鈦合金球頭鍍類金剛石碳膜人工髖關(guān)節(jié)磨屑分析

屈文振，廖偉雄，張 浩，李 冀，王克濤，楊以萌，李眾利

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

鈦合金球頭鍍類金剛石碳膜人工髖關(guān)節(jié)磨屑分析

屈文振，廖偉雄，張 浩，李 冀，王克濤，楊以萌，李眾利

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

目的分析鈦合金球頭鍍類金剛石碳(diamond-like carbon，DLC)膜人工髖關(guān)節(jié)的磨屑特征。方法實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組：進(jìn)口關(guān)節(jié)組(A)，鈷鉻鉬合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯(ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE)臼杯(CoCrMo-UHMWPE，Zimmer，America)；鍍膜關(guān)節(jié)組(B)，鍍類金剛石碳膜鈦合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯臼杯(Ti-DLC- UHMWPE，京航，中國(guó))；國(guó)產(chǎn)關(guān)節(jié)組(C)，鈷鉻鉬合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo- UHMWPE，京航，中國(guó))。髖關(guān)節(jié)模擬機(jī)運(yùn)行0.33×106轉(zhuǎn)后，收集含有磨屑的小牛血清潤(rùn)滑液，經(jīng)酸消解過(guò)濾后，用掃描電鏡-能量色散X線分析儀鑒定濾膜上的磨屑。采用Image-Pro Plus 6.0對(duì)電鏡圖片進(jìn)行圖像分析獲取顆粒大小、形狀、數(shù)量信息，比較各組的差異。結(jié)果能量色散X線分析顯示磨屑的元素峰主要為碳(C)峰，未見(jiàn)明顯的鈷(Co)、鉻(Cr)、鉬(Mo)、鈦(Ti)等金屬元素峰。各組磨屑60%以上為類球狀顆粒，粒徑為0.1 ～ 40μm，0.1 ～ 1μm的顆粒數(shù)量較多，1μm以上的顆粒所占體積百分比大；B組濾膜上的磨屑數(shù)量少于另外兩組。結(jié)論實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的磨屑主要為超高分子量聚乙烯顆粒；鈦合金球頭鍍類金剛石碳膜人工髖關(guān)節(jié)可減少磨屑的數(shù)量。

髖假體；超高分子量聚乙烯；類金剛石碳；磨屑

人工全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(total hip arthroplasty，THA)經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展，目前已經(jīng)成為最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)置換手術(shù)[1]。然而，術(shù)后假體產(chǎn)生的磨屑會(huì)誘發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，引起假體周圍骨溶解，導(dǎo)致假體松動(dòng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，每年接受關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者術(shù)后骨溶解及關(guān)節(jié)松動(dòng)的發(fā)生率達(dá)到了20%[2-3]。磨屑的類型取決于人工關(guān)節(jié)摩擦界面應(yīng)用的材料和固定方式。目前，假體磨屑主要有聚合物[通常是超高分子量聚乙烯(ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE)或者高交聯(lián)聚乙烯]、金屬(通常是鈷鉻鉬合金CoCrMo、鈦合金)、氧化鋁陶瓷和骨水泥(PMMA)。其中關(guān)于UHMWP磨屑和金屬磨屑的研究最多，因?yàn)榻饘?UHMWPE和陶瓷-UHMWPE是人工關(guān)節(jié)最常用的摩擦配伍界面。UHMWP磨屑是最主要的摩擦產(chǎn)物，假體周圍組織消化分解后的細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，磨屑中70% ～ 90%都是聚乙烯顆粒[4]。金屬磨屑可使局部組織或血液中金屬離子含量升高，超過(guò)正常閾值，具有潛在的細(xì)胞毒性[5-6]。陶瓷材料由于其低摩擦系數(shù)的特點(diǎn)，產(chǎn)生的陶瓷磨屑少，粒徑小，易碎裂是其最大的缺點(diǎn)[7]。傳統(tǒng)的骨水泥固定假體會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生大量骨水泥顆粒。隨著人們對(duì)假體磨屑危害認(rèn)識(shí)的加深，無(wú)骨水泥的生物型固定應(yīng)用越來(lái)越廣泛。2012年美國(guó)93%接受THA的患者都采用了生物型固定假體[8]。研究表明，磨屑的類型、尺寸、形狀、數(shù)量、表面形貌都可以影響磨屑引起細(xì)胞反應(yīng)的大小。因此，準(zhǔn)確把握磨屑特征可以更好地評(píng)估假體摩擦產(chǎn)物引起細(xì)胞反應(yīng)的潛在能力，對(duì)于改進(jìn)人工關(guān)節(jié)生物材料和假體設(shè)計(jì)有重要的參考意義。本實(shí)驗(yàn)收集了髖關(guān)節(jié)模擬機(jī)運(yùn)行0.33×106轉(zhuǎn)后含有磨屑的小牛血清潤(rùn)滑液，對(duì)鈦合金球頭鍍類金剛石碳膜人工髖關(guān)節(jié)的磨屑進(jìn)行了初步的定性、定量分析，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。

