精子冷凍保存技術(shù)及研究進(jìn)展

平述煌，楊世華

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

精子冷凍保存技術(shù)及研究進(jìn)展

平述煌，楊世華

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650224)

精子冷凍是輔助生殖技術(shù)的基礎(chǔ)，能夠有效的保存有價(jià)值的基因資源。文章回顧了近些年來國內(nèi)外精子冷凍保存的重要研究成果，分析了精子的來源、冷凍預(yù)處理、冷凍和解凍方法、防凍劑的選擇及其加入去除方式的選擇等因素對(duì)精子冷凍效果的影響。文章還總結(jié)了精子冷凍效果的評(píng)價(jià)方法，展望精子冷凍技術(shù)的發(fā)展方向和應(yīng)用前景。

精子冷凍;防凍劑;冷凍評(píng)估

精子冷凍是一個(gè)復(fù)雜的過程，影響冷凍效果的因素主要包括精子的來源、冷凍稀釋液和防凍劑的選擇、冷凍和解凍方法的選擇。在精子的冷凍過程中外來的壓力，如冷休克、防凍劑的毒性、冰晶的形成、滲透壓的改變，都會(huì)造成精子結(jié)構(gòu)和功能的損傷，其損傷程度則由精子自身對(duì)外來壓力的耐受能力來決定。不同物種或同物種不同個(gè)體的精子在大小、形態(tài)、生物化學(xué)等方面不同，對(duì)外來壓力的承受能力也就不同，需要對(duì)每一個(gè)保存處理環(huán)節(jié)進(jìn)行適宜的選擇，并綜合考慮多個(gè)因素的作用，以此優(yōu)化冷凍程序。本文就精子的來源、冷凍前預(yù)處理、冷凍/解凍方法、防凍劑對(duì)冷凍效果的影響和解凍后精子的質(zhì)量評(píng)估這兩方面做綜述。

1 精液的采集

根據(jù)供精動(dòng)物的睪丸狀態(tài)，采集精子主要有兩種：活體采精和離體附睪取精。

1.1 活體采精

活體采精是借助于外來誘導(dǎo)刺激或自然情況下讓動(dòng)物自主排精。該方法能夠有效地減少動(dòng)物損傷，具有很好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。特別對(duì)瀕危、珍貴動(dòng)物，活體采精是獲取精液的主要方法，能大大提高動(dòng)物的利用價(jià)值。

對(duì)于哺乳動(dòng)物，常采用的采精方法有人工假陰道誘導(dǎo)排精、手握陰莖刺激排精、電刺激排精。前兩種方法比較簡(jiǎn)單、便捷，且設(shè)備投入較少，主要實(shí)用于已經(jīng)完全馴化的家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而對(duì)于育種價(jià)值高而失去爬跨能力、不明原因不育等不適宜常規(guī)方法采精的家畜、野生動(dòng)物，陰莖或直腸電刺激采精方法就很重要。

此外，鳥類精子的采集方法主要是腹按摩或推拿誘導(dǎo)射精法;魚類精子的采集方式主要是洗提法;爬行類動(dòng)物精子的采集方式主要是腹部按摩法;兩棲類動(dòng)物的精子的采集方法主要是腹部擠壓法或精囊穿刺法。

1.2 附睪離體取精

在野外狀態(tài)下采集瀕死或死亡時(shí)間不長的雄性尸體內(nèi)附睪精子，或者活體采精無法完成采精的動(dòng)物也可以通過手術(shù)或致死后獲取附睪精子。也可以從屠宰場(chǎng)動(dòng)物尸體上分離、或?qū)櫸锸杖菡镜牧骼藢櫸锶?shì)、或?yàn)榱艘呙缟a(chǎn)犧牲的非人靈長類動(dòng)物中分離附睪及睪丸，并可以在4℃保存，清洗處理后從附睪中分離精子。

