糖腎寧對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

鄒大威 高彥彬 劉迎新 耿建國(guó) 彭麒朕 龔慕辛 朱智耀 李嬌陽(yáng)楊鑫偉 王曉磊

·論著·

糖腎寧對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

鄒大威 高彥彬 劉迎新 耿建國(guó) 彭麒朕 龔慕辛 朱智耀 李嬌陽(yáng)楊鑫偉 王曉磊

目的 觀察糖腎寧對(duì)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎功能及腎組織降解酶系基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)蛋白及基因表達(dá)的影響。方法 采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型,隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組和糖腎寧組各20只,設(shè)立C57BL/6J小鼠20只為空白組;予通心絡(luò)及纈沙坦干預(yù)12周后,測(cè)定各組小鼠血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr),采用Western Blot、Realtime-PCR、免疫組化方法檢測(cè)MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)或定位及基因表達(dá)水平。結(jié)果 與空白組比較,模型組小鼠BUN、SCr均明顯升高(P＜0.05);腎組織TIMP-1蛋白及基因表達(dá)明顯升高、MMP-9蛋白及基因表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,糖腎寧組和纈沙坦組BUN、SCr均明顯降低(P＜0.05),腎組織TIMP-1蛋白及基因表達(dá)明顯降低、MMP-9蛋白及基因表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。結(jié)論 糖腎寧能夠保護(hù)自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎功能、延緩糖尿病腎病腎纖維化進(jìn)展,調(diào)控糖尿病腎病腎組織降解酶系可能是糖腎寧防治糖尿病腎病的作用機(jī)制之一。

糖尿病腎病; 糖腎寧; KK-Ay小鼠; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1

最近的研究報(bào)告表明中國(guó)成人糖尿病的發(fā)病率約為11.6%,約1.139億人;糖尿病前期的發(fā)病率約為 50.1%,約 4.934億人[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥,也是糖尿病患者致死致殘的主要原因。目前認(rèn)為DN的主要發(fā)病機(jī)制是糖代謝紊亂、糖基化終末產(chǎn)物增多,氧化應(yīng)激等因素導(dǎo)致相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄、靶蛋白的表達(dá)異常進(jìn)而引起的腎纖維化,主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)增生[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)是基質(zhì)金屬蛋白酶系的重要成員,在腎組織細(xì)胞外ECM合成和分解中起著重要的作用,若DN條件下腎組織二者表達(dá)失衡,則會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性的腎纖維化[3]。本課題采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立DN模型,探討糖腎寧是否通過調(diào)節(jié)腎組織降解酶系TIMP-1、MMP-9,抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積,保護(hù)腎功能、達(dá)到防治糖尿病腎病的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性KK-Ay小鼠60只,8周齡SPF級(jí)雄性 C57BL/6J小鼠20只,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2014-0004,均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 干預(yù)藥物與試劑

糖腎寧(配比:黃芪4份、葛根2份、川芎2份、大黃1份、金櫻子2份、倒扣草3份),由首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院制劑室制備成浸膏粉[4],纈沙坦膠囊(規(guī)格:80 mg/粒,lot.:X1448,北京諾華制藥有限公司)。

MMP-9抗體(Abcam,ab38898,WB用),TIMP-1抗體 (R&D,AF980),MMP-9抗體 (Abcam, ab137867,免疫組化用);TRIzol總RNA提取試劑[DP405-02,天根生化科技(北京)有限公司];肌酐測(cè)定試劑盒(lot.:143011,中生北控生物科技股份有限公司);尿素測(cè)定試劑盒(lot.:141141,中生北控生物科技股份有限公司)。兔超敏二步法檢測(cè)試劑盒(PV-9001,lot.:K155222C,中杉金橋);山羊超敏二步法檢測(cè)試劑盒(PV-9003,lot.:K145620B,中杉金橋)。

1.3 儀器

半自動(dòng)生化儀(URIT-810,桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司,中國(guó));電泳儀(DG-300C,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司,中國(guó));熒光定量PCR儀(ABI7500,Applied Biosystems);旋渦混合儀(XW-80A,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);生物顯微鏡(ECLIPSE 80i,Nikon,日本)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案