材料和方法

1 儀器試劑 所用試劑均為分析純級(jí)別。37%鹽酸(體積分?jǐn)?shù))，無(wú)水甲醇，蒸餾水，可換膜過(guò)濾器(直徑25 mm，Millipore)，聚碳酸酯濾膜(直徑25 mm，Whatman)，水浴恒溫振蕩器(SHZ-88，金壇市岸頭儀都儀器廠)，數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱(HD，昆山海達(dá)精密儀器有限公司)，掃描電鏡-X線能譜儀(SEM-EDS)(S-3000N，日本Hitachi)。

2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組：進(jìn)口關(guān)節(jié)組(A)，鈷鉻鉬合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo-UHMWPE，Zimmer，America)；鍍膜關(guān)節(jié)組(B)，鍍DLC膜鈦合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯臼杯(Ti-DLC-UHMWPE，京航，中國(guó))；國(guó)產(chǎn)關(guān)節(jié)組(C)，鈷鉻鉬合金球頭對(duì)超高分子量聚乙烯臼杯(CoCrMo-UHMWPE，京航，中國(guó))。

3 髖關(guān)節(jié)模擬機(jī)實(shí)驗(yàn) 采用蛋白質(zhì)濃度為17 g/L的小牛血清(加入了0.03%疊氮化鈉)作為潤(rùn)滑介質(zhì)。Prosim髖關(guān)節(jié)模擬機(jī)運(yùn)行0.33×106轉(zhuǎn)后，收集血清標(biāo)本，-80℃保存。

4 磨屑提取 取體積分?jǐn)?shù)為37%的濃鹽酸40 ml置于離心管中，加入10 ml的小牛血清標(biāo)本，于50℃恒溫振蕩箱中放置1 h。消解完畢后(此時(shí)溶液變?yōu)樽仙?，配成不同濃度，各取0.5 ml消解液，分別加入10 ml甲醇稀釋(20倍組)，100 ml甲醇(200倍)稀釋。將稀釋后的消化溶液分別經(jīng)孔徑為1μm、0.1μm的聚碳酸酯膜(Whattman， British)濾膜過(guò)濾，收集每次過(guò)濾后的濾膜并做好正反標(biāo)記，隨后的處理中始終保持濾膜正面(含顆粒面)朝上。濾膜干燥后噴金處理增強(qiáng)其導(dǎo)電性，然后用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察濾膜上磨屑的特征。

5 磨屑測(cè)量 參考Besong等[9]的方法，每個(gè)樣品至少在4張顆粒無(wú)重疊的圖片上測(cè)量至少150個(gè)微粒，獲取相關(guān)參數(shù)(共統(tǒng)計(jì)2 000多顆粒)。能量色散X線分析儀(Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy，EDX)確定顆粒的元素種類，排除可能存在的污染情況。使用Image-Pro Plus 6.0對(duì)保存的SEM圖片進(jìn)行圖像分析，測(cè)算顆粒的大小、形狀、數(shù)量。參照之前研究[10]，采用二分法對(duì)顆粒形狀分類：首先計(jì)算顆粒的縱橫比(aspect ratio，AR)，AR≤2.4為類球狀顆粒，AR＞2.4為纖維條狀顆粒(包含鏡下觀察到的條狀、棒狀及部分片塊狀顆粒)。采用以下公式估算整張濾膜上的磨屑數(shù)量和體積：

N：1張濾膜上的磨屑數(shù)量；n：觀察視野下的顆粒數(shù)；V：1張濾膜上的磨屑體積；v：觀察視野下的顆粒體積；S：濾膜的面積；s：觀察視野的面積。文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)原子力顯微鏡觀察測(cè)出濾膜上顆粒的厚度，線性回歸法確定顆粒厚度約為等效圓直徑(equivalent circle diameter，ECD)的1/3[11]，顆粒體積計(jì)算公式：

