血小板型去白細(xì)胞濾器在濃縮血小板去白細(xì)胞中的應(yīng)用*

胡文輝，阮麗仙，程海濤，危艷順

（1.鄂州市中心血站，湖北鄂州 436000；2.鄂州市婦幼保健院，湖北鄂州 436000；3.鄂州二醫(yī)院，湖北鄂州 436000；4.鄂州市鄂鋼醫(yī)院，湖北鄂州 436000）

血小板型去白細(xì)胞濾器在濃縮血小板去白細(xì)胞中的應(yīng)用*

胡文輝1，阮麗仙2△，程海濤3，危艷順4

（1.鄂州市中心血站，湖北鄂州 436000；2.鄂州市婦幼保健院，湖北鄂州 436000；3.鄂州二醫(yī)院，湖北鄂州 436000；4.鄂州市鄂鋼醫(yī)院，湖北鄂州 436000）

目的評價血小板型去白細(xì)胞濾器在濃縮血小板中的應(yīng)用效果。方法采用富血小板血漿法制備濃縮血小板，將35袋制備好的同型濃縮血小板利用血小板型去白細(xì)胞濾器過濾。記錄過濾前后血小板常規(guī)指標(biāo)變化情況，用流式細(xì)胞儀對血小板活化指標(biāo)PAC-1及CD62p進(jìn)行檢測，利用生化分析儀對血小板低滲休克進(jìn)行測定，利用血小板聚集儀測定血小板聚集功能。結(jié)果利用血小板型去白細(xì)胞濾器進(jìn)行過濾后，白細(xì)胞去除率為（98.28±0.97）%，血小板回收率為（86.37±2.84）%；過濾后白細(xì)胞計數(shù)、血小板、紅細(xì)胞均較過濾器減少（P＜0.05），過濾前后血小板容量、平均血小板體積和p H差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；過濾前后血小板活化標(biāo)志物PAC-1和CD62p表達(dá)、血小板低滲休克和血小板聚集功能差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論血小板型去白細(xì)胞濾器能夠有效濾除濃縮血小板中的白細(xì)胞，不會改變血小板常規(guī)指標(biāo)，且對血小板活化、聚集功能和抗低滲休克能力均無明顯影響。

血小板； 去白細(xì)胞濾器； 白細(xì)胞； 血小板低滲休克； 血小板聚集

輸注濃縮血小板已成為臨床上預(yù)防出血和血小板功能障礙患者治療的重要手段。然而，在使用過程中易發(fā)生非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)、免疫抑制、血小板輸注無效等不良反應(yīng)［1］。有研究指出，輸注去白細(xì)胞成分血可有效降低非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生，以及減少輸血相關(guān)免疫、感染等相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生［2］。血小板型去白細(xì)胞濾器是臨床上常用的一種去除白細(xì)胞的器械，能夠有效濾除濃縮血小板中的白細(xì)胞［3］。本研究將血小板型去白細(xì)胞濾器應(yīng)用于濃縮血小板中白細(xì)胞的濾除，通過檢測濾除前后相關(guān)血液指標(biāo)的變化，旨在探討血小板型去白細(xì)胞濾器在提高濃縮血小板輸注效果中的價值。

1 材料與方法

1.1 濃縮血小板的來源 選取2013年2月至2014年3月間符合要求的健康獻(xiàn)血者，對其采集400 mL全血，于室溫條件下運輸和保存，并在6 h內(nèi)完成制備。采用富血小板血漿法制備濃縮血小板，于（23±1）℃范圍內(nèi)，1 328×g離心5 min，利用分漿器將上層血漿分離。同樣溫度下，在2 533×g離心15 min，獲取濃縮血小板55～75 mL，并靜置60 min，隨后進(jìn)行每分鐘60次的水平振蕩解聚。

1.2 儀器與試劑 血小板型去白細(xì)胞濾器購自南京塞爾金生物公司，KX-21N型多項目全自動血球計數(shù)儀器購自日本希森美康公司，日立7600全自動生化分析儀購自日本日立公司，Cyrofuge 6000i大容量離心機購自德國heraeus公司，590系列血小板聚集分析儀購自美國Chrono Log公司，Nageotte白細(xì)胞計數(shù)板和加厚蓋玻片購自美國BD公司，F(xiàn)E20型p H儀購自瑞士梅特勒-托利多公司，倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，UV-2800AH型紫外可見分光光度計購自上海優(yōu)浦科學(xué)儀器，F(xiàn)ACSCanto流式細(xì)胞儀。CD62p-PE及其同型對照鼠IgG1、PAC-1-FITC及其同型對照鼠IgG1、CD42b-APC抗體購自美國BD公司。試劑還包括Turk白細(xì)胞稀釋液和1%多聚甲醛溶液。

