大鯢皮膚黏液的抗氧化性及安全性評價研究

徐偉良， 陳德經(jīng),2， 魏 泓， 劉 宇

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000；3.第三軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室， 重慶 400038)

大鯢皮膚黏液的抗氧化性及安全性評價研究

徐偉良1， 陳德經(jīng)1,2， 魏 泓3， 劉 宇3

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點實驗室， 陜西 漢中 723000；3.第三軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室， 重慶 400038)

大鯢； 皮膚黏液； 毒性； 抗氧化

大鯢(AndriasdavidianusBlanchard)屬于大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，國家二級保護動物，有活化石之稱[1]。大鯢皮膚腺體主要有兩種：粘液腺(mucus gland)和顆粒腺(granular gland)。粘液腺分泌出清澈粘液，覆蓋在身體表面形成一層濕潤的薄膜，具有防御、繁殖、保濕、皮膚呼吸、溫度調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)等作用[2-3]；顆粒腺又叫毒腺，在皮膚局部聚集形成特殊的腺體結(jié)構(gòu)，能夠分泌抗菌肽和藥理活性肽等生物活性物質(zhì)[4-5]。當大鯢機體受到外界不良刺激時，能分泌白色黏液，并帶有一定特殊性臭味。自然界中，生物體經(jīng)常通過自身分泌的氣味來進行生物信息傳遞和交換，特別是在避敵、引誘、覓食、導(dǎo)航以及維持群居的動物社會等方面，氣味的作用尤為突出[6-7]。大鯢皮膚黏液對抗菌、抗氧化等方面起著非常明顯的作用[8-9]，曲敏等[10-11]從大鯢體表黏液中分離獲得了黏液低聚糖肽，并證明了該糖肽具有抗氧化性，對羥自由基有明顯的清除作用。此外，Guo等[12]發(fā)現(xiàn)大鯢皮膚黏液具有復(fù)雜毒性作用，經(jīng)腹腔給藥可使小鼠致死，低劑量可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)水腫或痛覺效果。

大鯢皮膚黏液中含有多種活性成分，可作為天然藥用資源進行開發(fā)利用。但大鯢黏液具有很強的黏附性和特殊的臭味，且特殊性臭味是什么成分，是否具有毒性，目前尚未見文獻明確報道，限制了大鯢黏液的開發(fā)與利用。通過干燥處理形成的粉劑能夠減輕臭味，具有性狀穩(wěn)定，劑量準確，便于運輸和貯存等特點[13]，是合理利用大鯢黏液的有效途徑。因此，本研究通過對大鯢皮膚黏液抗氧化性和急毒性安全性評價，為大鯢皮膚黏液的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

成熟大鯢(陜西漢源生物科技有限公司提供)；FVB/N品系小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物中心提供)；體積分數(shù)1%羧甲基纖維素鈉；0.1 mol/L Tri-HCL緩沖液(Ph 8.20，內(nèi)含1 mmol/L EDTA·2Na)；4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(用10 mmol/L鹽酸配置)；50 g/L三氯乙酸(TCA)溶液(含5 mmol/L EDTA·2Na)；0.02 mg/mL DPPH溶液(避光保存)，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀 器

GC6890N/MSD5973N聯(lián)用儀(Agilent公司)，722G可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，LC-800低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)，KQ-100DA型數(shù)控超聲清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司)，PHS-2C型精密酸度計(上海大普儀器有限公司)DZF-6050型真空干燥箱(上海恒科技有限公司)，F(xiàn)A2004N電子天平(上?？茖W(xué)精密儀器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大鯢黏液全粉抗氧化性測定

1.2.1.1 大鯢皮膚黏液的采集

采用機械刺激法：用軟毛刷輕輕拍打或按摩大鯢背部、尾部等皮膚分泌腺較多部位，對其進行溫和刺激，使大鯢分泌產(chǎn)生白色黏液，并刮取黏液，-20 ℃下保存待用。

(1)鄰苯三酚自氧化速率測定

參照改進的鄰苯三酚自氧化法[14-15]。在試管中按表1加入0.1 mol/L Tris-HCl(內(nèi)含1 mmol/L EDTA)緩沖液和去離子水，于25 ℃保溫20 min，然后加入25 ℃預(yù)熱過的4.5 mmol/L鄰苯三酚，迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長325 nm處每30 s測定一次吸光度值，共記錄4 min內(nèi)的吸光度值，并計算對照組的鄰苯三酚自氧化速率△A0(min-1)，使其自氧化速率控制在0.06△A0(min-1)左右。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測定加樣表

(2)大鯢黏液超氧陰離子自由基清除率測定

稱取1.00 g大鯢黏液，用10 mL雙蒸水定容，超聲震蕩溶解，經(jīng)4 000 rpm/min低速離心10 min，得上清液即為大鯢黏液制備液。按表1數(shù)據(jù)進行操作，將制備液按10 μL的梯度差從10～100 μL依次加入各試管中，同時減少同體積的雙蒸水，其它操作的數(shù)據(jù)均與表1相同，并計算加樣后抑制鄰苯三酚自氧化速率△A1(min-1)：

