人參根組織形態(tài)及其生理生化活性成分相關(guān)性研究

王曼瑩， 靳雯棋， 郭海洋， 王泓驍， 孫立偉

(北華大學(xué) 化學(xué)與生物學(xué)院， 吉林 吉林 132013)

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王曼瑩， 靳雯棋， 郭海洋， 王泓驍， 孫立偉*

(北華大學(xué) 化學(xué)與生物學(xué)院， 吉林 吉林 132013)

為了探討人參根組織形態(tài)及其生理生化活性成分的相關(guān)性，利用番紅-固綠雙重染色觀察人參組織形態(tài)，紫外分光光度法和ELISA等方法測定其代謝物含量和相關(guān)酶活力，并比較人參生物量的差異.結(jié)果表明園參比根重高于林下參，但其樹脂道、周皮木栓層細(xì)胞和韌皮部裂隙卻不如林下參發(fā)達(dá)，皂苷和丙酮酸含量及蘋果酸脫氫酶(MDH)活力也低于林下參；林下參比根長與抗氧化相關(guān)代謝物含量及酶活力隨年限增加而降低，但其樹脂道、周皮木栓層細(xì)胞和韌皮部裂隙逐漸發(fā)達(dá)，皂苷、淀粉和丙酮酸含量及MDH活力均升高.而且隨人參生長年限的增加，能量代謝逐漸增強，分泌組織(樹脂道)和貯存組織(周皮木栓層細(xì)胞、韌皮部裂隙)趨于發(fā)達(dá)，使根逐年增粗增重；皂苷含量的變化與其周皮木栓層細(xì)胞和韌皮部裂隙的變化呈正相關(guān)性；抗氧化能力與周皮木栓層細(xì)胞的緊密性呈負(fù)相關(guān).這均為利用人參形態(tài)來評價其質(zhì)量提供了實驗依據(jù).

人參； 生物量； 組織形態(tài)； 代謝物； 酶活力； 活性成分

人參(PanaxginsengC.A.Mey)為五加科多年生草本植物[1]，其干燥的根是我國著名的傳統(tǒng)中藥材，素有“百草之王”的美譽.中國最早的藥學(xué)典籍《神農(nóng)百草經(jīng)》就已經(jīng)把人參列為上品，具有大補元氣、安神益智、生津固脫、調(diào)補五臟、強精通脈和延緩衰老等功效[2].對于人參的質(zhì)量評價方法，自古以來一直依靠“五行”(須、皮、蘆、紋、體)和“六體”(靈、笨、老、嫩、棱、順) 等外部形態(tài)來判斷[3].并且我國1984年頒布的76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)中也明確提到，中藥材性狀特征是評價中藥材質(zhì)量優(yōu)劣的最直接方法.在2010年《中國藥典》(一部)的規(guī)定中， 性狀特征仍是中藥材宏觀質(zhì)量評價的內(nèi)容.然而，關(guān)于人參根組織形態(tài)與其內(nèi)部生理生化活性成分的相關(guān)性卻鮮有報道.因此，本實驗通過對園參和不同年限林下參的生物量、根組織形態(tài)、代謝物含量和酶活力進(jìn)行比較分析，闡述人參外部形態(tài)與其內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系的科學(xué)內(nèi)涵，為依據(jù)外部形態(tài)評價人參質(zhì)量提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 15年生、20年生、25年生林下參采自于127°E、42°N，海拔500 m吉林省撫松縣露水河鎮(zhèn)吳杰野山參基地，采樣時間2014年8月19日～8月21日.經(jīng)基地總經(jīng)理吳杰和長春中醫(yī)藥大學(xué)趙大慶教授共同鑒定，獲得不同年限的林下參各15株.5年生成熟園參樣品采購于吉林省撫松縣(與林下參屬于同一區(qū)域).

1.1.2 儀器與試劑 Leica RM2135切片機(德國Leica微系統(tǒng)有限公司)，Eppendorf 離心機5804R(德國Eppendorf股份公司)，UV765紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，JD200-3電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，奧林巴斯顯微鏡CKX41(奧林巴斯株式會社)，正丁醇、無水乙醇(北京化工廠)，二甲苯、石蠟、番紅(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，固綠FCF(Regal Biotechnology Company)，樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，二硝基苯肼、甲醇、三氯乙酸(天津光夏精細(xì)化工研究所).

1.2 方法

1.2.1 人參生物量及比根重、比根長的統(tǒng)計 人參分割成蘆頭、主根、側(cè)根3部分[4]，置于電子天平上稱量各部分質(zhì)量[5]，于坐標(biāo)紙上測量各部分長度[6]，并計算各部分比根重(根重/根長)、比根長(根長/根重).