本實(shí)驗(yàn)采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型,C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照組小鼠,實(shí)驗(yàn)全程KK-Ay小鼠予以高脂飼料飲食誘發(fā)糖尿病腎病,C57BL/6J小鼠予以普通飼料喂養(yǎng)。8周齡KK-Ay小鼠予以高脂飼料飼養(yǎng)4周后,測(cè)定24小時(shí)尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER),與空白對(duì)照組C57BL/6J小鼠相比,24小時(shí)UAER明顯升高且血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病腎病模型建立成功。造模成功的KK-Ay小鼠隨機(jī)分為模型組20只(等量蒸餾水灌胃),纈沙坦組20只(10 mg/kg·d灌胃),糖腎寧組20只(生藥20 g/kg·d灌胃);空白對(duì)照組20只(等量蒸餾水灌胃),實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水,連續(xù)給藥12周。

1.5 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測(cè)

給藥12周末,各組小鼠禁食12小時(shí)于次日清晨處理。根據(jù)小鼠體質(zhì)量,用5%水合氯醛麻醉(0.1 mL/10 g),摘眼球取血,分離血清4℃保存待測(cè),采用苦味酸法測(cè)定血清肌酐,采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定血清尿素氮。取腎臟縱切,一半用于10%多聚甲醛固定、石臘包埋,用于后續(xù)Masson染色和免疫組化檢測(cè),一半用預(yù)冷的生理鹽水洗去血漬和雜質(zhì),取腎皮質(zhì)迅速放入液氮中保存,Western Blot方法檢測(cè)腎組織中MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)水平, Realtime-PCR方法檢測(cè)腎組織中MMP-9及TIMP-1 mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blot

將腎組織用滅菌的預(yù)冷的眼科剪刀分離,迅速放入勻漿器中勻漿,超聲粉碎,4℃離心后取上清, BCA法蛋白定量。每個(gè)樣品取相同總蛋白含量在10%SDS-PAGE膠上電泳分離,之后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(XLL092-2,PALL)。用5%脫脂奶粉封閉振蕩,一抗4℃孵育過夜,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,二抗孵育,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光,掃描膠片,用圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶。

1.7 實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Realitime-PCR)

采用TRIzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取,采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄,用ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行,采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。以下引物均在北京Invitrogen公司合成,具體如下:

1.8 免疫組化

按照常規(guī)免疫組化步驟進(jìn)行,制作石蠟切片,厚度4μm,微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),滴入3%H2O2滅活,10%血清封閉,加入一抗,4℃冰箱孵育一晚,烘箱37℃復(fù)溫60分鐘,0.01M PBS漂洗三次,滴入適當(dāng)二抗,烘箱37℃孵育,PBS漂洗三次,DAB染色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分態(tài)且方差齊,多重比較均采用LSD檢驗(yàn),以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖腎寧對(duì)腎功能的影響

24周齡時(shí),與空白組(CTL)相比,模型組(M)小鼠的BUN、SCr明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,纈沙坦(XST)、糖腎寧組(TSN)小鼠的BUN、SCr均有不同程度的降低(P＜0.05),各干預(yù)組組間比較無顯著差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖腎寧具有明顯的保護(hù)腎功能的作用。見表2。

表2 各組小鼠24周齡BUN、SCr的比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n BUN(mmol/L) SCr(umol/L) CTL 12 9.32±2.54 18.70±1.66 M 12 13.42±1.95a27.28±2.31aXST 12 10.95±1.69b23.69±2.03bTSN 12 10.68±1.65b24.14±2.50b

2.2 糖腎寧對(duì)糖尿病小鼠腎組織纖維化的影響

本實(shí)驗(yàn)采用Masson染色觀察糖腎寧對(duì)糖尿病小鼠腎組織纖維化的影響,Masson染色是觀察顯示組織中纖維的一種特殊染色方法,如圖所示綠染區(qū)為纖維成分,主要沉積在腎小球系膜區(qū)及腎間質(zhì)?？瞻捉M:腎組織形態(tài)大致正常,腎小管排列整齊,膠原沉積較少。模型組:腎小球肥大,腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)較模糊,呈空泡樣病變,腎小球系膜區(qū)及腎間質(zhì)膠原沉積較多。糖腎寧組及西藥組較模型組的腎纖維化程度有所減輕。見圖1。