1.3 方法

1.3.1 濃縮血小板的過濾 將35袋制備好的同型濃縮血小板利用無菌接管機匯集成5袋治療量標(biāo)本后，連接血小板型去白細(xì)胞濾器，利用重力作用對血小板進(jìn)行過濾，并進(jìn)行收集。記錄過濾時間及血小板容量，利用全自動血球計數(shù)儀器對過濾前后的標(biāo)本進(jìn)行血細(xì)胞計數(shù)，用Nageotte白細(xì)胞計數(shù)板對濾后白細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀對血小板活化指標(biāo)PAC-1及CD62p的檢測 利用貧血小板血漿將濃縮血小板制成250×109的富血小板血漿，每份標(biāo)本取3支流式細(xì)胞管，加入血漿標(biāo)本10μL，分別將相應(yīng)的抗體和對照加入不同流式細(xì)胞管，輕輕晃動搖勻，于避光室溫下孵育20 min，預(yù)冷后，加入1%多聚甲醛并混勻，避光4℃條件下保存。于60 min內(nèi)完成樣品準(zhǔn)備并置于FACSCanto流式細(xì)胞儀上檢測。利用CD42b APC/SSC雙參數(shù)設(shè)門，用Cell Quest軟件獲取20 000個血小板進(jìn)行分析，血小板PAC-1及CD62p水平以其血小板陽性百分率表示。

1.3.3 利用生化分析儀對血小板低滲休克進(jìn)行測定 實驗?zāi)Ｊ綖閷崟r吸光度（A）值監(jiān)測，測定溫度為37℃，波長為610 nm，樣品與試劑比例為2∶1，監(jiān)測時間15 min，延遲時間5 s。以貧血小板血漿與磷酸鹽緩沖液（PBS）按2∶1的比例混合后調(diào)零，富血小板血漿與PBS混合樣品15 min時的A值為對照A值（A對照），富血小板血漿與蒸餾水混合樣品15 min時的A值為樣品A值（A樣品），并按下列公式計算：血小板低滲休克（%）=（A樣品-樣品最小A值）/（A對照-樣品最小A值）× 100%。

1.3.4 利用血小板聚集儀測定血小板聚集功能 利用貧血小板血漿將血小板聚集儀調(diào)零點，將500μL富血小板血漿置于測試杯中，放入一涂硅的小磁棒，37℃保溫5 min，加入10μL終濃度為20μmol/L的二磷酸腺苷，反應(yīng)7～10 min至曲線平穩(wěn)，以富血小板血漿的聚集率和透光度為0，貧血小板血漿所測得的聚集率和透光度為100%，分析血小板最大聚集率情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)錄入和管理采用EpiData3.0軟件，利用SPSS21.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用±s表示，過濾前后相關(guān)指標(biāo)比較采用配對t檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過濾前后血小板常規(guī)指標(biāo)的比較 利用血小板型去白細(xì)胞濾器進(jìn)行過濾后，白細(xì)胞去除率為（98.28±0.97）%，血小板回收率為（86.37±2.84）%，血小板過濾前后常規(guī)指標(biāo)變化見表1。過濾后白細(xì)胞計數(shù)、血小板、紅細(xì)胞均較過濾前減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），過濾前后血小板容量、平均血小板體積和p H值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 過濾前后血小板常規(guī)指標(biāo)變化情況比較（±s）

組別 白細(xì)胞（×106/L） 血小板（×109/L） 血小板容量（m L） 紅細(xì)胞（×1012/L） 平均血小板體積（f L） p H 279.4±78.8 263.1±43.4 246.8±29.5 0.006±0.002 12.29±0.90 7.13±0.16過濾后 4.4±1.1 231.9±35.5 239.7±30.1 0.003±0.001 12.06±0.71 7.09±0.12 t 14.071 2.203 0.898 5.580 0.084 1.010 P過濾前0.000 0.017 0.187 0.000 0.467 0.159

2.2 過濾前后血小板活化標(biāo)志物PAC-1和CD62p表達(dá)變化 利用流式細(xì)胞儀對血小板活化指標(biāo)PAC-1及CD62p進(jìn)行檢測，見圖1（見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”）。過濾前后血小板活化標(biāo)志物PAC-1和CD62p表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 過濾前后血小板活化標(biāo)志物PAC-1和CD62p表達(dá)變化情況（%，±s）

組別 PAC-1 CD62p 4.3±1.9 3.5±1.6過濾后 4.5±2.1 3.7±1.8 t 0.847 1.642 P過濾前0.201 0.054

2.3 血小板過濾前后低滲休克及聚集功能變化情況 過濾前后，血小板低滲休克和血小板聚集功能比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 血小板過濾前后低滲休克及聚集功能變化情況（%，±s）

77.3±9.1 60.2±14.8過濾后 72.6±7.8 59.3±13.5 t 0.808 0.251 P組別 血小板低滲休克 血小板聚集功能過濾前0.212 0.402

