檸檬酸和EDTA對(duì)cyclinD1和Td T抗原修復(fù)的應(yīng)用比較

陳晶晶，陳 炯

(安徽省立醫(yī)院病理科，安徽合肥 230001)

免疫組織化學(xué)技術(shù)是用已知抗體或抗原檢測(cè)組織細(xì)胞中的未知抗原或抗體的技術(shù)，能將形態(tài)、代謝和功能密切結(jié)合起來，具有操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于病理診斷［1]。但常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋組織過程中會(huì)引起蛋白內(nèi)和蛋白間亞甲基橋的橋連，導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，使表達(dá)反應(yīng)微弱，染色效果不佳，從而影響診斷的準(zhǔn)確性，因此抗原修復(fù)技術(shù)是免疫組化實(shí)驗(yàn)中的重要操作步驟［2]。結(jié)合實(shí)踐工作發(fā)現(xiàn)在陳舊惡性淋巴瘤標(biāo)本中，一些核表達(dá)的標(biāo)記物對(duì)抗原修復(fù)方式和修復(fù)溶液的選要求很嚴(yán)格，常規(guī)的熱修復(fù)結(jié)合低pH溶液很難達(dá)到預(yù)想的染色效果［3]，尤其是套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)核標(biāo)記cyclinD1和淋巴母細(xì)胞淋巴瘤(lymphoblastic lymphomas，LBL)核標(biāo)記TdT。這兩種核型標(biāo)記物是診斷該類腫瘤的特異性標(biāo)記物，所以合理的搭配抗原修復(fù)條件，盡量做到標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)淋巴瘤的病理分型變的尤為重要。本次實(shí)驗(yàn)采用高壓修復(fù)法，比較 pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA三種修復(fù)液對(duì)cyclinD1和TdT免疫組化結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1．1 組織來源 收集本院病理科2005—2010年常規(guī)活檢切除的淋巴結(jié)陳舊標(biāo)本104例(MCL 56例和LBL 48例)，標(biāo)本固定均用10%中性緩沖福爾馬林，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，連續(xù)切片6～8張(不同檢測(cè)條件所需)，并且每張片子上放置陽性和陰性對(duì)照各一張，切片厚1～2μm，60℃烤箱，烤片過夜。

1．2 試劑及顯色試劑盒 抗體均采用北京中杉金橋生物公司，即用型 cyclinD1(EP12)和 TdT(SEN28);抗原修復(fù)溶液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA和 pH 9．0 Tris/EDTA);二抗及 DAB為北京中杉PV-6000 EnVision TM檢測(cè)試劑盒。

1．3 儀器設(shè)備 抗原修復(fù)高壓鍋(北京中杉金橋)，塑料染色架。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法和過程 按緩沖液pH值高低，將高壓鍋中各裝入不同pH值的緩沖液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和 pH 9．0 Tris/EDTA)加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片裝在耐熱高壓塑料染色架中，再放入高壓鍋中，蓋嚴(yán)鍋蓋，再加熱至噴汽繼續(xù)加熱，即達(dá)到工作壓力及溫度。計(jì)時(shí)2．5 min，停止加熱，室溫自然降溫，打開鍋蓋取出切片，蒸餾水洗凈切片后，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性8 min，PBS洗，每張切片上滴加相應(yīng)的一抗。室溫下孵育2～3 h，PBS洗，二抗室溫下孵育30 min，PBS洗，DAB顯色，光鏡下控制。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、分化、藍(lán)化、脫水、透明，中性樹膠封片。每張切片都設(shè)有陽性和陰性對(duì)照。

1．5 結(jié)果判定 cyclinD1和TdT定位于細(xì)胞核，每張切片選10個(gè)高倍視野，每高倍視野記數(shù)100個(gè)正常細(xì)胞或癌細(xì)胞，用半定量積分法判斷結(jié)果先按染色強(qiáng)度打分:0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強(qiáng)度依背景著色進(jìn)行對(duì)比;再按陽性細(xì)胞所占百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。兩者計(jì)分之和所得總分進(jìn)行結(jié)果判定。0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)［4]。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，等級(jí)資料運(yùn)用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果，EDTA較檸檬酸鹽緩沖液，56例MCL中40例cyclinD1表達(dá)強(qiáng)度隨著pH值的升高而增強(qiáng)(見圖1～3)，陽性率從71%提高到82%，其中6例用pH 6．0 Citrate修復(fù)后不表達(dá)，而用pH 9．0 Tris/EDTA修復(fù)后強(qiáng)弱不等的表達(dá)(見表1)，按實(shí)際結(jié)果采用等級(jí)資料兩樣本配對(duì)秩和檢驗(yàn)比較檸檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA緩沖液對(duì)cyclinD1抗原修復(fù)結(jié)果，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)(見表2);另外48例LBL中42例TdT表達(dá)強(qiáng)度隨著pH值的升高而增強(qiáng)(見圖4～6)，陽性率從88%提高到95%，其中4例用pH 6．0 Citrate修復(fù)后不表達(dá)，而用高pH值EDTA修復(fù)后強(qiáng)弱不等的表達(dá)(見表1)，按實(shí)際結(jié)果采用等級(jí)資料兩樣本配對(duì)秩和比較檸檬酸和pH 9．0 Tris/EDTA緩沖液對(duì)TdT抗原修復(fù)結(jié)果，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)(見表3)。

