通過調控表觀遺傳修飾以提高細胞再程序化效率的研究進展

謝欣彤 吳漫茵 林 瑤 蔡 颯 潘 宇 付小兵

（1. 深圳大學醫(yī)學部，廣東 深圳 518060；2. 廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510080；3．解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復與組織再生重點實驗室暨皮膚損傷修復與組織再生北京市重點實驗室，北京 100048）

機體發(fā)育過程中，干細胞通過程序性分化過程產生具有特定形態(tài)和功能的體細胞。細胞再程序化是通過外源性導入轉錄因子等方法，使之重新獲得分化前的多能性（即去分化）或改變其特性進而轉變?yōu)榱硪环N組織細胞（即轉分化）[1]。通過轉染4種轉錄因子（Oc t4、Sox 2、c-My c和Klf4，OSKM），可誘導成纖維細胞再程序化為具有胚胎干細胞特性的誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）[2]。Kim等[3-4]通過導入特定細胞分化所需的關鍵因子直接誘導成纖維細胞再程序化為神經、心肌等細胞。細胞再程序化技術日漸成為獲得各種體細胞的重要途徑。然而，目前細胞再程序化技術效率還很低下，這可能與再程序化發(fā)生過程中表觀遺傳學調控所致的細胞分化命運的隨機性有關。細胞分化過程中，表觀遺傳學調控使染色質變得致密，多能性因子的表達位點被封閉；而再程序化使染色質重構為疏松狀態(tài)，重新暴露多能因子的結合位點，這些位點的利用效率決定再程序化的效率。事實上在誘導過程中所生成的部分再程序化的前iPSCs（pre-iPSCs）的數量遠高于完全再程序化的細胞數量（如iPSCs）。Pre-iPSCs無多向分化潛能，不表達或低表達核心多能性基因，雖然表觀遺傳修飾向iPSCs轉變，仍保留分化狀態(tài)的表觀遺傳修飾。能否使pre-iPSCs完成再程序化過程變?yōu)閕PSCs依賴于隨機的表觀遺傳事件。因此，探討再程序化過程中的表觀遺傳修飾機制將對提高再程序化效率提供重要依據。本文將近年表觀遺傳修飾在再程序化過程中的研究進展，及其在提高細胞再程序化效率中的應用情況綜述如下。

1 表觀遺傳修飾

表觀遺傳修飾即在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達和細胞表型產生可逆性可遺傳改變，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質重塑，以及mic ro RNA等非編碼RNA的調控等。研究表明，在再程序化過程中表觀遺傳修飾可重新激活內源性多能性相關基因、建立開放的染色質狀態(tài)、并抑制種系特異性基因，有利于部分再程序化狀態(tài)向完全再程序化狀態(tài)轉變，從而提高再程序化效率。

2 DNA甲基化修飾

DNA甲基化是指甲基被選擇性轉移至胞嘧啶的過程。對于脊椎動物，DNA甲基化主要發(fā)生的位點是胞苷磷酸鳥苷（Cp G），成簇Cp G所在區(qū)域被稱為Cp G島。許多基因啟動子都包含Cp G島，啟動子Cp G島的DNA甲基化可影響蛋白質與DNA的相互作用，導致基因沉默；而基因激活時啟動子Cp G島往往是去甲基化狀態(tài)。這些過程主要受DNA甲基轉移酶（Dnmt）和DNA脫甲基酶（d MTase）的調控。目前認識到，甲基化轉移酶家族成員包括Dnmt l、Dnmt 2、Dnmt 3a、Dnmt 3b 和 Dnmt 3L[5]，其中 Dnmt l、Dnmt 3a、Dnmt 3b是DNA甲基化所必需的3種酶。Dnmt1維持細胞分裂過程中DNA復制時半甲基化DNA的進一步全甲基化，它以非甲基化DNA為底物，識別已甲基化的親代鏈, 使相應位置的胞嘧啶甲基化。Dnmt3a、Dnmt3b參與建立重頭DNA甲基化，先半甲基化DNA，繼而全甲基化，其中Dnmt3a似乎是Dnmt1、Dnmt3b的共調節(jié)因子。在機體發(fā)育過程中，祖生殖細胞幾乎完全地去甲基化，如受精卵最初幾次卵裂時，其甲基化水平極低。而胚胎發(fā)育及干細胞分化的過程中，可以觀察到大量的重新建立的甲基化。DNA甲基化促進細胞分化而使細胞的多能性逐漸減少，據此可推斷，細胞再程序化過程中這種表觀遺傳修飾需被逆轉。在再程序化的過程中，Dnmt的總體表達下調，導致多能性因子基因啟動子區(qū)幾乎被完全去甲基化。因此，iPSCs誘導因子啟動子區(qū)的甲基化水平也成為評估再程序化誘導效果的重要指標之一。