2.3 Western Blot方法檢測(cè)糖腎寧對(duì)MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組相比,模型組腎組織MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織MMP-9蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與空白對(duì)照組相比,模型組腎組織TIMP-1表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織TIMP-1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 各組小鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1的蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n MMP-9/β-actin TIMP-1/β-actin CTL 4 1.98±0.14 1.29±0.16 M 4 1.16±0.10a2.95±0.14aXST 4 1.43±0.16b2.05±0.21bTSN 4 1.39±0.08b1.79±0.23b

2.4 Realtime-PCR方法檢測(cè)糖腎寧對(duì) MMP-9、TIMP-1基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

與空白對(duì)照組相比,模型組腎組織 MMP-9 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織MMP-9 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與空白對(duì)照組相比,模型組腎組織TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1mRNA表達(dá)的比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA CTL 5 1.05±0.05 1.03±0.04 M 5 0.21±0.05a4.33±0.26aXST 5 0.64±0.02b2.89±0.10bTSN 5 0.69±0.03b2.77±0.17b

2.5 免疫組化方法檢測(cè)糖腎寧對(duì)MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

如圖所示,棕黃色為MMP-9、TIMP-1陽(yáng)性染色區(qū),主要表達(dá)在腎小球,系膜區(qū)及腎小管?？瞻捉MC57小鼠MMP-9表達(dá)較多,TIMP-1表達(dá)較少,模型組KK-Ay小鼠MMP-9表達(dá)較少、TIMP-1表達(dá)較多,經(jīng)糖腎寧及纈沙坦治療后有所改善。這與Western blot及Realtime-PCR檢測(cè)MMP-9、TIMP-1蛋白和基因表達(dá)各組趨勢(shì)是一致的。見圖3、4。

3 討論

目前2型糖尿病腎病的建立,應(yīng)用較為廣泛的是高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)注射誘導(dǎo)2型DN動(dòng)物模型的建立,但不同動(dòng)物個(gè)體對(duì)STZ注射后胰腺損傷也具有個(gè)體差異,為疾病研究的準(zhǔn)確性帶來了干擾[5]。本實(shí)驗(yàn)的KK-Ay小鼠模型是在KK小鼠的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入黃色肥胖基因(Ay)而成,遺傳背景清楚,血糖在小鼠16周齡達(dá)到中高水平,持續(xù)穩(wěn)定,符合2型糖尿病動(dòng)物模型的特點(diǎn),且非常接近人類DN的臨床表型[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明12周齡KK-Ay小鼠的尿白蛋白及血糖均符合糖尿病腎病的成模標(biāo)準(zhǔn),說明模型建立成功。糖腎寧給藥12周后具有明顯的降低血清肌酐、尿素氮的作用,提示糖腎寧能夠保護(hù)2型糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎功能。

目前普遍認(rèn)為糖尿病腎病是糖代謝紊亂,血流動(dòng)力學(xué)異常,氧化應(yīng)激,細(xì)胞因子多種因素綜合作用的結(jié)果[7]。其主要的病理特征是ECM在腎小球及腎間質(zhì)的沉積,最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化,因此ECM降解系統(tǒng)與糖尿病腎病密切相關(guān)。MMPS/TIMPS是參與ECM降解過程的重要酶系,其中MMP-9為相對(duì)分子質(zhì)量為92000的明膠酶,是腎臟表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員,可降解多種ECM組分(Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅵ型膠原及纖維連接蛋白等)。TIMP-1是體內(nèi)存在和作用最廣泛的一種TIMPs,在腎臟主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞,是MMP-9的特異性抑制物[8]。高糖條件下,腎臟固有細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞合成的多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子自分泌及旁分泌的方式發(fā)揮其作用,最終導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)增生,導(dǎo)致DN的發(fā)生。而細(xì)胞因子(如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)可通過影響腎臟MMP-9及TIMP-1的表達(dá)和活化,引起MMP-9表達(dá)下降,TIMP-1表達(dá)升高,導(dǎo)致ECM合成及降解失衡[9-10]。研究表明糖尿病大鼠模型的MMP-9的蛋白表達(dá)水平隨著DN進(jìn)展明顯下調(diào)[11]。

本研究結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠腎組織 MMP-9蛋白及基因表達(dá)明顯降低, TIMP-1蛋白及基因表達(dá)明顯升高,DN小鼠腎組織ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1失衡,勢(shì)必導(dǎo)致ECM沉積增加,Masson染色顯示腎小球系膜區(qū)及腎間質(zhì)膠原沉積較多。經(jīng)糖腎寧治療后DN小鼠腎組織MMP-9/TIMP-1失衡有所改善,腎臟病理亦有明顯改善。提示糖腎寧能夠通過調(diào)控ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1,抑制DN小鼠腎組織腎纖維化,延緩DN進(jìn)展。

