常用分子生物學(xué)技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應(yīng)用

劉曉鵬尚丹

作者單位: 050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站

常用分子生物學(xué)技術(shù)在食品病原微生物檢測中的應(yīng)用

劉曉鵬尚丹

作者單位: 050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站

【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);實(shí)時(shí)定量PCR;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法;基因芯片;酶聯(lián)免疫吸附

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食品微生物檢測對(duì)于保障食品安全起著及其重要的作用。傳統(tǒng)的微生物檢測方法雖然有效，但存在檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)快速檢測的要求。隨著細(xì)菌基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，誕生了許多分子生物學(xué)技術(shù)，它們因準(zhǔn)確度和靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便、檢測周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，越來越被廣泛應(yīng)用。本文對(duì)在食品病原微生物檢測中常用的幾種分子生物學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用作一綜述。

1　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

1.1PCR原理美國人Mullis于1985年發(fā)明了PC技術(shù)，并榮獲了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR現(xiàn)在已成為生命科學(xué)領(lǐng)域最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一，它是一種體外酶促合成DNA片段方法，由變性、退火和延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行，最終使目的DNA以指數(shù)級(jí)迅速擴(kuò)增。

常規(guī)PCR反應(yīng)體系中包括模板、引物、Taq DN聚合酶、dNTP、Mg2+及緩沖液等成分。PCR反應(yīng)的原理類似于DNA的天然復(fù)制，其一輪循環(huán)過程如下(1)變性，即在93～95℃高溫下，是雙鏈DNA解離形成單鏈; (2)退火，即在合適的溫度下，引物與單鏈DNA模板的特異區(qū)域配對(duì)結(jié)合; (3)延伸，即在72℃下，Taq DNA聚合酶以引物的3’末端作為起始，以dNTP作為底物，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成一條模板DNA鏈互補(bǔ)的新鏈。如此重復(fù)30個(gè)循環(huán)左右，目的基因就會(huì)被擴(kuò)增一百萬倍以上。

PCR技術(shù)中，引物的設(shè)計(jì)質(zhì)量起到至關(guān)重要作用。在使用軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，一般要遵循以下基本原則: (1)引物長度一般為18～30 nt; (2) GC含量為40%～60%，堿基盡可能隨機(jī)分布; (3)避免引物本身或引物之間形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物二聚體; (4)引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)，3’末端盡量不要以A結(jié)尾。

與傳統(tǒng)的微生物檢測方法相比，PCR具有特點(diǎn): (1)靈敏度高:病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU，細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌; (2)特異性強(qiáng):對(duì)不同微生物型進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定; (3)操作簡便省時(shí):一般1～2 h就可完成檢測。

1.2常用PCR類型

1.2.1反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) :核糖體廣泛分布于現(xiàn)存的所有生物，同種生物細(xì)胞中的rRNA序列保守性很強(qiáng)，可以利用rRNA堿基羞異進(jìn)行菌株的分類鑒定。當(dāng)需要對(duì)樣本中微生物的rRNA作為模板進(jìn)行PCR檢測時(shí)，就需要用到RT-PCR。RT-PCR的基本過程:首先，提取檢測樣本中的總RNA;然后，采用隨機(jī)引物、Oligo (dT)或特異性引物，以RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA;最后，進(jìn)行常規(guī)PCR。

1.2.2多重PCR(multiplex PCR) :多重PCR是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多對(duì)病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其主要優(yōu)勢:①經(jīng)濟(jì)高效，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)約經(jīng)費(fèi);②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒、腸道致病性細(xì)菌、無芽胞厭氧菌等同時(shí)進(jìn)行檢測。目前已在多種病原微生物的檢測中進(jìn)行了應(yīng)用: Kim等［1］采用多重PCR技術(shù)成功對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌等進(jìn)行了檢測;蔡亦紅等［2］建立的多重PCR體系，成功對(duì)大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、福氏志賀菌等3種食源性致病菌實(shí)現(xiàn)了檢測。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qRT-PCR) : qRT-PCR是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，準(zhǔn)確計(jì)算目的基因的初始豐度。qRT-PCR除了常規(guī)PCR技術(shù)的特點(diǎn)外，還具有以下主要優(yōu)點(diǎn):可以實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀;采用對(duì)數(shù)期分析，定量準(zhǔn)確;無需凝膠電泳等后處理，減少對(duì)環(huán)境的污染。

最常用的qRT-PCR包括以下兩種類型:①SYB Green熒光染料法，此方法除了加入常規(guī)PCR反應(yīng)成分外，另外加入SYBR Green熒光染料。SYBR Gree熒光染料摻入DNA雙鏈后，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR Green染料分子不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步②TaqMan探針法，此方法除了加入常規(guī)PCR反應(yīng)成分外，需要加入一條兩端分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收; PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

陳蘇紅等［3］建立了檢測SARS病毒的qRT-PC方法，最低可檢測到5個(gè)拷貝的體外轉(zhuǎn)錄RNA分子特異性達(dá)100%。代娟等［4］針對(duì)編碼大腸埃希菌耐熱腸毒素I基因片段，采用MGB-TaqMan探針建立產(chǎn)耐熱腸毒素大腸埃希菌qRT-PCR檢測方法。徐德順等［5］以金黃色葡萄球菌FemB基因作為靶基因，建立食品中金黃色葡萄球菌污染的快速敏感特異的qRT PCR檢測方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，這些qRT-PCR檢測方法不僅靈敏性高、特異性好、檢測周期短、檢測結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，而且操作簡便，適應(yīng)食品微生物檢驗(yàn)發(fā)展的需要，具有較大的推廣及應(yīng)用價(jià)值。

