• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的巴西牛至屬植物藥HORTELA基原鑒定研究

    2015-03-20 08:56:48余春霞臧藝玫顧選吳浩忠馬長(zhǎng)華韓麗劉春生趙百孝
    環(huán)球中醫(yī)藥 2015年11期
    關(guān)鍵詞:植物藥基原條形碼

    余春霞 臧藝玫 顧選 吳浩忠 馬長(zhǎng)華 韓麗 劉春生 趙百孝

    ·巴西草藥研究專題·

    基于性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的巴西牛至屬植物藥HORTELA基原鑒定研究

    余春霞 臧藝玫 顧選 吳浩忠 馬長(zhǎng)華 韓麗 劉春生 趙百孝

    目的 利用性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對(duì)巴西牛至屬植物藥HORTELA進(jìn)行基原鑒定研究。方法 應(yīng)用性狀鑒定的方法初步對(duì)藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別;再應(yīng)用顯微鑒定的方法驗(yàn)證性狀鑒定結(jié)果;最后提取樣品DNA,擴(kuò)增ITS序列,利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST功能分析相似度,對(duì)樣品品種進(jìn)行DNA條形碼鑒定。結(jié)果 性狀—顯微—DNA條形碼綜合分析結(jié)果表明,該樣品為牛至屬植物Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.的干燥地上部分。結(jié)論 HORTELA可能為多基原植物類藥材,其來(lái)源為牛至屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.和薄荷屬M(fèi)entha rotundifolia(Linn.)Huds.干燥地上部分。

    牛至屬; 基原鑒定; DNA條形碼

    巴西草藥HORTELA是巴西民族的常用藥,作者在巴西市場(chǎng)收集藥材樣本時(shí)發(fā)現(xiàn),HORTELA被人們當(dāng)做圓葉薄荷Mentha Rotundifolia(又稱為Menthasuaveolens)出售及使用,但初步觀察其性狀與圓葉薄荷并不完全相同,因此有必要對(duì)該藥材進(jìn)行基原鑒定研究。

    傳統(tǒng)的植物藥鑒定有性狀鑒定和顯微鑒定等,二者的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、易行,不足之處是其主觀性較強(qiáng),且對(duì)屬內(nèi)近緣種藥材的鑒別能力較差[1-2]。DNA條形碼鑒定技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、客觀優(yōu)點(diǎn)[3-4],其中內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列應(yīng)用最為廣泛[5-6]。本文提出性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對(duì)植物藥進(jìn)行鑒定,首先通過(guò)性狀鑒定初步對(duì)藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別,再用顯微鑒定的方法驗(yàn)證性狀鑒定結(jié)果,然后應(yīng)用DNA條形碼鑒定的方法,利用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的ITS序列進(jìn)行相似度分析,確定待測(cè)樣品的品種。

    本實(shí)驗(yàn)擬采用性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的方法對(duì)巴西植物藥HORTELA進(jìn)行基原鑒定,為保證其質(zhì)量及安全用藥提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    HORTELA藥材10份,每份200 g,2012年4月購(gòu)買于巴西隆城市場(chǎng)藥材集散地。樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室。

    1.2 試劑

    廣譜植物基因組 DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司,批號(hào):69632855);rTaq酶(上海生工生物工程有限公司,批號(hào):695672BE);乙醇(北京化工廠,批號(hào):1124120381060079);瓊脂糖(BIOWEST,批號(hào):142045);ddH2O等。

    1.3 儀器

    顯微鏡(OLYMPUSCX-21,中國(guó));SY-601超級(jí)恒溫水浴(天津歐諾儀器儀表有限公司);L-901渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); JA1103N千分之一精密電子天平;SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司);TECHNE TC-3000PCR擴(kuò)增儀;Bio-Rad電泳儀;水平電泳槽(北京六一儀器廠);JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司);GRANT制冰機(jī);超純水制備系統(tǒng);KQ5200E型超聲波清洗器;SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司);DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)等。

    1.3 基于性狀的鑒定方法

    對(duì)HORTELA樣品通過(guò)眼觀、手摸、鼻聞、口嘗等方法觀察其形狀、大小、顏色、表面特征、質(zhì)地、折斷面等的性狀特征。

    1.4 基于顯微的鑒定方法

    每份樣品取30 mg研磨至粉末,取粉末少許,置載玻片上,滴加水合氯醛液,在小火上微微加熱透化,加熱時(shí)需續(xù)加水合氯醛液至透化清晰為度。為避免放冷后析出水合氯醛結(jié)晶,可在透化后加稀甘油少許,再加蓋玻片。在顯微鏡下觀察其顯微特征。