表1 兩種抗體在三種不同抗原修復(fù)液中的免疫組化染色結(jié)果比較/%

表2 檸檬酸鹽和EDTA(pH9．0)緩沖液對(duì)cyclin D1抗原修復(fù)的比較

表3 檸檬酸鹽和EDTA(pH9．0)緩沖液對(duì)Td T抗原修復(fù)的比較

3 討論

免疫組化技術(shù)中保證實(shí)驗(yàn)操作流程的標(biāo)準(zhǔn)化是個(gè)非常重要的問題。很多因素都會(huì)影響免疫組化染色結(jié)果的好壞，其中抗原修復(fù)是非常關(guān)鍵的步驟，修復(fù)方法是否得當(dāng)，直接影響抗體的表達(dá)，影響病理診斷的準(zhǔn)確性和患者治療方案的選擇的［5]。當(dāng)活檢組織經(jīng)過福爾馬林和石蠟包埋后，許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成了醛鍵，使得抗原決定簇被封閉。同時(shí)，甲醛的聚合作用使蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成了大分子網(wǎng)絡(luò)，也使抗原決定簇被掩蓋，使抗原與抗體的結(jié)合點(diǎn)減少，從而令抗原的陽性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱的［6]，必須進(jìn)行抗原修復(fù)，以最大限度地暴露其被遮蓋的抗原，所以高壓修復(fù)配上合理的修復(fù)液可以改善難以檢測(cè)的細(xì)胞核陽性抗原的染色結(jié)果。cyclinD1是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在控制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期起重要作用，它可以和CD4構(gòu)成復(fù)合物，并與 Rb基因(retinoblastoma gene)產(chǎn)物結(jié)合，同時(shí)將后者磷酸化，繼而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，最終刺激細(xì)胞的生長并導(dǎo)致細(xì)胞周期異常［7]。68% ～82%的 MCL患者染色體(11;14)(q13;q32)易位，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1的PARAD(parathyroid adenomatosis)基因過度表達(dá)，促進(jìn)cyclinD1蛋白的合成和過度表達(dá)，在其他形態(tài)相近的淋巴瘤均不具有此特點(diǎn)的［8]，是MCL最特異的免疫標(biāo)記，因此cyclinD1主要用于MCL的診斷及鑒別診斷［9]。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一種 DNA聚合酶．它可以不需要模板的存在而催化游離脫氧核苷酸隨機(jī)地插入到 DNA鏈3＇羥基末端［10]。該酶參與淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中的免疫球蛋白和T細(xì)胞受體基因重排，在淋巴前體細(xì)胞中高表達(dá)，包括T和B(前期)淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞，其表達(dá)有助于LBL的明確診斷，但也存在少數(shù)陰性的［11]。我們?cè)谠\斷惡性淋巴瘤的過程中，這兩種特異性免疫指標(biāo)非常的重要，但我們發(fā)現(xiàn)在蠟塊組織中染色陽性率達(dá)不到文獻(xiàn)報(bào)道的陽性率(MCL中cyclinD1陽性率68% ～82%;LBL中TdT陽性率96%)［12－13]。按我們實(shí)驗(yàn)室常規(guī)標(biāo)記的抗原修復(fù)方法和修復(fù)溶液，結(jié)果有時(shí)會(huì)有爭議，出現(xiàn)弱表達(dá)或不表達(dá)。分析原因可能是免疫組化組織前期處理和操作過程不當(dāng)所致，包括標(biāo)本活檢后沒有及時(shí)固定，固定的時(shí)間和量未達(dá)到要求;脫水不徹底;免疫組化操作中出差錯(cuò)等，很多原因都會(huì)導(dǎo)致假陰性。我們通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)排除以上諸多因素，調(diào)節(jié)免疫組化操作中的可變因素發(fā)現(xiàn)惡性淋巴瘤的cyclinD1和TdT抗原在高壓修復(fù)方法、不同的修復(fù)液(pH 6．0 Citrate、pH 8．0 Tris/EDTA 和pH 9．0 Tris/EDTA)的條件下，核表達(dá)的強(qiáng)度隨著修復(fù)液pH值的升高而升高，甚至用酸性修復(fù)液抗原表達(dá)是陰性，再用EDTA修復(fù)抗原表達(dá)陽性。這說明高pH值的抗原修復(fù)液更容易暴露核的抗原決定簇，可能蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，不同pH值的抗原修復(fù)液對(duì)裂解醛—氨基之間的交聯(lián)或蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)的作用不同，抗原決定簇暴露的程度也不同，使標(biāo)記效果不同;其次用EDTA作抗原修復(fù)液，EDTA可與Ca2+形成螯合雙價(jià)金屬離子鹽(螯合劑)，螯合劑具有穩(wěn)定性，可消除Ca2+與蛋白質(zhì)形成牢固的復(fù)合物，消除許多羥基(－OH)、羧酸根(－COOH)、磷酸根 PO43－的影響，即消除福爾馬林固定產(chǎn)生的不利因素;但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。因此，對(duì)于惡性淋巴瘤核表達(dá)標(biāo)記物cyclinD1和TdT染色最好選用以EDTA為抗體修復(fù)液，進(jìn)行高壓修復(fù)，以獲得最佳的效果，提高cyclinD1和TdT陽性檢出率，為臨床病理診斷良、惡性淋巴瘤提供確切的證據(jù)。

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