目前研究顯示，通過調控相關基因啟動子區(qū)甲基化水平可有效影響再程序化過程。通過抑制Dnmt1可降低多能性轉錄因子Oct4、Nanog、Sox2啟動子區(qū)甲基化水平，從而促進細胞再程序化效率。在小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）誘導成iPSCs的過程中加入Dnmt1的抑制物5-氮雜胞苷（5-Aza）后，甲基化水平降低，再程序化效率可提高將近10倍[6]。利用siRNA干擾Dnmt1的表達, 也可明顯提高再程序化效率。d MTase作用與Dnmt相反，抑制d MTase可促進DNA甲基化，因而可能阻礙細胞再程序化。Tet1（ten-eleven translocation-1）能夠催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）轉化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），參與DNA 去甲基化，從而維持再程序化因子Nanog的表達。Tet1敲除可導致Nanog基因啟動子DNA甲基化，繼而通過抑制Nanog基因表達降低iPSCs誘導效率[7]。活化誘導胞嘧啶核苷脫氨酶（ac tivation-induced c ytidine deaminase，AID）可促進多能性基因啟動子去甲基化。在鼠胚胎干細胞與人成纖維細胞融合的過程中，利用微小RNA（siRNA）抑制AID表達，DNA去甲基化減少，從而抑制Oc t4和Nanog基因的表達，導致細胞融合的再程序化效率顯著下降[7]。

因此，多能性因子基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平是影響細胞再程序化的一個非常重要的表觀遺傳修飾因素，通過Dnmt及d MTase的調控改變相關基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，有利于提高再程序化的誘導效率[6-7]。

3 通過組蛋白修飾提高再程序化誘導效率

組蛋白的轉錄后修飾包括在酶的作用下進行甲基化、乙酰化共價修飾，是作用于染色質結構的調節(jié)。組蛋白乙?；谷旧w處于開放狀態(tài)從而利于基因轉錄；組蛋白甲基化能抑制或激活轉錄，取決于甲基化作用的位點和程度。

3.1 組蛋白乙?；?組蛋白乙酰化位點位于核心組蛋白N末端尾部保守的賴氨酸殘基，在組蛋白乙酰轉移酶（HAT）和組蛋白去乙?；福℉DAC）的調控下進行。HAT將乙酰基轉移到核心組蛋白氨基末端尾部保守的賴氨酸殘基上，中和了組蛋白的正電荷，使組蛋白與帶負電荷的DNA相互作用減弱，導致染色體結構變得疏松，這種松弛的結構促進了DNA 分子與各種轉錄調控因子的接觸, 促進基因的轉錄過程[8]。相反，HDAC催化組蛋白上的乙酰基轉移，增加了組蛋白和DNA的相互作用，染色體結構變得緊密從而抑制轉錄。在胚胎干細胞分化早期，可見廣泛的組織特異性基因組蛋白乙?；皆龈撸鸾M織特異性基因的表達上調。未分化細胞的多能性基因（Oc t4、 Nanog、 Rex 3等）的組蛋白處于高水平乙?；逊只毎嗄苄曰虻慕M蛋白乙?；瘏s處于很低水平。再程序化是體細胞重獲多能性的過程，因此體細胞再程序化過程中增強組蛋白乙酰化能使加入的多能性轉錄因子與DNA分子更充分的接觸，有利于多能性基因表達上調，有利于體細胞再程序化。