2　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal ampli fication，LAMP)

LAMP是由Notomi等［6］開發(fā)出來的不同于PC的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是基于靶基因的個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bs DNA polymerase)的催化下，等溫條件(65℃左右)保持幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增，效率可達(dá)109～1010個(gè)數(shù)量級(jí)。在DNA合成時(shí)，從dNTP中釋放的焦磷酸根與Mg2+發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生白色的焦磷酸鎂沉淀。因此不需要繁瑣的電泳和紫外檢測，僅通過肉眼觀察白色渾濁度，就能判斷是否擴(kuò)增。

Xu等［7］建立了快速檢測葡萄球菌的LAMP方法Song等［8］建立了檢測志賀菌屬和侵襲性大腸埃希菌的LAMP方法。Seki等［9］針對(duì)肺炎鏈球菌的lyt A基因序列，建立了LAMP檢測方法。通過對(duì)10株肺炎鏈球菌和6株非肺炎鏈球菌的檢測證明: LAMP法的特異性高，最低可檢測到10個(gè)拷貝的DNA，靈敏度達(dá)到PCR法的1 000倍，用時(shí)僅為1 h。LAMP操作簡單、快速、特異性強(qiáng)，不需要昂貴的儀器，不需要電泳及紫外觀察等，在食品微生物檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景。

3　基因芯片

基因芯片，又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)技術(shù)，是采用微加工技術(shù)將大量人工設(shè)計(jì)的基因片段有序的、緊密的排列固定于硅片等載體上構(gòu)建而成的。通過與待測熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，用熒光檢測系統(tǒng)對(duì)雜交后的芯片進(jìn)行掃描，再通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一位點(diǎn)的熒光信號(hào)做出檢測、比較和分析，從而得出定性和定量的結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高自動(dòng)化程度等特點(diǎn)，為全面、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行食品安全檢測提供了一個(gè)嶄新的平臺(tái)。

基因芯片已被成功用于多種病原體的檢測: Berger等［10］應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)12株嗜酸乳桿菌進(jìn)行了分析研究; Wang等［11］利用基因芯片技術(shù)為肺炎鏈球菌的監(jiān)測提供了一個(gè)新的具有更高特異性和靈敏度快速分析方法;高興等［12］探討隨機(jī)PCR結(jié)合基因芯片技術(shù)用于多種食源性致病菌篩查檢測的可行性，成功對(duì)痢疾志賀菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、肉毒梭菌、肺炎鏈球菌、布氏桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌等16種病原細(xì)菌進(jìn)行檢測篩查。但目前將基因芯片推廣應(yīng)用還面臨諸多問題: (1)需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備，芯片制備成本高，一般實(shí)驗(yàn)室難以承擔(dān)其高昂的費(fèi)用; (2)特異性有待提高，假陽性和假陰性仍影響結(jié)果的準(zhǔn)確性; (3)尚未形成有效統(tǒng)一的制備、檢測和數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)，在很大程度上影響芯片結(jié)果的可重復(fù)性。相信隨著芯片技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，檢測操作方法的簡便化，儀器的小型化和低廉化，有望在未來廣泛應(yīng)用于病原體檢測。

4　酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)

Engvall和Perlmannn于1971年首次報(bào)道了有關(guān)酶聯(lián)免疫吸附分析法用于IgG定量測定的技術(shù)。ELISA是以抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種高靈敏度試驗(yàn)技術(shù)，根據(jù)酶作用于底物后的顯色反應(yīng)，借助比色或熒光反應(yīng)來分析。比較常用的ELISA方法包括雙抗體夾心法和間接法。ELISA檢測的操作步驟包括:先將抗原或抗體包被到載體表面，加入待檢標(biāo)本與前者進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，最后加入酶反應(yīng)的底物，生成有色產(chǎn)物，而產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA建立在抗原抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，因此該方法特異性強(qiáng)，同時(shí)酶促反應(yīng)具有將抗原抗體反應(yīng)信號(hào)放大的作用，因此靈敏度較高。

ELISA已被廣泛用于多種病原微生物的檢測Holzhauser等［13］用間接競爭EL ISA法成功地檢測出食品中含量低于2 mg/L的蛋白質(zhì)。常婭莉等［14］針對(duì)于鼠疫菌rV抗原建立雙抗體夾心ELISA檢測方法對(duì)鼠疫菌檢測以及流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

食品安全是一個(gè)全球性重大公共衛(wèi)生問題，建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便的微生物檢測技術(shù)是保證食品安全的迫切需求和食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)逐漸成為微生物分類鑒定的主要手段，國外分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究已比較成熟國內(nèi)由于各種條件的限制，目前實(shí)際應(yīng)用并不多。

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13Holzhauser T，Vieths S.Indirect competitive ELISA for determination traces of peanut (Arachis hypogaea L.) protein in complex food matri ces.J Agric Food Chem，1999，47: 603-611.

14常婭莉，焦磊，魏東，等.鼠疫耶爾森菌rV抗原單抗系統(tǒng)及其ELIS檢測方法的建立.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012，22: 13-18.

(收稿日期:2014－11－25

通訊作者:尚丹，050000石家莊市，北京鐵路局石家莊衛(wèi)生防疫站;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.09.041

【文章編號(hào)】1002－7386(2015) 09－1391－03

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】R 117