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    基于“二維特征鑒別法”的巴西草藥TANCHAGEM真?zhèn)舞b別

    2015-03-26 08:31:06徐文英馬愷悅馮孟鑫顧選李妍芃趙百孝劉春生馬長(zhǎng)華韓麗
    環(huán)球中醫(yī)藥 2015年11期
    關(guān)鍵詞:車(chē)前草大車(chē)草藥

    徐文英 馬愷悅 馮孟鑫 顧選 李妍芃 趙百孝 劉春生 馬長(zhǎng)華 韓麗

    車(chē)前草為車(chē)前科Plantaginaceae植物車(chē)前Plantago asiatica L.或平車(chē)前Plantago depressa wild.的干燥全草,是2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)收載的常用中藥。車(chē)前草性寒,味甘,具有清熱利尿、祛痰、涼血、解毒之功效,用于水腫尿少、暑濕瀉痢、痰熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥[1]。TANCHAGEM為巴西的常用草藥,根據(jù)《葡漢詞典》[2],TANCHAGEM 在葡萄牙語(yǔ)中意為車(chē)前草,其藥物性狀與功能主治也與中藥車(chē)前草類似,但由于巴西各地區(qū)間發(fā)展不平衡,其民族藥的研究開(kāi)發(fā)往往存在缺少文獻(xiàn)記載、品種混亂、基原不清、品質(zhì)不詳?shù)痊F(xiàn)象[3]。因此,為解決上述質(zhì)量控制中存在的問(wèn)題,本課題組對(duì)巴西草藥TANCHAGEM進(jìn)行全面的質(zhì)量研究,提出了一種新型研究思路“二維特征鑒別法”,即從藥物本身的化學(xué)特征和遺傳學(xué)特征兩方面入手,先采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)藥物的基原進(jìn)行確定,解決“真?zhèn)螁?wèn)題”;再通過(guò)HPLC技術(shù)對(duì)藥物的化學(xué)信息進(jìn)行檢測(cè),解決“優(yōu)劣問(wèn)題”。

    首先采用DNA條形碼技術(shù)并利用ContigExpress軟件,檢索NCBI中注冊(cè)的與巴西草藥相似度最高的物種,以相似度97%以上為物種溯源依據(jù),確定其基原。其次以車(chē)前草的專屬性成分大車(chē)前苷為其指標(biāo)成分,利用HPLC法比較巴西草藥TANCHAGEM與中藥車(chē)前草中大車(chē)前苷的含量,綜合兩者結(jié)果為巴西草藥TANCHAGEM及相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供科學(xué)依據(jù)[4-10]。

    1 材料與儀器

    1.1 材料

    藥材:巴西草藥TANCHAGEM三份(巴西隆城市場(chǎng)),樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室;中藥車(chē)前草(北京市花家地南里同仁堂藥店,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為車(chē)前科植物車(chē)前Plantago asiatica L.的干燥全草),大車(chē)前苷(中國(guó)藥品生物制品鑒定所,批號(hào):111833-201102)。試劑:乙腈(色譜純,F(xiàn)isher),甲醇(色譜純,F(xiàn)isher),娃哈哈純凈水,液氮。

    1.2 儀器

    植物DNA提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號(hào):69691125)、TProfessiona型PCR擴(kuò)增儀(德國(guó) Biometra公司,批號(hào):20092237)、ContigExpress軟件、FW400A高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、Waters 1525高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、Breeze 2 HPLC色譜工作站,Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器、Waters 2707自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 038040柱溫箱、資生堂 C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm)。

    2 方法與結(jié)果

    采用DNA條形碼技術(shù)及HPLC技術(shù)對(duì)巴西草藥TANCHAGEM以及中藥車(chē)前草進(jìn)行檢測(cè)分析。

    2.1 DNA 條形碼分析

    2.1.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 取巴西樣品,一式三份,分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉,采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物,上游 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3';下游 P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',在 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,引物 P1和 P4各加2.5 μL(5 μmol/L),DNA 模板 4 μL,ddH2O16 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性1分鐘,55℃退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,40個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,在紫外燈下檢視,產(chǎn)物均由上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序,以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

    圖1 TANCHAGEM的性狀圖

    2.1.2 序列分析方法 利用ContigExpress軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,根據(jù)NCBI中BLAST功能,檢索NCBI中注冊(cè)的相似度最高的物種,按照相似度最高的物種截取ITS全長(zhǎng)。以相似度90%以上為屬的溯源依據(jù),以相似度97%以上為物種溯源依據(jù),獲得溯源結(jié)果。

    2.2 特征圖譜分析

    2.2.1 對(duì)照品及供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備 取大車(chē)前苷對(duì)照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液,即得。取樣品粉末(60目)1 g,一式三份,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入60%甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30分鐘,放冷,再稱定重量,用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