1.2.2 人參石蠟切片的制作 新鮮人參根制成6 μm石蠟切片，經(jīng)番紅-固綠雙重染色后，用中性樹膠制成永久切片[7]，顯微鏡觀察并拍攝成像.

1.2.3 人參代謝物含量的測定 采用甲醇冷凝回流提取總皂苷[8]，紫外分光光度法于550 nm測定其含量.利用80%的乙醇提取淀粉[9]，利用紫外分光光度法于620 nm測定.用三氯乙酸提取丙酮酸[10]，應(yīng)用二硝基苯肼法于520 nm測定其含量.用25%溴乙酰冰醋酸溶液中提取木質(zhì)素[11]，于280 nm測定其含量.用10%三氯乙酸超聲提取丙二醛(MDA)[12]，分別在600、532和450 nm波長下測定吸光度值并進(jìn)行含量計算.

還原型抗壞血酸AsA和總抗壞血酸T-AsA用6%三氯乙酸提取[13]，紫外分光光度法于412 nm測定其含量，T-AsA減去AsA即得脫氫抗壞血酸(DHA).1.2.4人參能量代謝、抗氧化相關(guān)酶活力測定 能量代謝相關(guān)酶淀粉酶(AMY)和蘋果酸脫氫酶(MDH)活力采用分光光度法，分別在540 nm和340 nm測定活力，ATP合酶活力用ELISA試劑盒測定.

抗氧化相關(guān)酶抗壞血酸過氧化氫酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)[14]和過氧化物酶(POD)活力采用分光光度法，分別于290 nm、325 nm和470 nm測定.1.2.5數(shù)據(jù)處理 各組指標(biāo)采用統(tǒng)計軟件SPSS16.0[15]進(jìn)行分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.組件比較采用單因素方差分析比較各組指標(biāo)的顯著性差異，以P<0.05為差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 人參生物量的比較

對采摘的60株人參生物量(蘆、須、根的長度和質(zhì)量)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如表1所示.

表1 園參和不同年限林下參生物量

*：P<0.05表示與園參的各生物量有差異;#：P<0.05表示20年林下參與15年林下參有顯著性差異;+：P<0.05表示25年林下參與20年林下參有顯著性差異

如表1所示，園參的總重、主根重、須根重、比根重高于林下參，但比根長低于林下參；不同年限林下參的總重、主根重、須根重、比根重隨年限增加，但比根長隨年限減??；所有年限人參中，韌皮部與木質(zhì)部比重、蘆長與總長比值隨年限增加，總長、主根長、須根長隨年限而減小.

2.2 人參根組織形態(tài)學(xué)的比較

將人參制成石蠟切片(標(biāo)尺=0.1 mm)，用顯微鏡(×40)觀察園參和不同年限林下參的根組織形態(tài)學(xué)上的變化，如圖1和表2所示.

觀察切片顯示，隨著人參生長年限的增加，人參樹脂道逐漸發(fā)達(dá)，環(huán)數(shù)和個數(shù)均增加；周皮木栓層細(xì)胞越來越扁平且排列日趨緊密、韌皮部裂隙出現(xiàn)，并不斷增大，導(dǎo)管個數(shù)也逐漸增加.

圖1 園參和不同年限林下參組織切片F(xiàn)ig.1 Tissue slice of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years

表2 園參和不同年限林下參組織結(jié)構(gòu)比較

2.3 人參代謝物含量的比較

人參在生長過程中會產(chǎn)生多種代謝物，這些代謝物有些是人參的藥用成分，如皂苷、蛋白；有些是儲能物質(zhì)，如淀粉；它們的含量在生長過程中也發(fā)生了顯著地變化.

圖2 園參和不同年限林下參代謝物的含量Fig.2 Metabolites content of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years

如圖2所示，園參的淀粉、木質(zhì)素、MDA含量高于林下參，但皂苷、丙酮酸含量和AsA/DHA比值則低于林下參；不同年限林下參中，皂苷、丙酮酸、MDA含量隨年限增高，而淀粉、木質(zhì)素含量和AsA/DHA隨年限降低.

2.4 人參酶活力的比較

代謝物的產(chǎn)生離不開酶的參與.有些酶能調(diào)節(jié)人參的生長發(fā)育、有些能幫助對抗惡劣環(huán)境，故檢測與人參能量代謝和抗氧化相關(guān)酶活力，圖3為園參和不同年限林下參酶活力比較.

圖3所示，園參AMY、ATP合酶活力高于林下參，MDH活力低于林下參，APX、POD、SOD活力略低于15年林下參；不同年限林下參中，AMY、ATP合酶、SOD活力逐漸降低，APX、POD活力逐漸降低并趨于穩(wěn)定，MDH活力逐漸升高.

圖3 園參和不同年限林下參酶活力Fig.3 Enzyme activity of cultivated ginseng and ginseng under forest in different years．

3 討論

通過對人參的生物量進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，園參的比根重高于林下參，可能由于園參是人工栽培的，陽光和水分充足且少病蟲害，生長環(huán)境明顯優(yōu)于林下參而導(dǎo)致；但園參蘆長低于林下參，可能由于蘆頭是人參生長年限的重要標(biāo)志，故隨年限而增長；在不同年限林下參中，比根重隨年限增加，而比根長下降，也就是說根在逐年的增重增粗，其內(nèi)部組織形態(tài)及物質(zhì)合成代謝水平也必然會伴隨著發(fā)生變化.人參中韌皮部重/木質(zhì)部重的比值隨生長年限而升高，這也許與韌皮部主要負(fù)責(zé)有機物(如糖、蛋白質(zhì))的運輸與貯藏功能有關(guān)[16]，韌皮部所占重量的增加，說明在生長過程中人參的代謝活動越旺盛.

通過觀察人參根組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)隨著人參生長年限的增加，周皮(木栓層細(xì)胞)、韌皮部、形成層、樹脂道和導(dǎo)管都發(fā)生了變化.樹脂道是植物分泌產(chǎn)生代謝物的重要組織[17]，可產(chǎn)生皂苷[18]、 淀粉、蛋白質(zhì)及多種無機鹽等，人參的分泌組織樹脂道逐漸發(fā)達(dá)(環(huán)數(shù)和個數(shù)均增加)，預(yù)示著人參的活性成分合成增強.周皮和韌皮部是貯存代謝物的主要組織，樹脂道分泌的代謝物主要貯存在此.人參樹脂道、周皮和韌皮部隨年限逐漸發(fā)達(dá)，周皮木栓層細(xì)胞越來越扁平且排列日趨緊密、韌皮部裂隙出現(xiàn)并不斷增大[19]，與生物量中韌皮部與木質(zhì)部比重逐漸增大相符.由此推測，隨著年限的增加，人參活性成分的合成與代謝也隨之增加.

為了進(jìn)一步驗證人參代謝活動與其組織形態(tài)學(xué)的關(guān)系，檢測了人參的代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶的變化.人參進(jìn)行能量代謝的主要活性成分是淀粉和丙酮酸.淀粉是植物體內(nèi)貯藏的高分子碳水化合物，可以分解供能，植物也能利用太陽光能合成淀粉來貯藏，園參生長環(huán)境優(yōu)越，不需要消耗大量淀粉供能，使淀粉得以積累，所以園參淀粉含量高于林下參；而林下參隨著生長年限增加而逐漸成熟，所需能量逐漸下降，使淀粉含量得以積累.丙酮酸作為三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的樞紐物質(zhì)，實驗研究證實丙酮酸含量升高，意味著人參糖代謝、氨基酸代謝和次級代謝以及能量代謝等較為活躍.物質(zhì)的代謝離不開相關(guān)酶的催化，故能量代謝也必與淀粉酶AMY、蘋果酸脫氫酶MDH和ATP合酶緊密相關(guān).AMY可分解淀粉氧化供能，為人參幼苗的組織形態(tài)形成和生長發(fā)育提供能源，經(jīng)檢測AMY活性下降說明人參降解淀粉的能力減弱，能量以淀粉的形式被貯存，這與淀粉含量檢測結(jié)果相一致.MDH是調(diào)節(jié)三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要酶，參與糖異生、氨基酸合成、脂肪酸氧化和氧化呼吸作用等代謝途徑，在植物的生長發(fā)育和種子萌發(fā)、植株生長、果實發(fā)育成熟等方面起著重要作用，MDH活性升高并趨于穩(wěn)定說明人參逐漸成熟，能量需求趨于穩(wěn)定.ATP合酶是人參氧化呼吸代謝不可或缺的酶，人參隨著生長趨于成熟穩(wěn)定，故ATP合酶活力不再增加，反有緩慢下降趨勢.隨生長年限的增長，人參能量代謝逐漸增強與人參根形態(tài)學(xué)上的增粗增重、生理活動的物質(zhì)合成能力呈正相關(guān)性[20].