V粒：顆粒體積；S粒：顆粒在濾膜上的二維投影面積；ECD：與顆粒投影面積相等的圓的直徑。

結(jié) 果

1 不同稀釋倍數(shù)下濾膜上的顆粒密度對(duì)比 血清消化溶液在不同的稀釋倍數(shù)下過(guò)濾后，掃面電鏡下所見(jiàn)濾膜上顆粒分布的密度不同：20倍組濾膜上顆粒比較密集，顆粒相互重疊、聚集成團(tuán)的較多(圖1)，幾乎看不到濾膜、濾孔。稀釋200倍組的顆粒分布較均勻，出現(xiàn)團(tuán)聚的情況較少，背景濾膜和濾孔清晰可見(jiàn)(圖1)。

2 顆粒成分鑒定 對(duì)樣品隨機(jī)抽選的區(qū)域顆粒進(jìn)行X線能譜分析(稀釋20倍條件下)，顆粒C、O能譜峰最明顯，未見(jiàn)明顯的Co、Cr、Mo、Ti元素峰。定量結(jié)果顯示，C、O元素所占比例達(dá)95%以上，而Co、Cr、Mo、Ti元素合計(jì)不到1%(圖2)。顆粒中主要為非金屬成分，參考ISO 17853和以前文獻(xiàn)中關(guān)于UHMWPE的研究和電鏡圖片[12-13]，可判斷濾膜上的顆粒主要為UHMWPE顆粒。

3 顆粒形態(tài)分析 電鏡下觀察，可見(jiàn)到各組磨屑呈現(xiàn)類球狀、條狀、桿狀、片狀、團(tuán)塊狀(圖3)。觀察中發(fā)現(xiàn)，顆粒的尺寸越大，其形態(tài)越多變、表面形貌越復(fù)雜。而尺寸越小的磨粒其輪廓越規(guī)則、表面越光滑，呈現(xiàn)類球狀。大粒徑的磨粒分布不均勻，容易有小顆粒附著，形成粘連團(tuán)聚。更有某些看似大粒徑的顆粒完全由小顆粒聚集而成。各組磨屑的形態(tài)均以類球狀為主，0.1μm濾膜和1μm濾膜上類球狀顆粒數(shù)量百分比均占到60%以上(圖4)。

4 顆粒的粒徑、數(shù)量和體積 顆粒的粒徑分布范圍為0.1 ～ 40μm，0.1μm濾膜上90%的顆粒ECD為0.1 ～ 0.5μm，1μm濾膜上90%的顆粒ECD為1 ～ 10μm。各組數(shù)量、體積分布規(guī)律一致。0.1 ～ 1μm的顆粒數(shù)量較多，占到整張濾膜上顆粒數(shù)量的98% ～ 99%，但所占整張濾膜上顆粒體積比不到6%；1μm以上的顆粒體積較大，占到整張濾膜上顆粒體積的94% ～ 98%，但數(shù)量?jī)H占整張濾膜上顆粒數(shù)的1% ～ 2%(圖5 ～圖6)。B組濾膜上顆?？倲?shù)量最少，其次是A組，C組顆粒數(shù)量最高(圖7)。B組濾膜上顆?？傮w積最大，其次是A組，C組顆粒體積最小(圖8)。

圖 1 B組濾膜上磨屑SEM圖片 A:消化溶液稀釋20倍； B:消化溶液稀釋200倍Fig. 1 SEM picture of debris on filter in group B A: digestion solution diluted 20 times; B: digestion solution diluted 200 times

圖 2 濾膜上不同區(qū)域顆粒的EDX分析Fig. 2 EDX analysis of debris on filter in different fields

討 論

國(guó)外最早在20世紀(jì)60年代末就開(kāi)始了體外關(guān)節(jié)模擬機(jī)實(shí)驗(yàn)[14]，國(guó)內(nèi)的人工關(guān)節(jié)摩擦實(shí)驗(yàn)起步較晚，而且往往側(cè)重于對(duì)不同材料界面、不同介質(zhì)中的摩擦系數(shù)、磨損體積和磨損率的考察，而對(duì)直接引起生物學(xué)反應(yīng)的磨屑研究較少。磨屑不同的種類、尺寸、數(shù)量和形態(tài)反映了不同的磨損形式、機(jī)制和潛在引起生物學(xué)反應(yīng)的能力，含有重要的摩擦學(xué)信息。文獻(xiàn)報(bào)道，幾種常見(jiàn)的磨屑中，鈦顆粒激活巨噬細(xì)胞的作用最小[15]。不規(guī)則顆粒和0.1 ～ 10μm的顆粒比其他顆粒更強(qiáng)烈地激活巨噬細(xì)胞[16]。表面越粗糙、形狀越不規(guī)則的磨屑引起的細(xì)胞反應(yīng)越重[10]。因此，磨屑的特征，對(duì)于人工關(guān)節(jié)摩擦界面生物材料的性能評(píng)估有著重要參考意義。

由于血清消化溶液中的磨屑含量未知，不同的稀釋倍數(shù)可極大影響電鏡觀察濾膜上磨屑的圖片質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血清消化溶液稀釋20倍時(shí)電鏡觀察到濾膜上顆粒密集，磨屑成團(tuán)成片分布，有利于EDX集中分析磨屑的元素組成，卻不利于單個(gè)顆粒的測(cè)量。而血清消化溶液稀釋200倍濾膜上的顆粒分布均勻，背景清晰，便于單個(gè)顆粒的參數(shù)測(cè)量和計(jì)數(shù)工作。20倍和200倍的稀釋條件可在磨屑分析實(shí)驗(yàn)中互補(bǔ)運(yùn)用。

磨屑不同的形態(tài)反映了不同的磨損機(jī)制。類球狀顆粒數(shù)量較多，粒徑較小，在顆粒分散好、無(wú)重疊的視野中容易觀察到(0.1μm濾膜多見(jiàn))，多為假體界面輕度黏著磨損或腐蝕磨損過(guò)程中產(chǎn)生。條狀、桿棒狀顆粒是由于假體材料表面撕裂，脫落的顆粒受到反復(fù)摩擦碾壓形成，見(jiàn)于嚴(yán)重的黏著磨損或磨粒磨損。碎片狀顆粒邊緣整齊，表面光滑，有時(shí)呈現(xiàn)折疊卷曲狀，考慮為從假體表面分層剝落產(chǎn)生的顆粒，多見(jiàn)于疲勞磨損。觀察到的團(tuán)塊狀顆粒中，多數(shù)形狀不規(guī)則，表面毛糙，存在小顆粒的附著、聚集，部分表面還有裂隙。少數(shù)團(tuán)塊顆粒輪廓清晰、形態(tài)完整、表面光滑、體積巨大，考慮為整塊從假體界面的脫落，多發(fā)生在初期的磨合磨損階段和后期的劇烈磨損階段。

圖 3 顆粒形態(tài) A：類球狀顆粒(×8 000)； B: 團(tuán)塊狀顆粒(×800)； C：棒狀顆粒(×800)； D：條狀(撕裂狀)顆粒(×10 000)；E：碎片狀顆粒(×800)； F：大顆粒輪廓不清，表面形貌復(fù)雜；小顆粒輪廓清晰，表面光滑(×8 000)Fig. 3 Morphology of debris A： globe-like debris (×8 000)； B: block debris (×800)； C： rod-like debris (×800)； D：tear debris (×10 000)； E：flake debris (×800)； F： large debris with unclear outline and coarse surface, while small debris with clear outline and smooth surface (×8 000)

圖 4 各組類球狀顆粒的比例Fig. 4 Globe-like debris proportion in all groups

圖 5 0.1μm濾膜上顆粒數(shù)量(A)和體積(B)占比Fig. 5 Proportion of number (A) and volume (B) of debris on 0.1μm filter

圖 6 磨屑粒徑分布： 0.1μm濾膜(A)和1μm濾膜(B)Fig. 6 Distribution of debris size on 0.1μm filter (A) and 1μm filter (B)