3 討 論

健康者的血容量相對恒定，如果一次失血超過全血量的15%時，機體的代償機制將不足以維持血壓的正常水平，可引起機體活動障礙，此時就需要輸血。通過大量研究證實，輸注濃縮血小板可用于治療因血小板減少或功能障礙導(dǎo)致的出血性疾病，濃縮血小板已在國外廣泛應(yīng)用［4-5］。亦有研究指出，輸入含有白細(xì)胞成分血小板時，會引起非溶血性發(fā)熱反應(yīng)、血小板輸注無效、輸血相關(guān)性免疫抑制等一系列不良反應(yīng)［6-7］。其中，非溶血性輸血發(fā)熱是最為常見的輸血反應(yīng)，主要是由含白細(xì)胞的血小板或全血輸注后與受血者體內(nèi)的血細(xì)胞發(fā)生同種免疫產(chǎn)生抗體所致［8］。臨床資料顯示，一個治療量的全血中白細(xì)胞含量小于0.5×109/L時，可有效預(yù)防非溶血性發(fā)熱反應(yīng)的發(fā)生，并且去除白細(xì)胞能夠有效降低患者的炎性并發(fā)癥的發(fā)生［9］。本研究利用血小板型去白細(xì)胞濾器對濃縮血小板中的白細(xì)胞進(jìn)行濾除，并對濾除前后的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測，獲得了理想效果。

本研究將白細(xì)胞濾器應(yīng)用于濃縮血小板中，其中，白細(xì)胞濾器濾除率的高低是衡量白細(xì)胞過濾器質(zhì)量的重要指標(biāo)，本次研究結(jié)果顯示，血小板型去白細(xì)胞濾器可有效濾除白細(xì)胞，同時可獲得較高的血小板回收率。過濾后白細(xì)胞計數(shù)、血小板、紅細(xì)胞均減少，過濾前后血小板容量、平均血小板體積和p H差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明白細(xì)胞濾器可有效濾除濃縮血小板中白細(xì)胞，對其他血液常規(guī)指標(biāo)影響較小，可以達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求。去白細(xì)胞濾器臨床療效的另外一個重要指標(biāo)是臨床中非溶血性輸血反應(yīng)發(fā)生率的降低程度，而白細(xì)胞的濾除則可有效降低非溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生［10］。本研究顯示，過濾前后血小板活化標(biāo)志物PAC-1和CD62p表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），過濾前后，血小板低滲休克和血小板聚集功能差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明使用白細(xì)胞濾器在濾除白細(xì)胞的同時，不會對血小板活化功能，以及抗低滲性休克能力和血小板聚集功能產(chǎn)生影響，與Cho等［11］研究結(jié)論相同。

綜上所述，血小板型去白細(xì)胞濾器能夠有效濾除濃縮血小板中的白細(xì)胞，濾后血小板的回收率符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不會改變血小板常規(guī)指標(biāo)，而且去白細(xì)胞濾器過濾濃縮血小板對血小板活化、聚集功能和抗低滲休克能力均無明顯影響，具有較高的安全性。

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Application of leukoreduction filter in removal of leukocytes in platelet concentrate*

Hu Wenhui1，Ruan Lixian2△，Cheng Haitao3，Wei Yanshun4

（1.Blood Center of Ezhou City，Ezhou，Hubei 436000，China；2.Women and Children's Hospital of Ezhou City，Ezhou，Hubei 436000，China；3.Ezhou Second Hospital，Ezhou，Hubei 436000，China；4.Ezhou Manicipal Iron and Steel Co.Hospital，Ezhou，Hubei 436000，China）

ObjectiveTo investigate the application of leukoreduction filter in removal of leukocytes in platelet concentrate.MethodsPlatelet concentrate was prepared by using platelet-rich plasma method.35 bags of the same type of prepared platelet concentrate were filtered by using leukoreduction filter.The changes of conventional indicators of platelet before and after filter were measured and recorded.The activating platelets indicators PAC-1 and CD62p were detected by using flow cytometry.The platelet hypotonic shock was measured by biochemical analyzer.The platelet aggregation was measured by using platelet aggregation instrument.ResultsAfter platelet concentrate was filtered by using leukoreduction filter，leukocyte removal rate was（98.28± 0.97）%，platelet recovery rate was（86.37±2.84）%.After filtration，white blood cell count，platelets，red blood cells were reduced than before filtration（P＜0.05）.The differences of capacity of platelets，mean platelet volume and p H before and after filtration were not statistically significant（P＞0.05）.Before and after filtration，the expression of platelet activation markers PAC-1 and CD62p，platelet aggregation and platelet hypotonic shock were not statistically different（P＞0.05）.ConclusionPlatelet leukoreduction filter could effectively filter leukocytes in platelet concentrate.It would not change the conventional indicators，and not affect platelet activation，aggregation and anti-hypotonic shock capacity significantly.

platelet； leukoreduction filter； leukocytes； platelet hypotonic shock； platelet aggregation

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.023

A

1673-4130（2015）17-2509-03

2015-01-08）

2013年鄂州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（2013EC05）。 作者簡介：胡文輝，男，副主任技師，主要從事采供血管理、血液病的診斷與治療及相關(guān)研究。△

，E-mail：844514883@qq.com。