    2.2.2 色譜條件 色譜柱:資生堂C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -0.1%甲酸溶液(17:83);檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:30℃。

    2.2.3 專屬性考察 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及各供試品溶液,分別精密吸取對(duì)照品溶液或供試品溶液10μL,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,各色譜圖見(jiàn)圖2。如圖所示,測(cè)定方法專屬性好,待測(cè)成分與其它成分分離度大于1.5,且其他成分對(duì)待測(cè)成分測(cè)定無(wú)干擾。

    圖2 對(duì)照品溶液及各供試品溶液的HPLC圖

    2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面。以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=1445396276687.18X - 182497.06,R2=0.9989。結(jié)果表明,大車(chē)前苷在0.1014~4.056 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.2.5 精密度考察 取大車(chē)前苷對(duì)照品適量,精密稱定,置棕色量瓶中,加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10μL,記錄峰面積。RSD為1.10%,符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定,本法精密度良好。

    2.2.6 穩(wěn)定性考察 取中國(guó)車(chē)前草樣品,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12 小時(shí),在上述色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積。RSD為2.00%,符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定,本法穩(wěn)定性良好。2.2.7 重復(fù)性考察 取中國(guó)車(chē)前草樣品,一式6份,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算 RSD值。RSD為1.60%,符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定,表明本法重復(fù)性良好。

    2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份中國(guó)車(chē)前草樣品,每份約0.5 g,精密稱定,分別精密加入一定量的大車(chē)前苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算回收率與RSD。結(jié)果表明大車(chē)前苷的平均回收率為105.8%,RSD為2.00%,均符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定,表明本法含量測(cè)定結(jié)果良好。見(jiàn)表1。

    2.3 結(jié)果

    2.3.1 DNA條形碼結(jié)果 3份巴西樣品測(cè)序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)BLAST檢索,樣品與車(chē)前科車(chē)前屬植物相似度最高,相似度范圍為96~99%,因此巴西草藥TANCHAGEM來(lái)自車(chē)前科車(chē)前屬Plantago L.植物。根據(jù)DNA條形碼相似度達(dá)到99%以上的溯源指標(biāo),Plantago myosuros、Plantago australis、Plantago virginica、Plantago uniglumis、Plantago trinitatis、Plantago asiatica可能為巴西草藥TANCHAGEM的基原。見(jiàn)圖3~4。2.3.2 大車(chē)前苷含量測(cè)定結(jié)果 分別取巴西草藥TANCHAGEM、中藥車(chē)前草約1 g,精密稱定,一式三份,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算待測(cè)成分含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表1 中國(guó)車(chē)前草中大車(chē)前苷的加樣回收率結(jié)果

    圖3 巴西樣品TANCHAGEM的ITS片段圖

    圖4 巴西樣品TANCHAGEM的ITS序列BLAST結(jié)果

    表2 巴西草藥TANCHAGEM、中國(guó)車(chē)前草中大車(chē)前苷的含量(n=3)

    巴西樣品TANCHAGEM與中藥車(chē)前草的特征性譜圖相似度極高,且兩者均含有2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定的車(chē)前草指標(biāo)成分大車(chē)前苷,巴西車(chē)前草中大車(chē)前苷含量為0.1025%,中藥車(chē)前草中含量為0.1030%,兩者含量接近,均符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定。巴西草藥TANCHAGEM內(nèi)控指標(biāo)符合要求,品質(zhì)優(yōu)良。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用“二維特征鑒別法”,利用中藥DNA條形碼的遺傳學(xué)唯一特性,以及中藥指標(biāo)性成分可量化的特點(diǎn),對(duì)未知樣品按照先“真?zhèn)巍痹佟皟?yōu)劣”的研究思路進(jìn)行質(zhì)量控制,該法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品基原、指標(biāo)性成分以及相應(yīng)HPLC圖譜的綜合控制,相較于僅考察單一指標(biāo)的傳統(tǒng)質(zhì)控方法,“二維特征鑒別法”能更為全面的反應(yīng)樣品信息。

    綜上所述,巴西樣品TANCHAGEM為車(chē)前科車(chē)前屬Plantago L.植物,其HPLC圖譜與中藥車(chē)前草相似度極高,且所含大車(chē)前苷含量符合2010年版《中華人民共和國(guó)》(一部)規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)為下一步是否擴(kuò)大樣本量進(jìn)行采摘和研究巴西車(chē)前草提供了參考依據(jù),同時(shí)也為巴西車(chē)前草的質(zhì)量研究、藥用價(jià)值研究、是否引種巴西車(chē)前草以及擴(kuò)大中藥資源和應(yīng)用等方面提供了重要依據(jù)。

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