圖 7 濾膜上顆粒數(shù)量Fig. 7 Number of debris on filter

圖 8 濾膜上顆粒體積Fig. 8 Volume of debris on filter

人工關(guān)節(jié)磨屑的研究中發(fā)現(xiàn)，引起細(xì)胞反應(yīng)的亞微米級(jí)、納米級(jí)顆粒數(shù)量眾多，所占的體積卻不大；大顆粒體積大，數(shù)量卻少，與周圍組織接觸面積有限。我們更關(guān)心特定尺寸范圍的數(shù)量分布。Hallab和Jacobs[3]的研究顯示，植入假體聚合物顆粒直徑范圍0.23 ～ 1μm，從人體回收的磨屑70% ～90%都為亞微米級(jí)別。Visentin等[17]從假體周圍組織和關(guān)節(jié)滑液中提取的聚乙烯顆粒ECD為0.48 ～0.95μm。Affatato等[18]發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)模擬機(jī)上80%的超高分子量聚乙烯顆粒ECD為0.2 ～ 0.6μm。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小牛血清消解液采用1μm、0.1μm的濾膜梯度過(guò)濾，計(jì)算濾膜上磨屑的粒度分布，0.1μm以下的顆粒未納入檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1 ～1μm的顆粒在濾膜上分布均勻，數(shù)量眾多，占磨屑總數(shù)量的95%以上；長(zhǎng)徑10μm以上的顆粒數(shù)量較少，抽樣視野中未見(jiàn)到50μm以上的顆粒。該結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致，反應(yīng)了假體早期磨損的顆粒分布特征，顆粒數(shù)量明顯呈隨粒徑遞減的偏態(tài)分布，提示磨屑中可能存在更多未觀察到的納米級(jí)的顆粒。B組(鍍膜實(shí)驗(yàn)組)產(chǎn)生的磨屑總體積最大，但磨屑的數(shù)量最少；C組磨屑總體積最小，而磨屑數(shù)量卻最多。這種反差說(shuō)明了鍍膜組產(chǎn)生的磨屑粒徑較大，而磨屑的數(shù)量反而較少。提示鍍膜假體的保護(hù)性作用在于減少磨屑的數(shù)量，而并不一定能減少磨屑的體積，單從假體的磨損體積分析并不能反映真實(shí)的情況。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中納米碳多層膜鍍膜人工髖關(guān)節(jié)產(chǎn)生的磨屑主要為UHMWPE顆粒，粒徑多分布在1μm以下，形狀以類球狀為主；與對(duì)照組比較，鈦合金球頭鍍納米碳多層膜人工髖關(guān)節(jié)產(chǎn)生的磨損顆粒數(shù)量較少，1μm以下的免疫激活能力強(qiáng)的顆粒含量更低。

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Wear particles analysis of Ti alloy femoral heads with diamond-like carbon coating

QU Wenzhen, LIAO Weixiong, ZHANG Hao, LI Ji, WANG Ketao, YANG Yimeng, LI Zhongli
Department of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LI Zhongli． Email: lizhongli@263．net

ObjectiveTo identify the characteristics of wear particles generated by Ti alloy femoral head coated by diamondlike carbon (DLC) film on hip simulator．MethodsThree groups of artificial femoral head were studied in this research, Group A: CoCrMo alloy femoral head against ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) acetabular cup (CoCrMo- UHMWPE，Zimmer, America); Group B: Ti alloy femoral head with diamond-like carbon coating against UHMWPE acetabular cup (Ti-DLCUHMWPE, Jinghang, China); Group C: CoCrMo alloy femoral head against UHMWPE acetabular cup (CoCrMo- UHMWPE, Jinghang, China)． Fetal bovine serum lubricant was collected respectively from each group after 0．33 million circles (mc)． Then the bovine serum was digested by adding acid and filtered through polycarbonate． The characteristics of particles of each group were determined by scanning electron microscope-energy dispersion X-ray analysis (SEM-EDX)． The size, shape and number of particles were measured with Image-Pro Plus6．0 on SEM pictures．ResultsThe energy dispersion X-ray analysis (EDX) showed that the main element was carbon． No marked cobalt, chromium, molybdenum, titanium was detected． Over 60% of the particles were globe-like in all groups． The particle size varied from 0．1 to 40μm, most of which ranged from 0．1 to 1μm． Particles with diameter over 1μm had a large proportion in volume． The number of particles on filter in group B was less than other groups．ConclusionThe wear particles are predominately UHMWPE particles． Artificial femoral heads with DLC coating produce less wear particles．

hip prosthesis; ultra-high molecular weight polyethylene; diamond-like carbon; wear debris

R 318

A

2095-5227(2015)12-1217-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.12.016

時(shí)間：2015-11-11 10:35:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20151111.1035.008.html

2015-04-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI18B04)

Supported by the National Key Technology R&D Program(2012BAI18B04)

屈文振，男，在讀碩士。研究方向：關(guān)節(jié)外科與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。Email: qwz8519@163.com

李眾利，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。Email: lizh ongli@263.net