(1)

1.2.1.3DPPH自由基清除率測定

參照Nedadis的方法考察大鯢黏液對DPPH的清除能力[16-17]。稱取大鯢黏液1.0g，加入雙蒸水定容至10mL容量瓶中，充分溶解后于4 ℃、12 000r/min離心10min，取上清液即為樣品液。分別取100、200、300、400、500μL樣品液與2mLDPPH溶液混合，加雙蒸水補足至總體積為3mL，25 ℃下保溫30min，雙蒸水調(diào)零，在515nm下測定樣品的吸光度值并記為A。與樣品液體積相同的雙蒸水與DPPH溶液混合作為試劑對照組，同樣條件下，測其在515 nm下的吸光度值并記為A0。

DPPH自由基清除率計算：

(2)

1.2.2 大鯢黏液的急毒性安全性評價

1.2.2.1 受試物的處理

稱取20g大鯢皮膚黏液，在40 ℃條件下真空干燥成大鯢黏液全粉；另取20g大鯢黏液于三角瓶中，加入20mL無水乙醇震蕩洗滌30min，4 000r/min離心10min，真空干燥上清液和黏液沉淀，合并制備成大鯢黏液乙醇脫毒全粉作為實驗對照品。分別稱取一定量的大鯢黏液全粉及乙醇脫毒全粉，溶解在1%羧甲基纖維素溶液中，配制成不同劑量的混懸液。

1.2.2.2 急毒性實驗

參考Horn氏法[18-19]，計算大鯢黏液全粉半數(shù)致死量(LD50)。分別配制1.0、2.15、4.64、10g/kg四個樣品劑量，每個劑量組以四只體重相近的小鼠進行試驗，試驗前動物隔夜空腹(禁食16h左右，不限制飲水)。采用經(jīng)口灌胃法，一次性給予不同劑量大鯢黏液全粉溶液，各劑量組的灌胃體積相同(0.4mL/只)；以體積分數(shù)1%羧甲基纖維素作為溶劑對照組，以乙醇脫毒全粉溶液為對比實驗組，按上述操作，進行同樣處理。觀察指標包括小鼠外觀、行為、死亡情況(死亡時間、瀕臨死亡前的反應(yīng))等，觀察時間為14d，對死亡小鼠和觀察期滿(14d)存活小鼠處死進行大體解剖，進行病變組織器官檢查。

1.2.3 大鯢皮膚黏液毒性成分檢測

1.2.3.1 大鯢黏液預(yù)處理

取5g大鯢皮膚黏液于三角瓶中，加入5mL無水乙醇震蕩洗滌30min，4 000r/min離心10min，吸取定量上清液至樣品瓶中。另取5g大鯢黏液乙醇脫毒全粉溶于乙醇中，作為對照組。

1.2.3.2 固相微萃取條件[20]

將裝有定量上清液的樣品瓶置于60 ℃恒溫水浴30min，將SPME萃取頭插入樣品瓶中固定刻度, 直接接觸萃取30min后取出，迅速插入氣相色譜進樣口內(nèi)，解析7min后取出SPME開始測定，然后同美國NIST05譜庫比對，確定氣質(zhì)聯(lián)用儀分析的氣體成分。

1.2.3.3 氣體檢測方法[21]

(1)色譜條件：色譜柱為HP-5(30m×0.32mm，0.25μm)彈性石英毛細管柱，程序升溫為以4 ℃/min的升溫速率由80 ℃程序升溫至290 ℃，恒溫保持30min，進樣口溫度為250 ℃，載氣(He)流量為1.0mL/min，傳輸線溫度為280 ℃。

(2)質(zhì)譜條件：MSD離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍(m/z)35～350。

2 結(jié)果與分析

2.1 超氧陰離子自由基清除率測定結(jié)果

通過對鄰苯三酚自氧化速率與大鯢黏液抑制鄰苯三酚自氧化速率的測定，計算所得的超氧陰離子自由基清除率結(jié)果如表2。

表2 超氧陰離子自由基清除率測定結(jié)果表 (1.00 mg/mL)

2.2 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

通過對照管吸光度值A(chǔ)0和樣品管吸光度值A(chǔ)的測量，計算所得大鯢黏液對DPPH清除率結(jié)果如表3。

表3 黏液對DPPH自由基的清除率 (26.75 mg/mL)

由表3可知，大鯢黏液對DPPH自由基有明顯的清除作用，最高可達90.25%；在濃度為26.75～133.75 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨樣品濃度增大，清除率逐漸增強。