2 冷凍前精液預(yù)處理

2.1 精子的優(yōu)選

不同物種或同一物種不同個(gè)體間的精液品質(zhì)有很大的差異。一般情況下，冷凍前精液質(zhì)量越高，解凍后精子的活力會(huì)越好［1］。為了獲取高的活精子比例，常常會(huì)對(duì)所冷凍的精子進(jìn)行優(yōu)選處理，尤其是鮮精活力較低的精子，以提高精液質(zhì)量。目前，常采用的優(yōu)選方法有離心法和上游法。

2.1.1 離心法：普通的離心處理可以去除精液中的精漿和上皮細(xì)胞［2］，而密度梯度離心法，可以根據(jù)精子的密度將不同活力、形態(tài)的精子進(jìn)行分離。這樣能夠有效地富集有活力、形態(tài)正常的精子，去除雜質(zhì)細(xì)胞和死精子，同時(shí)分離出遺傳物質(zhì)不正常的精子［3］。

2.1.2 上游法：用于分離出有活力和無活力的精子，增加精液中運(yùn)動(dòng)精子的百分率。同時(shí)，上游法可以去除精漿、無活力的精子、雜質(zhì)細(xì)胞、無定形物質(zhì)等，避免精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)，有效的改善冷凍精子的運(yùn)動(dòng)特性、頂體狀態(tài)和質(zhì)膜完整性，提高精液品質(zhì)［4］。相比離心去除精漿和死精子而言，上游法具有不造成精子亞致死性損傷的優(yōu)點(diǎn)［5］。

2.2 預(yù)冷處理

冷凍前進(jìn)行預(yù)冷處理，其目的是保證精子有一段適應(yīng)低溫的過程，同時(shí)又能使?jié)B透性防凍劑充分滲透進(jìn)精子細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，減少、甚至避免精子的冷休克損傷，進(jìn)而起到抗凍保護(hù)作用。

目前，常采用的方法是水浴平衡法，一般從室溫降到4℃或5℃，便于精子以改變質(zhì)膜結(jié)構(gòu)來適應(yīng)低溫環(huán)境。對(duì)防凍劑毒性不太敏感的精子，直接將防凍劑加入到稀釋液中，保證防凍劑充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到保護(hù)精子免受損傷的作用;對(duì)防凍劑表現(xiàn)出毒性的精子，通常先用無防凍劑的冷凍稀釋液稀釋精液，并添加一定濃度的卵黃或脫脂奶，在低溫條件下加入含防凍劑的冷凍液，并在低溫環(huán)境中平衡一定的時(shí)間，以保證防凍劑充分進(jìn)入細(xì)胞。

3 冷凍液和防凍劑

3.1 冷凍稀釋液

主要包括兩性離子、果糖、Tris卵黃緩沖液、Tris-Tes卵黃緩沖液、檸檬酸鹽、TEST檸檬酸鹽卵黃緩沖液等。其主要作用是優(yōu)化精子所處環(huán)境的滲透壓與pH值，為精子提供能量，防止精子細(xì)胞內(nèi)磷脂的流失并起著防凍劑的作用，防止細(xì)菌污染，去除高度稀釋對(duì)精子的負(fù)面影響，給精子適應(yīng)外界環(huán)境創(chuàng)造有利條件［6］。

稀釋液不僅是精子冷凍的介質(zhì)，而且直接影響著精子的冷凍成活率。目前常用的冷凍稀釋液有：靈長類的TTE和TEST、馬的 INRA 96、牛的 Triladyl((R))、鳥類的EK、魚類的鹽溶液等。

3.2 防凍劑

適當(dāng)防凍劑的加入，可以有效減少精子冷凍過程中的冷凍損傷。常用的防凍劑主要包括兩大類：滲透性防凍劑和非滲透性防凍劑。滲透性防凍劑是一類含有-OH基的小分子化合物，如甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇等，它們可以自由通過細(xì)胞膜;非滲透性防凍劑是一類不能透過細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)，如卵黃、糖類、脂蛋白等，主要增加細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和緩解冷凍損傷。不同物種精子的防凍劑選擇應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)、或逐個(gè)試驗(yàn)篩選其對(duì)該物種精子冷凍保護(hù)效果。