    1.5 基于ITS序列的DNA條形碼鑒定方法

    取10份樣品,觀察形態(tài),形態(tài)結(jié)果一致。每份樣品取40 mg進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉,按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒操作步驟提取樣品DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度及完整性。采用ITS序列通用引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,ITS-R:5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3',ITS-F:5'-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3'。PCR擴(kuò)增條件: 50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,ITS-R (5μmol/L)2.5μL,ITS-F(5μmol/L)2.5μL, DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5分鐘,94℃ 變性1分鐘,56℃ 退火1分鐘,72℃ 延伸1分鐘,35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),條帶單一明亮者即擴(kuò)增成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序部測(cè)序。各樣品均采用正向和反向測(cè)序,以保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。

    利用ContigExpress軟件對(duì)測(cè)序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接,以TCGA/T和GACCC/TC作為ITS序列邊界截取ITS序列,然后利用相似度法分析序列。

    根據(jù) NCBI中相似度搜索法(basic local alignment search tool,BLAST)功能,檢索樣品的ITS序列,本文以相似度90%以上為屬的鑒定依據(jù),以相似度97%以上的最高相似度物種為物種鑒定依據(jù),獲得鑒定結(jié)果。若BLAST比對(duì)后得到的序列相似度均在97%以下,則認(rèn)為數(shù)據(jù)庫(kù)中可能未注冊(cè)該序列,此時(shí),根據(jù)“基于ITS序列的鑒定方法”僅能鑒定到屬水平;該屬中未注冊(cè)序列的物種可能為鑒定結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 性狀鑒定結(jié)果

    本樣品葉多皺縮卷曲,完全展平后呈闊卵形或闊橢圓形,有的為小碎末。長(zhǎng)0.5~1.2 cm,寬0.3~1.2 cm。表面棕褐色或棕綠色,有1 mm左右的白色柔毛;葉背面棕灰色,柔毛較少,可見(jiàn)棕色小點(diǎn)密集,葉脈明顯。葉端漸尖或鈍形,基部截斜,全緣,有短葉柄。有特殊的清涼香氣,味辛辣。莖呈方形,直徑1 mm左右,褐色或棕黃色。葉對(duì)生,節(jié)略膨大。皮部易于木部分離,表面光滑。斷面黃白色,髓中空。質(zhì)脆。有特殊的清涼香氣,味酸、澀、微苦。見(jiàn)圖1。

    參考《中國(guó)植物志》的記載,可知本樣品與圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds.的葉片大小、葉片邊緣鋸齒等性狀特征均不相符合,樣品與牛至屬Origanum植物性狀特征較為符合,但由于鑒定者經(jīng)驗(yàn)有限,暫不能根據(jù)其性狀對(duì)該樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

    2.2 顯微鑒定結(jié)果

    本品粉末呈棕黃色,其顯微特征如下:薄壁細(xì)胞呈多角形;多為梯紋導(dǎo)管,有時(shí)可見(jiàn)螺紋導(dǎo)管;腺鱗頭部8個(gè)細(xì)胞,柄部為單細(xì)胞;氣孔直軸式;纖維成束。見(jiàn)圖2。

    由于顯微特征專屬性不強(qiáng),且缺少參考資料,無(wú)法根據(jù)顯微特征對(duì)該樣品基原進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

    2.3 DNA條形碼鑒定結(jié)果

    10份樣品的測(cè)序峰圖良好,測(cè)序結(jié)果一致,選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段后,經(jīng)BLAST分析,樣品ITS序列與牛至屬植物Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.(GU381465.1)、Origanum vulgare(GU381469.1)、Origanum dictamnus (GU381464.1)、Origanum majoranae(JX162835.1)、Origanum rotundifolium(GU381463.1)、Origanum scabrum(EU252138.1)、Origanum syriacum(JX163036.1)、Origanum virens(EU252126.1)、Origanum dayi (GU381466.1)、Origanum onites(JX162994.1)相似度在97%以上,其中,與Origanum elongatum(Bonnet) Emb.&Maire.(GU381465.1)的得分和相似度最高,達(dá)到99%。而樣品ITS序列與薄荷屬圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds(AF369161.1)的相似度為83.76%,遠(yuǎn)低于與牛至屬物種相似度。

