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    基于“二維特征鑒別法”的巴西草藥GENGIBRE真?zhèn)舞b別

    2015-03-26 08:31:06徐文英馬愷悅馮孟鑫顧選李妍芃趙百孝劉春生馬長華韓麗
    環(huán)球中醫(yī)藥 2015年11期
    關(guān)鍵詞:姜辣素干姜草藥

    徐文英 馬愷悅 馮孟鑫 顧選 李妍芃 趙百孝 劉春生 馬長華 韓麗

    干姜為姜科植物Zingiber offcinale Rosc.的干燥根莖[1],收載于2010年版《中華人民共和國藥典》(一部),在中國及巴西均是藥食兩用的常用藥材,具有溫中散寒,回陽通脈,溫肺化飲等功效,可用于脘腹冷痛,嘔吐泄瀉,肢冷脈微,寒飲喘咳。根據(jù)《葡漢詞典》[2],巴西草藥GENGIBRE在葡萄牙語中意為姜,在國外作為調(diào)味品及辛香料被廣泛使用,與中國干姜的食用價(jià)值非常類似。為擴(kuò)大中國干姜的藥用資源,本文擬從基因鑒別與化學(xué)成分鑒別相結(jié)合的角度對巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行真?zhèn)舞b別及品種鑒定。

    DNA條形碼技術(shù)是目前中藥真?zhèn)舞b別及準(zhǔn)確物種鑒定可靠的技術(shù)和方法,本研究擬對以巴西草藥GENGIBRE的ITS序列進(jìn)行DNA測序,作為基因鑒別結(jié)果。此外,中藥干姜中所含 6-姜辣素(6-Gingerol)為其辛辣物質(zhì),具有強(qiáng)心、降血壓、降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎止痛等廣泛的藥理作用,其含量直接影響干姜的品質(zhì)和藥效。因此,選用6-姜辣素為指標(biāo)對兩者進(jìn)行化學(xué)成分鑒別。通過巴西草藥GENGIBRE與中國干姜中6-姜辣素的含量差異,結(jié)合兩者的DNA條形碼匹配度結(jié)果,為巴西草藥GENGIBRE的品質(zhì)鑒定及擴(kuò)大中國干姜的藥用資源提供理論依據(jù)[3-11]。

    1 材料與儀器

    1.1 材料

    藥材:巴西草藥GENGIBRE 3份(巴西隆城市場,樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室)、中國干姜(北京市花家地南里同仁堂藥店,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖)、6-姜辣素(中國藥品生物制品鑒定所,批號:111833-201102);試劑:乙腈(色譜純,F(xiàn)isher)、甲醇(色譜純,F(xiàn)isher)、娃哈哈純凈水、液氮。

    1.2 儀器

    植物DNA提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號:69691125)、TProfessiona型PCR擴(kuò)增儀(德國 Biometra公司,批號:20092237)、ContigExpress軟件。

    島津LC-20AT液相色譜儀(日本島津公司)、水浴鍋、粉碎機(jī)(型號:FW-100,北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、電子天平sartorius AG BS110S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、XBrige C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm,美國 Waters公司)、FW400A高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)、Sartorius BS110S分析天平、KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

    2 方法與結(jié)果

    采用DNA條形碼技術(shù)和HPLC技術(shù)對巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行真?zhèn)舞b別分析。即先根據(jù)樣品的遺傳信息確定其基源,結(jié)合指標(biāo)性成分的含量高低或存在與否,相互印證得出結(jié)論。

    2.1 DNA條形碼分析

    2.1.1 DNA提取 樣品經(jīng)乙醇消毒后,取每份樣品加液氮研磨成細(xì)粉,用博邁德DNA提取試劑盒提取,按照說明書提取總DNA,取5μL 1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

    2.1.2 ITS序列的擴(kuò)增 采用擴(kuò)增ITS序列的通用引物,ITS上游引物 P1:5'-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3';ITS下游引物P4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行,50μL反應(yīng)體系中含模板2.5μL,Tap Mix酶25μL,引物 P1 2.5 μL,引物 P4 2.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5分鐘;94℃變性50秒;55℃退火50秒;72℃延伸1分鐘;35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。

    2.1.3 測序 PCR產(chǎn)物在紫外燈下從1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行切膠,由上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序,以保證測序的準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示,PCR產(chǎn)物電泳在750 bp左右出現(xiàn)單一、清晰且明亮的條帶。3份樣品的測序峰圖良好,測序結(jié)果一致,截取ITS片段后選擇一條序列用于后續(xù)分析。

    圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

    2.1.4 序列分析 利用contig1軟件對測序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,根據(jù)BLAST所獲相似度最高物種的ITS序列邊界,截取待鑒定物種的ITS序列,對截取后待鑒定樣品的ITS序列進(jìn)行檢索,綜合考慮Score值、Coverage值、evalue值,初步確定相似度最高的物種為待鑒定樣品的基原。結(jié)果如圖2所示。圖2表明,樣品與蕓香科吳茱萸植物相似度最高,相似度范圍為97% ~99%,因此初步鑒定該樣品來自蕓香科吳茱萸Tetradium ruticarpum。