不同物種的精子對(duì)不同防凍劑毒害作用的承受能力和其滲透性也不同。如乙二醇對(duì)獼猴精子細(xì)胞的滲透性強(qiáng)于其它滲透性防凍劑，可以應(yīng)用到獼猴精子冷凍中［7］;DMSO可以用于短尾猴精子冷凍保存中［8］，但不適于獼猴精子的冷凍保存［9］，這與精子細(xì)胞自身的毒性承受能力有關(guān)。

3.3 防凍劑的加入與去除方式

精子質(zhì)膜對(duì)不同的滲透性防凍劑的通透性不同，在冷凍前添加防凍劑和解凍后去除防凍劑所產(chǎn)生的滲透壓變化可能會(huì)造成細(xì)胞的損傷。因此，在添加和去除防凍劑時(shí)，盡量避免滲透壓的劇烈變化。防凍劑的加入與去除大致分為兩類：一步和多步加入去除法。多步加入或去除防凍劑，能夠改善冷凍/解凍精子的功能［10］;在低溫條件下加入防凍劑，可以提高冷凍/解凍精子的活力［11］。對(duì)于那些對(duì)防凍劑敏感的精子，應(yīng)該優(yōu)先考慮多步法加入或去除防凍劑。

4 冷凍與解凍方法

在精子的冷凍過程中，冷凍速率會(huì)影響到精子細(xì)胞內(nèi)外溶液的滲透壓和pH的平衡，是深低溫冷凍保存的一個(gè)決定性因素。理論上，過慢的冷凍速率會(huì)使細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡得到維持，但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水，并過分升高胞內(nèi)鹽濃度而造成鹽害;過快的冷凍速率會(huì)使細(xì)胞水分不能充分流出，從而導(dǎo)致巨大胞內(nèi)冰晶的形成，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷。冷凍過程中，保證精子生存的一個(gè)理想狀態(tài)應(yīng)該是在冷凍速率的一個(gè)平衡點(diǎn)。

目前，根據(jù)降溫速率和降溫程序的不同將冷凍方法主要?dú)w結(jié)成五種類型：快速冷凍法、慢速冷凍法、玻璃化冷凍法、定向結(jié)冰冷凍法和干燥冷凍法。

4.1 快速冷凍法

將精液加到冷凍液中混勻，裝入冷凍麥管或冷凍管后，不經(jīng)過降溫前期的冷平衡而放在液氮面上方的適當(dāng)高度，利用液氮蒸汽降溫至低于-30℃后，直接投入液氮中進(jìn)行低溫冷凍保存。這種方法在動(dòng)物精子冷凍保存中應(yīng)用的很少。

4.2 慢速冷凍法

慢速冷凍法是最常用的動(dòng)物精子冷凍保存方法，也是中小型動(dòng)物精子冷凍的首選技術(shù)。將精液加到冷凍液中混勻，裝入冷凍麥管，然后用程序冷凍儀控制完成降溫過程或利用液氮蒸汽直接降溫，降溫至低于-30℃，最終投入液氮中進(jìn)行保存［12］。

4.3 玻璃化冷凍法

該方法主要包括快速降溫和快速復(fù)溫兩個(gè)過程：快速降溫是為了避免冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，快速復(fù)溫可防止過冷玻璃態(tài)下重結(jié)晶的發(fā)生，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷［13］。該方法冷卻速率快，很多情況下需要增加滲透性防凍劑的濃度，需要選擇對(duì)細(xì)胞毒性小的防凍劑，這是目前研究精子玻璃化冷凍的重點(diǎn)方向。

4.4 定向結(jié)冰精子冷凍法

定向結(jié)冰精子冷凍儀(MTG516)是以色列科學(xué)家專門為大容量冷凍精液而設(shè)計(jì)的，可以冷凍2 mL、5 mL、8 mL容量的精液，已成功運(yùn)用在精液量大的野生動(dòng)物上，如大象［14］，犀牛［15］，兔［16］等以及二次重復(fù)冷凍牛的精子［17］。該方法是將裝有已預(yù)冷精液的中空玻璃冷凍管放入預(yù)先設(shè)置、平衡的低溫艙內(nèi)口，通過一定速率推動(dòng)冷凍管進(jìn)入冷凍倉，致使樣品中水分形成有序的冰晶，降低冰晶對(duì)精子的損傷;解凍時(shí)，通過在冷凍管孔內(nèi)外的溫?zé)崴鲃?dòng)，迅速、均一地將精液解凍，防止大容量精液的重結(jié)晶形成。