    根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù),由于樣品與 Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.(GU381465.1)序列相似度為99%,且該物種在巴西分布[7]。因此,鑒定該樣品為Origanum elongatum(Bonnet)Emb.& Maire.,但目前暫無(wú)其性狀及顯微鑒定參考依據(jù)。

    3 討論

    性狀—顯微—DNA條形碼聯(lián)用的鑒定技術(shù)適用于無(wú)背景信息或背景信息不準(zhǔn)確的植物藥基原鑒定研究。第一步依據(jù)鑒定者的經(jīng)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行性狀鑒定,該方法經(jīng)濟(jì)、快速,可鑒別出性狀特征明顯的偽品;第二步通過(guò)顯微鑒定方法提高性狀鑒定結(jié)果的客觀性。兩種傳統(tǒng)鑒定方法的聯(lián)合對(duì)樣品鑒定的準(zhǔn)確性明顯提高,但對(duì)于同屬近緣種樣品的基原判斷仍存在困難,且有相當(dāng)數(shù)量的植物藥性狀及顯微特征未被記載,難以找到參考文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)核實(shí)。鑒于此,本研究團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)鑒定方法的基礎(chǔ)上,增加了第三步即DNA條形碼鑒定方法,通過(guò)樣品的ITS等序列分析對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定種。性狀—顯微—DNA條形碼三種方法的聯(lián)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的多層次鑒定,達(dá)到了植物類藥材準(zhǔn)確、客觀、快速鑒定的要求。

    本文研究表明,本次收集的Hortela樣品的基原植物為Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.而非圓葉薄荷Mentha rotundifolia(Linn.)Huds,故植物類藥材Hortela可能存在同名異物現(xiàn)象。薄荷屬植物含有薄荷醇(Menthol)、香芹酮(Carvone)、薄荷酮(Menthone)、α-蒎烯(α-Pinene)、β-蒎烯(PPinene)、檜稀(Sabinene)、檸檬烯(Limonene)等成分[7-8],具有發(fā)汗、退熱、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗呼吸道過(guò)敏等作用[7-9];牛至屬植物主要含有香芹酚(Carvacrol)、百里酚(Thymol)、傘花烴(Cymene)、γ-松油烯(γ-Terpinen)等成分[10-11],有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、擴(kuò)張支氣管等功效[12-14]。牛至屬植物與薄荷屬植物藥的化學(xué)成分有差異但功效基本相同,故推測(cè)Hortela為多基原植物類藥材,其來(lái)源為牛至屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.和薄荷屬Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire.干燥地上部分,但該結(jié)論仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

    [1] 季峰.淺談中藥的性狀鑒定[J].國(guó)醫(yī)論壇,2006,21(6):48.

    [2] 杜曄.詮釋中藥鑒定四大鑒定方法[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2012,2(5):101-102.

    [3] 黃璐琦,肖培根,郭蘭萍,等.分子生藥學(xué):一門新興的邊緣學(xué)科[J].中國(guó)科學(xué)C輯:生命科學(xué),2009,39(12):1101-1110.

    [4] 馮杉杉,鄭司浩,李亞康,等.中藥材威靈仙及其偽品DNA條形碼鑒別研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(2):260-266.

    [5] 許亮,劉春生,楊燕云,等.DNA條形碼技術(shù)鑒定一種植物樣品的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(7):217-219.

    [6] 葉子,盧葉,王崢濤,等.基于ITS序列鑒別石斛類藥材[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(20):3930-3935.

    [7] 俞桂新,周榮漢.國(guó)產(chǎn)野生薄荷揮發(fā)油化學(xué)組分變異及其化學(xué)型[J].植物資源與環(huán)境,1998,7(3):13-18.

    [8] 夏秋香,李慧,白紅彤,等.6種薄荷屬植物精油含量及成分的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(S1):2756.

    [9] 欒世杰.薄荷寒熱藥性考辨[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2013,6(8): 610-612.

    [10] 孫麗娟,劉紅兵,范文乾,等.牛至的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2007,33(12):1782-1785.

    [11] 朱斌,程向煒,劉迎新.牛至油化學(xué)成分、藥理活性及提取方法研究進(jìn)展[J].中藥材,2007,30(8):1038-1041.

    [12] D'Antuono L F,Galletti G C,Bocchini P.Variability of essential oil contentand composition of Origanum vulgare L.populations from a North Mediterranean area(Liguria region, Northern Italy)[J].Annals of Botany,2000,86(3):471-478. [13] