新型水凝膠對(duì)三氯生的緩釋及抗菌性能研究

劉珍珍 楊麗萍 陳能 王文榮 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所三水中心 （佛山 528137）

三氯生，學(xué)名“二氯苯氧氯酚”，化學(xué)分子式為C12H7Cl3O2，又名“三氯新”、“三氯沙”等，是一種廣譜抗菌劑，被廣泛用作化妝品、洗滌劑、醫(yī)療消毒及衛(wèi)生保健產(chǎn)品的活性成分等[1]。因其對(duì)皮膚無(wú)刺激性和較低的細(xì)胞毒性，目前三氯生多是通過(guò)乳膏的形式進(jìn)行皮膚疾病的治療[2]。

但是，三氯生是疏水性抗菌劑且容易失活，在水凝膠基質(zhì)中容易聚集，從而導(dǎo)致生物利用率降低[3]。因此，如何將疏水的三氯生均勻分散到親水性水凝膠基質(zhì)中，是三氯生在臨床應(yīng)用中面臨的難題。目前的三氯生乳膏多是通過(guò)添加甘油、乙二醇等增溶劑增加其溶解性，仍難以解決持續(xù)釋放三氯生以及提高其穩(wěn)定性的目的。而且，乙二醇等添加劑會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性[4]。

利用兩親性Pluronic F-88 聚合物在水溶液中負(fù)載疏水的三氯生，然后再與環(huán)糊精相互作用制備原位包埋三氯生的超分子水凝膠。該水凝膠具備優(yōu)異的生物相容性和觸變性能[5]，且對(duì)三氯生有緩釋效果，并長(zhǎng)時(shí)間保持三氯生的活性。

1.原料與試劑

Pluronic F-88（聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇，EO103-PO40-EO103）：Sigma 公司，純度 ≥ 99%；α-環(huán)糊精（α-CD）：日本TCI 公司，純度 ≥ 99%；三氯生（二氯苯氧氯酚，TC）：日本TCI公司，純度 ≥ 98%；其他試劑購(gòu)自廣州齊云生物科技有限公司，均為分析純。

2.載三氯生水凝膠的制備及表征

2.1 制備方法

將2.0 g F-88 溶解于30 mL 水中，然后在冰浴條件下逐滴滴加20 mL 含TC 的丙酮溶液（1 mg/mL）。待滴加完成后將冰浴撤掉，室溫條件下攪拌4 小時(shí)后于37 ?C 繼續(xù)水浴震蕩24 小時(shí)，得到澄清透明溶液。將此溶液室溫條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至體積減少至30 mL，用0.45 μm 過(guò)濾頭過(guò)濾，得到載TC 的膠束（F-88/TC）。通過(guò)紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品在282 nm 處的吸光度值[6]，從而計(jì)算膠束對(duì)TC 的負(fù)載量為52.4 mg/g。

將所得F-88/TC 膠束與一定濃度（10、12 或14%）的α-CD 溶液等體積混合，室溫條件下靜置過(guò)夜，即可得到負(fù)載TC 的超分子水凝膠。

2.2 水凝膠物理性質(zhì)表征

為表征凝膠樣品的觸變性，對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切掃描和剪切躍遷掃描表征。將凝膠樣品置于TA ARES/RFS 高級(jí)流變擴(kuò)展系統(tǒng)，于50 mm 平行板夾具和25?C 條件下進(jìn)行測(cè)試。測(cè)定樣品剪切粘度時(shí)，設(shè)定剪切速率范圍為10—0.01 s-1；測(cè)定樣品的觸變行為時(shí)，設(shè)定剪切速率在10 s-1和0.1 s-1條件下交替變化。

2.3 三氯生的體外釋放測(cè)定

將100 μL 負(fù)載TC 的超分子水凝膠加入800 μL PBS（0.01 M, pH = 7.4）緩沖溶液中，置于37?C 的水浴中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。每隔一段時(shí)間，從上層清液中小心取出200 μL 釋放液，然后將新鮮的200 μL PBS 緩沖溶液補(bǔ)加到燒杯中。取出的釋放液用200 轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心分離，除去釋放液中的懸浮物。TC 的含量通過(guò)紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)得，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2> 0.999。

2.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.4.1 微生物生長(zhǎng)曲線

用LB 培養(yǎng)基將載抗菌劑的凝膠配制成TC濃度為50 ppm 的懸濁液，并且配制空白對(duì)照樣。在無(wú)菌室將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從斜面刮下，轉(zhuǎn)接入已滅菌好的10 mL 培養(yǎng)液中。37?C 下恒溫活化8 h，然后取出2.5 mL 轉(zhuǎn)接入含有50mL 培養(yǎng)液的錐形瓶中，繼續(xù)活化2h。用0.8 wt.%的生理鹽水離心洗滌三次，并且稀釋成一定濃度的菌樣。將菌樣加入裝有30mL 待測(cè)樣品的錐形瓶中。在37?C 下恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)量。利用紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)量樣品在600 nm 處的吸光度值，從而得到細(xì)菌的菌量。

2.4.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn)

稱取牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、瓊脂2 g 溶于100 mL 蒸餾水中，加熱融化，待溶液冷至室溫時(shí)，用1.0 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 至7.2，高壓滅菌約30 min。待溶液冷卻至約50?C，分別加入大腸桿菌種和金黃色葡萄球菌種，冷卻形成固體培養(yǎng)基。利用打洞法注入水凝膠樣品（水凝膠樣品事先冰箱保存一個(gè)月），于37?C恒溫下培養(yǎng)30 h，觀察抑菌圈大小。

3.結(jié)果與討論

Pluronic F-88 是一類聚乙二醇—聚丙二醇—聚乙二醇兩親性嵌段聚合物，該類嵌段聚合物在水溶液中可自組裝形成膠束，膠束的核可負(fù)載疏水藥物TC，膠束的殼因?yàn)榫垡叶兼湺蔚拇嬖?，可以與α-CD 發(fā)生主客體作用形成水凝膠[5]。

圖1. 不同α-CD 含量的水凝膠的剪切粘度隨剪切速率的變化曲線

圖2. 含6.0% α-CD 的水凝膠的觸變測(cè)試結(jié)果

圖3. 不同α-CD 含量的水凝膠對(duì)TC 的體外釋放曲線

該類超分子水凝膠屬于物理凝膠，可被外加的機(jī)械作用力破壞，從而導(dǎo)致凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠發(fā)生流動(dòng)；而當(dāng)外力撤去后，其結(jié)晶結(jié)構(gòu)又可恢復(fù)到起始狀態(tài)。該水凝膠的這種觸變行為使其在醫(yī)用敷料、可注射藥物載體等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[7]。為研究α-CD 濃度對(duì)超分子水凝膠觸變性的影響，通過(guò)穩(wěn)態(tài)剪切掃描和觸變環(huán)掃描對(duì)不同組分的超分子水凝膠進(jìn)行了表征。圖1 所示為凝膠樣品的剪切粘度隨剪切速率的變化規(guī)律。凝膠樣品具有剪切變稀的性質(zhì)，隨著剪切速率的增加，其剪切粘度迅速減小。且隨α-CD濃度的增加，凝膠樣品的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，剪切變稀特性增強(qiáng)。

圖2 所示為凝膠樣品的觸變性質(zhì)表征，以含6.0% α-CD 的水凝膠樣品為例：在低剪切速率（0.1 s-1）條件下，凝膠樣品在測(cè)試開始階段表現(xiàn)出剪切變稀的性質(zhì)，10 s 之后基本達(dá)到平衡；當(dāng)剪切速率增加到10 s-1時(shí)，凝膠樣品的剪切粘度瞬間降低至0.48 Pa·s 左右且達(dá)到平衡，此時(shí)體系表現(xiàn)出良好的流動(dòng)性；120 s 后，當(dāng)剪切速率再次恢復(fù)到小速率0.1 s-1時(shí)，凝膠樣品的粘度又迅速恢復(fù)至90 Pa·s 左右。該類凝膠體系表現(xiàn)出良好的觸變性能，有望作為一類新型可注射藥物載體得到廣泛應(yīng)用。

水凝膠作為藥物載體，其重要優(yōu)勢(shì)之一在于對(duì)藥物分子具有良好的控制釋放和持續(xù)釋放的效果[8]。圖3 所示為含不同α-CD 濃度的超分子水凝膠對(duì)TC 的體外釋放行為?？梢钥闯?，一系列不同配比的凝膠體系對(duì)TC 均有良好的控釋效果，所有樣品均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的暴釋現(xiàn)象，且釋放過(guò)程可持續(xù)14 天以上。隨著體系中α-CD 濃度的增加，超分子水凝膠的強(qiáng)度增大，其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，因而對(duì)TC 的釋放更加緩慢。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)體系中α-CD 濃度達(dá)到合理緩釋藥物的目的。

圖4. 大腸桿菌（a）和金黃葡萄球菌（b）在不同樣品作用下的生長(zhǎng)曲線（凝膠樣品中α-CD 的濃度為6%）

圖5. 凝膠樣品的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果（凝膠樣品中α-CD 的濃度為6%）

圖4 所示為不同樣品條件下大腸桿菌和金黃葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線。對(duì)于未負(fù)載藥物的凝膠材料，大腸桿菌和金黃葡萄球菌均持續(xù)了7 h 的對(duì)數(shù)期后進(jìn)入穩(wěn)定期，與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。對(duì)于負(fù)載TC 的凝膠樣品，其抑菌效果顯著，大腸桿菌和金黃葡萄球菌在用藥8 小時(shí)候均趨向于零，與純的TC 無(wú)明顯差異。在4—6 小時(shí)期間，負(fù)載TC 的凝膠樣品比純TC 的抑菌效果超差，可能是因?yàn)門C 從凝膠基質(zhì)中釋放出來(lái)需要一定的時(shí)間所導(dǎo)致。

圖5 所示為載TC 的凝膠樣品對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，保存時(shí)間一個(gè)月的凝膠樣品對(duì)兩種微生物均有良好的抑菌效果，抑菌圈明顯。同時(shí)，凝膠材料對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌效果要好于大腸桿菌。因此，該抗菌水凝膠可長(zhǎng)時(shí)間保持TC 的生物活性，在皮膚外用治療方面具有較好的應(yīng)用前景。

4.結(jié)論

以Pluronic F-88 為疏水的TC 的穩(wěn)定劑，以及利用F-88 與α-CD 的相互作用，制備出一類新型的負(fù)載TC 的水凝膠材料。凝膠材料有良好的剪切變稀的性質(zhì)和觸變性能，可作為可注射藥物載體和凝膠敷料進(jìn)行應(yīng)用。負(fù)載TC 的凝膠樣品體現(xiàn)出良好的抗菌性能，對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有良好的抑菌效果。

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