NANOG在此類(lèi)ES細(xì)胞中表達(dá)。這些研究結(jié)果表明，NANOG也可能與維持牛類(lèi)ES細(xì)胞多能性相關(guān)。OCT4在小鼠和人ES細(xì)胞中特異表達(dá)，但是由于物種間存在差異，目前很多研究中所建立的牛類(lèi) ES 細(xì)胞系都不表達(dá)OCT4[17，31-32]。D.Harris等[33]在牛附植前胚胎培養(yǎng)液中添加了 2i(CHIR99021 和 PD0325901)，然后利用免疫手術(shù)法分離獲得牛囊胚 ICM 并接種，并用 RT-PCR 檢測(cè)幾個(gè)與多能性相關(guān)的特異基因在其形成的克隆中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，添加 2i顯著提高了SOX2和NANOG在ICM克隆中的表達(dá)水平，而對(duì)OCT4表達(dá)水平的影響不大。H.Nagatomo等[16]通過(guò)Microarray和qRT-PCR 檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)OCT4在牛囊胚 ICM與TE中的表達(dá)量沒(méi)有明顯差異。而 D.K.Berg等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與小鼠不同，在牛囊胚早期發(fā)育階段，OCT4不只在ICM中特異表達(dá)，在TE中也有表達(dá)。由此可見(jiàn)，OCT4 對(duì)于牛類(lèi) ES 細(xì)胞的作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，免疫熒光染色試驗(yàn)表明，在第10代牛囊胚ICM克隆上，表面標(biāo)記蛋白(SSEA1、SSEA4和TRA-1-60)以及多能性基因(OCT4、SOX2 和NANOG)均表達(dá)，而qRT-PCR結(jié)果表明，SOX2在ICM與TE上的表達(dá)差異極顯著。本研究結(jié)果為早日確定牛類(lèi)ES細(xì)胞的多能性分子標(biāo)記及揭示其多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考，進(jìn)而有助于加速牛ES細(xì)胞系的成功建立。

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(編輯 程金華)

The Research of Pluripotency-related Marker Genes and Surface Markers in Bovine ICM Colonies

CUI Li-sha1，2，ZHAO Xue-ming2，HAO Hai-sheng2，DU Wei-hua2，MA You-ji1，ZHU Hua-bin2*，WANG Zong-li1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China；2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgricuturalSciences，Beijing100193，China)

This study was designed to investigate the pluripotency-related markers of bovine ES cells so as to provide a basis for optimizing culture conditions of bovine ES cells and promoting its research progress.The inner cell mass (ICM) were separated from bovine IVF blastocysts，seeded on mouse embryonic fibroblasts cultured in 2i/LIF medium and then passaged mechanically.The pluripotent markers of the ICM-derived colonies were detected at passage 1 and passage 10 by immunostaining.Additionally，the ICM and trophectoderm (TE) isolated from bovine blastocysts by magnetic activated cell sorting were used for qRT-PCR to validate the differences in gene expression between ICM and TE.We have derived ICM colonies from bovine IVF blastocysts and cultured them to passage 10，which displayed typical stem cell morphology and expressed specific markers such as OCT4，SOX2，NANOG，SSEA1，SSEA4 and TRA-1-60.Moreover，the results of qRT-PCR showed thatOCT4，SOX2 andNANOGwere differentially expressed between ICM and TE，SOX2 showed the most significant difference.In conclusion，2i/LIF culture medium is helpful for the culture of the ICM-derived colonies from bovine IVF blastocysts，andSOX2 is more likely to be a candidate pluripotency-related marker gene of bovine ICM-derived colonies.

bovine；ICM；pluripotency-related marker；qRT-PCR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.009

2015-01-05

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(ASTIP-IAS06-2014)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2014ywf-yb-2)

崔莉莎(1989-)，女，山東菏澤人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖方面的研究，E-mail：cuilishaxz@163.com

*通信作者：朱化彬，博士，研究員，E-mail：zhuhuabin@caas.cn；王宗禮，博士，研究員，E-mail：Wangzongli@sina.com

S823.2

A

0366-6964(2015)07-1141-09