組蛋白去乙?；敢种苿┛稍黾咏M蛋白乙?；?。丙戊酸（VPA）是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，聯(lián)合OSKM因子誘導MEFs時，可顯著地把iPSCs的誘導效率提高超過100倍。在沒有c-Myc誘導的情況下，VPA聯(lián)合Oc t4、Sox2、Klf4因子誘導MEFs能顯著地把iPSCs的誘導效率提高50倍，甚至高于僅用OSKM 4因子的誘導效率[6]。其機制可能與VPA上調了胚胎干細胞特異性基因的表達有關。例如，Rex3和Zfp7基因在未分化的胚胎干細胞中表達，在未轉染的MEFs細胞中不表達，使用VPA處理已轉染的MEFs，Rex 3 、Zfp7基因表達上調超過20倍[6]。此外，VPA在僅有Oc t4、Klf4因子轉導的情況下也能提高iPSCs誘導效率[9]。另外一種非特異性組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c（Na B或SB）也常被用于提高再程序化效率。NaB可增強miR302/367簇啟動子中Oct4的轉錄活性從而提高miR302/367簇的轉錄水平，很大程度地促進人成纖維細胞再程序化產生iPSCs的過程[10]。3種組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA, VPA和SB中，SB能最顯著地提高再程序化效率。將pre-iPSCs暴露于SB，4種再程序化因子和細胞周期相關基因的表達相關性增加，能有效地促進部分再程序化的pre-iPSCs向完全再程序化的iPSCs轉變，顯著提高iPSCs誘導效率[11]。因此，調控相關基因特定位點組蛋白乙?；灿型蔀榇龠M體細胞再程序化的有效手段。

3.2 組蛋白甲基化 組蛋白甲基化通常發(fā)生在組蛋白H3、H4的賴氨酸（K）和精氨酸（R）殘基上，包括單甲基化、雙甲基化和三甲基化，受組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase，HMT）和組蛋白脫甲基酶（histone demethylase，HDM）調控。組蛋白甲基化對基因轉錄活性的影響取決于甲基化的位點和甲基原子團的數量，比如H3K9、H3K 27和H3K 79位點的甲基化發(fā)揮轉錄抑制作用，然而H3K 4位點的甲基化則有利于激活轉錄。體細胞多能性相關基因的啟動子區(qū)域多表現為H3K4去甲基化、H3K 27甲基化和H3K 9甲基化。胚胎干細胞無論是靠近啟動子區(qū)還是基因間區(qū)域，均呈現高密度H3K4me3單價鍵或 H3K 4me3、H3K 27me3二價鍵。在再程序化過程中，處于開放染色質狀態(tài)的基因被H3K 4me3或H3K 4me3、H3K27me3二價標記，沉默的基因只有H3K27me3標記。

多能干細胞的組蛋白修飾模式與胚胎干細胞相似而與體細胞相反，調控特定的組蛋白甲基化狀態(tài)形成可促進部分再程序化細胞發(fā)生完全再程序化。H3K 9位點甲基化是pre-iPSCs向iPSCs轉化的主要表觀遺傳障礙。目前報道的H3K 9轉移酶主要有：Setdb1、Ehmt2（G9a）和Suv39h1/2。敲除H3K 9甲基轉移酶Setdb1可促進preiPSCs進一步再程序化為iPSCs，提高iPSCs的誘導效率[12]。BIX01294是一種H3K 9甲基轉移酶G9a抑制劑，可通過抑制G9a而減少H3K9me2水平。在該抑制劑的共同作用下，Oc t4和Klf4兩種因子即可誘導MEFs發(fā)生再程序化[13]。另一種H3K 9甲基轉移酶SUV 39h1受到抑制同樣能有效地提高再程序化效率[14]。與H3K9位點相似，組蛋白H3K 27位點甲基化同樣可抑制轉錄，降低H3K27甲基化則有利于再程序化因子表達。EZH2是一種重要的H3K 27甲基轉移酶，磷酸化EZH2可使其活性受到抑制，從而降低H3K27甲基化水平，增加再程序化基因的表達，有利于提高再程序化效率[15]。然而，H3K27脫甲基酶，如Utx，可減少H3K 27甲基化水平，并通過與再程序化因子相互作用，在體細胞再程序化過程中發(fā)揮關鍵作用；缺少Utx則抑制再程序化中多能性基因重激活的過程，導致再程序化缺陷[16]。組蛋白上另一個與H3K27位點甲基化效果相似的位點是H3K 79。用sh RNA在再程序化早期抑制H3K 79甲基轉移酶（Dot1L），可致Nanog和Lin28因子表達增加，甚至替代Klf4和c-Myc 因子的作用，促進再程序化[14]。