4.5 干燥冷凍法

該方法主要包括冷凍、干燥和保存三個(gè)過程，并已成功利用在小鼠精子冷凍保存中［18］。在冷凍的過程中，細(xì)胞內(nèi)形成冰晶是不可避免的，但只要不形成對(duì)細(xì)胞有損傷的大冰晶，是不會(huì)對(duì)精子造成損傷的;隨后將冷凍好的精液轉(zhuǎn)入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥處理，使精液中固態(tài)的玻璃化冰直接汽化成氣態(tài)，進(jìn)而使精子免受胞內(nèi)冰晶所造成的損傷;在保存過程中，該技術(shù)不需要液氮或干冰，可在4℃長期保存，室溫下可長途運(yùn)輸，因此節(jié)省了儲(chǔ)存空間，減少了運(yùn)輸成本，更經(jīng)濟(jì)、更實(shí)用地保存種質(zhì)細(xì)胞［19］。雖然通過該技術(shù)所獲得的精子都是死精子，且精子已經(jīng)失去運(yùn)動(dòng)能力和受精能力，但所得精子染色體的完整率很高，可以借助于胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)獲取體外胚胎。

5 精液活力檢測(cè)

5.1 結(jié)構(gòu)完整性檢測(cè)

5.1.1 質(zhì)膜完整性：質(zhì)膜完整性是評(píng)估冷凍精子質(zhì)量和功能的一個(gè)重要指標(biāo)。目前，用于檢測(cè)質(zhì)膜完整性的常用方法有曙紅/苯胺黑染色法、低滲膨脹試驗(yàn)和熒光染色法。熒光染色法是當(dāng)前使用最多的方法，常用的熒光染料大致可以分成兩大類：染活精子的特異性熒光染料如CFDA、SYBR-14等，這類染料可以進(jìn)入質(zhì)膜完整的精子細(xì)胞內(nèi)，是膜通透性染料;染死精子的特異性染料如 PI、Hoechst 33258、Yo-Pro-1、ethidium homodimer-1 等，這類染料只能進(jìn)入質(zhì)膜不完整的精子，是膜不通透性染料。通常情況下，會(huì)將這兩類聯(lián)合使用，其染色效果比用單獨(dú)的染料染色好，如 SYBR-14/PI雙染法［20］、Hoechst 33342/PI雙染法［21］等。

5.1.2 頂體完整性：頂體反應(yīng)是精子完成受精的前提條件，而頂體的完整是保證頂體反應(yīng)的必要條件。目前，用于檢測(cè)精子頂體狀態(tài)的方法主要是熒光染色法，即利用頂體素與花生凝集素(PNA)［22］或豌豆凝集素(PSA)［23］特異結(jié)合的特性，用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記凝集素，來檢測(cè)精子的頂體完整性。

5.1.3 染色質(zhì)完整性：目前，用于檢測(cè)精子DNA完整性的方法主要是吖啶橙(AO)染色法，其染色原理是染色質(zhì)正常的精子能夠保持其原有的雙鏈結(jié)構(gòu)，與吖啶橙結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色;染色質(zhì)異常的精子，其DNA會(huì)變性或解聚成單鏈結(jié)構(gòu)，與吖啶橙結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色、桔紅色或黃色［24］。

5.1.4 線粒體活性：線粒體的主要功能是為精子的運(yùn)動(dòng)提供能量，因此通過檢測(cè)精子的線粒體活性來預(yù)測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)能力。目前，一般采用熒光染色法來檢測(cè)精子的線粒體活性，常用的熒光染色法有JC-1 染色法［25］、Rhodamine 123 染色法［24］和 DiOC6(3)/PI雙染法［26］。

5.2 功能檢測(cè)