    2.2 HPLC 法分析

    2.2.1 對照品及供試品溶液的制備 對照品溶液制備:取 6-姜辣素對照品,精密稱定,配制成0.1014 mg/mL的對照品溶液,使用前0.45μm微孔濾膜過濾,即得。

    圖2 巴西樣品GENGIBRE的ITS序列BLAST結(jié)果

    表1 中國干姜6-姜辣素的加樣回收率結(jié)果

    圖3 對照品溶液及各供試品溶液的HPLC圖譜

    供試品溶液制備:取各樣品粉末0.8 g(粉碎機(jī)粉碎,過80目篩),置50 mL錐形瓶中,準(zhǔn)確移取甲醇25 mL加入,準(zhǔn)確稱量,水浴加熱回流30分鐘,放冷至常溫,甲醇補(bǔ)重,搖勻,過濾,續(xù)濾液0.45μm微孔濾膜過濾,即得。

    2.2.2 色譜條件 色譜柱:XBrige C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm,美國 Waters公司),流動相:0 ~20 分鐘:乙腈 -水(45:55),流速:1.0 mL/分鐘,進(jìn)樣量:10μL,柱溫:30℃,檢測波長:280 nm。

    2.2.3 專屬性考察 按”2.2.1”項(xiàng)下方法制備對照品溶液及各供試品溶液,分別精密吸取對照品及各樣品供試溶液10μL,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,各色譜圖見圖3。如圖所示,測定方法專屬性好,待測成分與其他成分分離度大于1.5,且其他成分對待測成分測定無干擾。

    2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取”2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液 1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL,按”2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積。線性方程為 Y=737357X -34852,R2為0.9999,結(jié)果表明6-姜辣素在0.1014~4.056μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.2.5 精密度考察 精密稱定中國干姜樣品0.8 g,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣10μL,記錄峰面積。結(jié)果顯示,RSD為0.45%,表明本法精密度良好。

    2.2.6 穩(wěn)定性考察 精密稱定中國干姜樣品0.8 g,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于室溫放置0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí),按”2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積。結(jié)果顯示,RSD為1.07%,表明本法穩(wěn)定性良好。

    2.2.7 重現(xiàn)性考察 精密稱定中國干姜樣品0.8 g,一式 6 份,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示,RSD為1.05%,表明本法重復(fù)性良好。

    2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份中國干姜樣品,每份約0.4 g,精密稱定,分別精密加入一定量的6-姜辣素標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積,計(jì)算回收率與RSD,6-姜辣素的平均回收率為103.5%,RSD為2.34%,表明本法含量測定結(jié)果良好。結(jié)果見表1。

    2.3 6-姜辣素的含量測定結(jié)果

    分別取巴西草藥GENGIBRE、中國干姜約0.8g,精密稱定,一式3份,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按”2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積,計(jì)算待測成分含量,巴西草藥、中國干姜中6-姜辣素含量分別為0.112%和0.759%。結(jié)果見表2。

    表2 巴西草藥GENGIBRE、中國干姜中6-姜辣素的含量(n=3)

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)采用“二維特征鑒別法”,對未知巴西草藥GENGIBRE進(jìn)行以中國干姜為標(biāo)準(zhǔn)的定向真?zhèn)舞b別。其一借助中藥DNA條形碼技術(shù),對樣本進(jìn)行基原判別;其二利用HPLC技術(shù)對樣品與定向鑒別品種中指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。最終將所得判別結(jié)果與含量測定結(jié)果進(jìn)行相互比對,綜合評判樣品真?zhèn)?。由DNA條形碼技術(shù)結(jié)果可知巴西草藥GENGIBRE與蕓香科植物吳茱萸相似度最高,相似度范圍在97%~99%,因此初步鑒定該樣品來自蕓香科吳茱萸Tetradium ruticarpum。由HPLC法測定干姜中活性成分6-姜辣素含量結(jié)果可知,兩者均含有6-姜辣素,含量分別為0.112%和0.761%。巴西樣品GENGIBRE中6-姜辣素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)0.60%,而中國干姜樣品品質(zhì)良好。綜合兩者結(jié)果可知,僅從化學(xué)成分角度進(jìn)行真?zhèn)舞b別易出現(xiàn)假陽性,而僅從基因角度鑒別無法得知樣品品質(zhì)。因此,本實(shí)驗(yàn)利用兩種方法結(jié)合比較,從而對未知樣品進(jìn)行“真?zhèn)蝺?yōu)劣”的全面鑒別。

    另外,本實(shí)驗(yàn)對巴西藥草GENGIBRE中6-姜辣素含量測定時(shí)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,可能是由于吳茱萸的炮制方法中包含姜制法。因此,在進(jìn)行干姜的真?zhèn)舞b別時(shí),若干姜樣品粉末中摻雜姜制吳茱萸粉末,則僅依據(jù)HPLC圖譜中6-姜辣素峰的有無無法判定未知樣品是否為干姜,還需要額外的判別指標(biāo)進(jìn)行印證。本文采用的“二維特征鑒別法”為中藥的質(zhì)量控制、資源普查、新品種選育等方面的研究提供了新的思路,具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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