與以上3個位點甲基化作用相反，H3K4位點的甲基化則有利于激活轉錄。KDM5B是一種H3K 4的脫甲基酶，降低H3K4位點甲基化水平，因而阻礙再程序化過程，減少iPSCs的誘導效率；抑制KDM5B則可提高Pou5f1、Tbx 3等胚胎干細胞特異性基因的啟動子H3K 4me3水平，從而提高iPSCs的誘導效率[17]。

4 染色質重塑對再程序化的促進作用

染色質重塑是指染色質位置和結構上發(fā)生的復雜變化過程，參與調節(jié)該過程的主要因子統(tǒng)稱為染色質重塑復合物，主要包括染色質共價修飾復合物（histonemodifying complex，HMC）和ATP 依賴的染色質重塑酶（ATP-dependent chromatin remodeling complex，ADCRC）。HMC包括對組蛋白的尾部進行乙?；⒓谆裙矁r修飾的相關酶類。ADCRC主要有三大家族：SWI/SNF、ISWI和 CHD（chromodomain helicase DNA-binding）。這些酶通過與組蛋白甲基化或乙酰化相關酶類的相互作用，利用ATP水解釋放出來的能量導致染色體結構變得疏松，使得轉錄因子在細胞再程序化過程中對DNA/染色質有可接近性，促進基因轉錄。在細胞分化過程中，染色質重塑導致染色質結構逐漸變得致密。體細胞再程序化過程中，染色質緊密程度下降從而向開放的染色質狀態(tài)改變，但局部的染色質重塑導致種系基因沉默及多能性相關基因激活。目前多個報道證實，通過調解ATP 依賴的染色質重塑酶可使染色質向開放狀態(tài)改變從而促進再程序化的過程。

SWI/SNF家族是目前研究較多的ATP 依賴的染色質重塑酶，它在體細胞再程序化和維持干細胞多能性中有著重要的作用。從分子水平上，SWI/SNF家族由BAF組成，BAF155和BRG1協(xié)同地促進DNA在多能性相關基因Oct4、Nanog、Rex1 啟動子的去甲基化，增強了再程序化因子在多能性基因啟動子的結合活性，從而促進了再程序化過程[18]。ISWI的作用方式則大為不同，通過動員核小體和控制分隔核小體的連接DNA的長度，保持核小體合適的間距來調控轉錄，從而影響再程序化效率[19]。CHD1對于維持胚胎干細胞多能性及維持其染色質開放狀態(tài)是必需的。通過調控多能基因的染色質開放程度促進再程序化。下調CHD1的表達可導致再程序化MEFs產生的iPSCs克隆的數量明顯減少，再程序化效率下降[20]。因此，染色質體結構的開放程度影響再程序化過程，染色質重塑酶類可作為提高再程序化效率的重要靶點。

5 miRNA調控提高再程序化效率

非編碼RNA（noncoding RNA，nc RNA），尤其是微小RNA（micro RNA, miRNA），作為一種重要的基因轉錄后調控因素，在再程序化過程中發(fā)揮的重要作用受到普遍關注。miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，通過沉默復合體降解靶mRNA而阻遏其表達。miRNA與細胞發(fā)育的時序調控有關，參與調控細胞發(fā)育、細胞增殖和凋亡等過程。最近，越來越多的研究表明，胚胎干細胞特異性的miRNA在維持iPSCs多能性的調節(jié)網絡中扮演著重要角色，能明顯提高再程序化效率[21-24]。