本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為糖尿病腎病日久出現(xiàn)的腎系并發(fā)癥,病位在腎,繼發(fā)于消渴病,因此稱為消渴病腎病[12]。糖尿病腎病的基本病理改變是腎之絡(luò)脈結(jié)構(gòu)損傷,導(dǎo)致腎功能失常,糖腎寧是在通絡(luò)原則指導(dǎo)下結(jié)合老師多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立的方劑,主要由黃芪、金櫻子、川芎、大黃等組成,方中黃芪益氣扶正,金櫻子固精縮尿,大黃逐瘀清熱降濁,川芎活血化瘀通絡(luò)。前期臨床研究[13]表明糖腎寧可明顯降低DN患者尿白蛋白、保護(hù)腎功能,安全有效。中藥藥理研究表明黃芪通過免疫調(diào)節(jié)、降低尿蛋白、調(diào)節(jié)血糖血脂、改善腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常及抗纖維化等作用共同參與了腎臟保護(hù)機(jī)制[14];金櫻子具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)腎臟等作用[15];大黃具有保護(hù)腎功能的作用[16];川芎能夠抑制腎細(xì)胞凋亡,保護(hù)腎臟[17]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示中藥復(fù)方糖腎寧具有防治糖尿病腎病,保護(hù)腎功能的作用,其機(jī)制與通過調(diào)控ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1蛋白及基因表達(dá),減少腎組織ECM沉積,抑制腎纖維化有關(guān),但是否通過其他機(jī)制防治糖尿病腎病的進(jìn)展尚需進(jìn)一步的研究。

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Effects of Tangshenning on MMP-9、TIMP-1 expression of renal tissue in type 2 diabetic KK-aym ice

ZOU Da-wei,GAO Yan-bin,LIU Ying-xin,et al. Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine& Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research,Beijing 100069,China

GAO Yan-bin,E-mail:dfyynfm@163.com

Objective To explore effects of Tangshenning on expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)、tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1)in diabetic nephropathy micemodel.M ethods Diabetic male KK-Ay mice were randomLy divided into three groups:themodel group(n=20),the valsartan group(n=20)and the Tangshenning group(n=20).Male C57BL/6J (n=20)mice were designed as the control group.After intervention with Tangshenning and valsartan for12 weeks,serum creatinine(Scr)and serum urea nitrogen(BUN)were examined.Expression of MMP-9, TIMP-1 were accessed by Realtime-Pcr,Western Blot and Immunohistochemistry.Results Comparedwith control group,BUN and SCr were significantly increased(P＜0.05),while them ofmice in valsartan and tangshenning group were decreased compared withmodel group(P＜0.05).Compared with the control group,the protein and gene expression ofMMP9 and TIMP-1 both have the same trend inmodel group,the expression of MMP9 were decreased significantly and the expression of TIMP-1 were increased significantly (P＜0.05).Through the treatment of Tangshenning and valsartan for 12 weeks,the expression of TIMP-1 were down-regulated and the expression of MMP-9 were up-regulated in diabeticKK-Ay mice(P＜0.05). Conclusion Tangshenning could protect renal function and delay the process of renal fibrosis partly through regulating extracellularmatrix degradation enzymes MMP-9/TIMP-1 expression.

Diabetic nephropathy; Tangshenning; KK-Aymice; Matrixmetalloproteinase-9; Tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.013

2015-08-15)

(本文編輯:蒲曉田)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81302951);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (2012CB518602)

100069 北京,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[鄒大威、高彥彬、劉迎新(碩士研究生)、耿建國(guó)、彭麒朕(碩士研究生)、龔慕辛、朱智耀、李嬌陽(yáng)(碩士研究生)、楊鑫偉(博士研究生)、王曉磊(碩士研究生)];中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(鄒大威、高彥彬、劉迎新、耿建國(guó)、彭麒朕、朱智耀、李嬌陽(yáng)、楊鑫偉、王曉磊)

鄒大威(1982-),女,博士,講師,主治醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥防治糖尿病研究。E-mail: taotaosweety@163.com

高彥彬(1960-),博士,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師。研究方向:中醫(yī)藥防治糖尿病研究。E-mail: dfyynfm@163.com