5.2.1 運(yùn)動(dòng)度：運(yùn)動(dòng)度是指運(yùn)動(dòng)的精子占總精子數(shù)的百分比，包括鮮精運(yùn)動(dòng)度、冷凍前精子運(yùn)動(dòng)度和復(fù)蘇運(yùn)動(dòng)度。鮮精運(yùn)動(dòng)度反映了所取精子的品質(zhì);冷凍前運(yùn)動(dòng)度反映了冷凍平衡方法的優(yōu)劣和防凍劑的毒性;復(fù)蘇運(yùn)動(dòng)度反映了冷凍復(fù)蘇后精子的運(yùn)動(dòng)情況，用來衡量冷凍方法的優(yōu)劣。目前，常采用的運(yùn)動(dòng)度檢測(cè)方法有光學(xué)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法［25］和計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)技術(shù)法［22］。

5.2.2 受精能力：體外間接評(píng)估精子受精能力的方法有半透明帶結(jié)合試驗(yàn)［27］和倉鼠裸卵穿透試驗(yàn)［28］;直接評(píng)估冷凍/復(fù)蘇精子受精能力的方法有人工授精［29］和體外受精［30］。而利用凍精獲得健康的新生個(gè)體是檢測(cè)精子冷凍成功的“金”標(biāo)準(zhǔn)，由于涉及受精、發(fā)育、妊娠管理等諸多因素，往往利用凍精的囊胚發(fā)育率、或人工授精的懷孕率作為凍精受精能力的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

6 前景與展望

精子冷凍保存在保護(hù)瀕危動(dòng)物種質(zhì)資源多樣性、構(gòu)建精子(基因)庫、動(dòng)物繁殖、不孕不育癥治療、避免非生殖季節(jié)原因無精子狀況、以及增加受精研究的穩(wěn)定性、便捷性等方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用。借助于輔助生殖技術(shù)，凍精被越來越多用于生產(chǎn)體外或體內(nèi)胚胎和緩解動(dòng)物不育問題，將來需要著重研究的方向主要體現(xiàn)在以下五個(gè)方面：(1)個(gè)體化精子冷凍程序;(2)化學(xué)成分明確的冷凍稀釋液;(3)低毒性的防凍劑;(4)自動(dòng)化精子冷凍儀;(5)冷凍/解凍精子活力的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)

隨著對(duì)生物多樣性認(rèn)識(shí)加深，對(duì)物種的種質(zhì)資源需求與保護(hù)越來越受關(guān)注，無論是野生動(dòng)物還是人們熟悉的馴化動(dòng)物，它們的種質(zhì)細(xì)胞都需要相對(duì)安全的、不隨時(shí)間變化的被保存起來，以應(yīng)對(duì)環(huán)境日益惡化對(duì)物種資源的威脅、緩解科學(xué)研究對(duì)現(xiàn)生動(dòng)物的過度利用，提高現(xiàn)有動(dòng)物的利用率和利用價(jià)值。

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Progress on Sperm Cryopreservation

PING Shu-huang，YANG Shi-hua
(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650224)

Sperm cryopreservation has revolutionized the field of assisted reproduction，and it can provide an effective way to preserve valuable genetic resources.This review contained information relating to the cryopreservation of animal semen through a summary of significance research results about domestic and foreign sperm cryopreservation in recent years，and the topics discussed that the effect of semen collection，freezing pretreatment，freezing and thawing methodologies，cryoprotectant selection and methods of its addition and removal on sperm cryopreservation.In addition，this review also focus on evaluation criteria for post-thaw spermatozoa，proposing prospect on anticipation about research orientation of sperm cryopreservation and its application.

Sperm cryopreservation;Cryoprotectant;Freezing-thawing evaluation

S814.8 R332

A

1671-7856(2011)03-0067-05

2010-06-28

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.03.017

國家自然科學(xué)基金(31071279)。

平述煌(1985-)，男，碩士生，主要從事動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的研究。E-mail：pingshuhuang1985@163.com。

楊世華(1972-)，教授，主要從事動(dòng)物生殖生物學(xué)研究，E-mail：yshhm@163.com。