目前被報道較多的胚胎特異性miRNA主要有miR-302-367 簇，miR-371/290簇（miR-371存在于人的細胞中，鼠細胞中的同源是miR-290簇），以及miR-17–92 簇。在體細胞再程序化過程中，胚胎特異性miRNA能阻遏以細胞周期基因及多能性基因Oct4、 Nanog、 Sox2、 Klf4和Myc為靶向的轉錄抑制因子，促進多能性基因的表達及自我更新，并且能直接阻斷細胞分化相關基因的表達，阻礙細胞分化的過程，促進再程序化。報道證實，miR302/367能把人類成纖維細胞高效地再程序化形成一種多能性狀態(tài)，將近10%的細胞產生iPSCs克隆，比標準的OSKM因子誘導更有效率，并且不需要外源轉錄因子的參與[21]。此外，研究人員還通過誘導miR-302過度表達成功將人類毛囊細胞再程序化成iPSCs。目前認為，miR302可抑制4種表觀遺傳調節(jié)因子：AOF2 （又稱KDM1或or LSD1，通過使H3K4脫甲基化抑制基因轉錄）、 AOF1、 MECP1/2。以上甲基化調節(jié)酶酶類受到抑制后，可導致廣泛的DNA去甲基化和H3K4甲基化修飾，結果引起Oct3/4、Sox2和Nanog表達上調，這些因子又可進一步刺激miR302的表達，形成體細胞再程序化所需要的正反饋循環(huán)[22]。此外，研究還發(fā)現miR302簇的各個miRNA單獨作用時對再程序化效果均有不同程度的影響，如miR367為再程序化中激活內源性Oct4所必需。miR-302a、 miR-302b和miR-200c可顯著提高OSKM和Oc t4、Sox 2、Klf4誘導豬成纖維細胞的再程序化效率和縮短再程序化時間，并且發(fā)現Oct4、Sox 2、Klf4聯(lián)合 miR-302a、miR-302b 和 miR-200c誘導系統(tǒng)的誘導效率與OSKM 4因子誘導系統(tǒng)差別不大，推測這3個 miRNA 可以替代c-Myc的作用[23]。其他胚胎干細胞特異性miRNA簇也可以提高再程序化效率，例如miR-29b通過靶向結合Dnmt3a 和Dnmt3b促進iPSCs形成[24]。MEFs特異性miR-291-3p、 miR-294和miR-295可代替c-My c，提高Klf4、Oct4和 Sox2誘導體細胞去分化成為多能干細胞的效率。

此外，在誘導跨細胞系直接轉分化的再程序化中，miRNA也凸顯出其重要價值。最近，Lu等[25]用miR-302聯(lián)合表達Pdx 1、Ngn3、Maf A的質粒轉染人類肝細胞，隨后用培養(yǎng)成熟分泌胰島素的細胞的特定化學培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)，共轉染增加胰腺發(fā)育相關基因（Sox 17、 Fox a2和endogenous Pdx1）的表達，最終肝細胞被誘導成β樣細胞分泌胰島素，并且能生理性地根據葡萄糖變化釋放激素。因此，miRNA誘導的再程序化不僅效率較高，而且還可作為一種非病毒載體、非轉錄因子介導的誘導方法，為進一步提高再程序化效率的研究提供了思路。

6 結 語

越來越多的研究表明，表觀遺傳修飾在再程序化中扮演至關重要的角色。近年來，針對細胞分化和去分化過程中表觀遺傳調控機制的研究飛速進展，目前表觀遺傳修飾對再程序化的調控還存在缺乏特異性等問題，這都體現出目前我們對表觀遺傳學的認識還不夠完整。因此，還需更深入解析表觀修飾事件發(fā)生的順序、識別其中作用的因子、明確不同事件和不同因子之間的關系。

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