隨著人參生長年限的變化，能量代謝逐漸增強，能量及物質(zhì)合成前體增加，也就必然伴隨次生代謝的活躍.而人參皂苷等次生代謝物正是其有效活性成分.通過對人參總皂苷含量檢測顯示，發(fā)現(xiàn)園參皂苷含量略低于15年和20年林下參，不同年限林下參皂苷含量隨年限而增加呈正相關(guān).并且已有研究報道，皂苷多分布在周皮與韌皮部[21]，這與本研究結(jié)果相一致，人參生長過程中皂苷含量逐漸增加，同時周皮木栓層細(xì)胞日趨緊密，韌皮部裂隙增大、質(zhì)量增加.也就是說皂苷含量的變化與組織結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān).

植物在生長發(fā)育或遭受逆境脅迫過程中，活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài).植物體內(nèi)存在著一套負(fù)責(zé)清除活性氧的抗氧化系統(tǒng)，包括壞血酸(還原型抗壞血酸AsA、脫氫抗壞血酸DHA)等抗氧化劑和調(diào)節(jié)其代謝的酶類(超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD、抗壞血酸過氧化氫酶APX)等活性物質(zhì).這些活性物質(zhì)成分含量的改變，直接反映植物的抗氧化能力.MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物衰老或遭受逆境傷害的程度.而SOD和POD是膜脂過氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，可消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)(如MDA)，實驗結(jié)果顯示隨生長年限增加，人參逐漸衰老，MDA含量不斷升高，SOD和POD活性隨之降低[22].二者呈負(fù)相關(guān).AsA/DHA可反映抗氧化能力，APX是AsA循環(huán)的關(guān)鍵酶，實驗結(jié)果顯示AsA/DHA比值下降，并且APX活性與抗壞血酸變化趨勢相近，說明人參隨著生長成熟抗氧化能力逐漸降低.這也可能與人參生長成熟后其周皮木栓層細(xì)胞排列緊密，對外界刺激防御能力增強，活性氧產(chǎn)生下降有關(guān).

4 結(jié)論

本實驗通過對園參和不同年限林下參的生物量、根組織形態(tài)、代謝物含量和酶活性進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)園參和不同年限林下參的根組織形態(tài)存在差別，這種差別可能是由于人參內(nèi)部代謝活動的變化所導(dǎo)致的.初步分析發(fā)現(xiàn)人參隨能量代謝的增強及淀粉的貯備，導(dǎo)致根逐漸增粗增重；皂苷含量的變化與其周皮木栓層細(xì)胞和韌皮部裂隙的變化呈正相關(guān)性；抗氧化能力與周皮木栓層細(xì)胞的緊密性呈負(fù)相關(guān).通過探討人參根組織形態(tài)與生理生化活性成分之間的關(guān)系，為依據(jù)外部形態(tài)評價人參質(zhì)量提供重要的實驗依據(jù).

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Study on the relevance between ginseng root tissue morphology and biologically active ingredients

WANG Manying， JIN Wenqi， GUO Haiyang， WANG Hongxiao， SUN Liwei

(College of Chemistry and Biology, Beihua University， Jilin, Jilin 132013)

In order to study the relevance between ginseng root morphology and biologically active ingredients, the morphology of ginseng was observed using safranin and fast green staining and the contents of metabolites. Activities of enzymes and the biomass of ginseng were measured by ELISA and spectrophotometry methods. Our results indicated that the root weight ratio of cultivated ginseng was higher than that of ginseng under forest. However, the resin channel, cork layer cells and phloem fissure of ginseng under forest were more developed than those of cultivated ginseng. The accumulations of ginsenosid, pyruvate and the activity of MDH were higher in ginseng under forest compared to cultivated ginseng. In addition, we found that as the ginseng ages increase, the resin channel, cork layer cells and phloem fissure were more developed and the accumulations of ginsenoside, starch, pyruvate and the activity of MDH were elevated. However, the root weight ratio and the accumulations of antioxidant metabolites and enzymes of ginseng decreased. At the same time, the energy metabolism, cork layer cells and phloem fissure became more developed. All of these might contribute to the growth and development of ginseng root. There existed a positive correlation between the content of ginsenoside and the developed degree of the cork layer cell and phloem fissure and the antioxidant ability was negatively correlated with the tightness of cork layer cells. Our results provided an experimental basis of the quality evaluation of ginseng according to its morphology.

ginseng; biomass; tissue morphology; metabolite; enzyme activity; biologically active ingredient

2015-01-20.

國家科技支撐計劃項目(2012BAI29B05)；國家自然科學(xué)基金項目(81373932)；吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目(YYZX201268).

1000-1190(2015)03-0428-06

Q946.91

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: sunnylilwei@163.com.