2.3 小鼠急毒性實驗結(jié)果

小鼠灌胃飼養(yǎng)實驗中樣品劑量和小鼠急毒性死亡情況如表4所示。

表4 急毒性實驗記錄表

由表4小鼠灌胃給藥處理顯示，經(jīng)10 g/kg和4.64 g/kg大鯢黏液全粉處理后，小鼠均有3只死亡。死亡小鼠約0.5～2 h內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、流涎，呆滯等表現(xiàn)。對死亡小鼠解剖顯示出現(xiàn)肺部充血，胃部水腫的現(xiàn)象，其它內(nèi)臟重要器官(心、肝、脾、腎及腸道等)未見充血、水腫及明顯器質(zhì)性變化。而經(jīng)過乙醇脫毒處理的大鯢黏液全粉樣品組與溶劑對照組小鼠表現(xiàn)正常，小鼠解剖未出現(xiàn)肉眼可見病理變化，也無明顯毒性反應(yīng)出現(xiàn)。因此，查Horn氏表有符合LD50值為4.64 g/kg，可信限范圍為2.25～9.57。

2.4 黏液毒性成分檢測結(jié)果

大鯢皮膚黏液乙醇脫毒上清液揮發(fā)性成分的GC-MS色譜圖如圖1所示。

圖1 大鯢皮膚黏液氣體GC/MS總離子流圖

與美國NIST05譜庫比對結(jié)果顯示，黏液揮發(fā)性成分為二甲基二硫醚(C2H6S2)和正十四烷酸甲酯、正十五烷酸甲酯、正十六烷酸甲酯、正十六烷酸異丙酯、亞油酸甲酯、反-油酸甲酯、順-油酸甲酯及正十八烷酸甲酯8種脂類化合物。二甲基二硫醚是一種有機硫化合物，有惡臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚和烴類，易分解，毒性較低[22]。而對照組大鯢黏液乙醇脫毒全粉溶液中的揮發(fā)性成分除8種脂類化合物，未檢測出二甲基二硫醚。

3 結(jié)論與討論

安全性評價是食品開發(fā)利用的前提條件，而急毒性實驗是安全性評價的重要指標。本文利用大鯢黏液對小鼠經(jīng)口灌胃，對黏液的急毒性進行安全性評價。實驗測得大鯢黏液全粉LD50值約為4.64 g/kg，為毒性3級[24]，具有低毒性，經(jīng)乙醇脫毒處理后，黏液無毒性，因此，推斷大鯢黏液中毒性成分經(jīng)乙醇脫毒后而去除。將乙醇脫毒上清液經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析表明，臭味氣體成分為二甲基二硫醚，具有低毒性、易溶于乙醇、易分解的性質(zhì)，符合大鯢黏液低毒性的測定，從而證明大鯢皮膚黏液中的毒性成分為二甲基二硫醚。

通過對大鯢皮膚黏液的抗氧化性和急毒性的安全性評價結(jié)果表明，大鯢皮膚黏液具有抗氧化性和低毒性，經(jīng)乙醇脫毒后可作為抗衰老的保健產(chǎn)品進行開發(fā)。

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[責(zé)任編輯：魏 強]

Study on the toxicity and antioxidant activity of mucus powder from salamander skin

XU Wei-liang1，CHEN De-jing1,2， WEI Hong3， LIU Yu3

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;2.Shaanxi Province Key Laboratory of Biological Resources, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;3.Department of Laboratory Animals, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

The study focuses on antioxidant performance and safety evaluation of acute toxicity of salamander skin mucus. The study first uses pyrogallol autoxidation and DPPH method to determine salamander mucus to superoxide anion radical(O-·2) scavenging and DPPH radical scavenging. Then it experiments with giant salamander breeding mice fed to test acute toxicity of Andrias davidianus skin mucus and analyses toxic constituents of mucus temperament by using GC-MS chromatography. The results show that the clearance rate of Salamander mucus flour to superoxide anion radical and to DPPH radical scavenging is 6.77% and 90.25% respectively, and that LD50value ofAndriasmucus powder is 4.64 g/kg and toxic ingredient is imethyl disulfide (C2H6S2). It concludes thatAndriasmucus is antioxidant and low in toxicity, and that it can be developed for health care products after detoxification.

giant salamander; skin mucus; toxicity; antioxidant

1673-2944(2015)02-0056-06

2014-12-10

陜西省中小企業(yè)科技創(chuàng)新項目(2014CXZJ36)；陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金資助項目(SLGYCX1311)

徐偉良(1988—)，男，內(nèi)蒙古錫盟正藍旗人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向為應(yīng)用生物化學(xué)；[通信作者]陳德經(jīng)(1961—)，男，陜西省西鄉(xiāng)縣人，陜西理工學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為食品生物技術(shù)；魏泓(1963—)，男，四川省瀘州市人，第三軍醫(yī)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為動物分子遺傳學(xué)。

Q592; S917.4

A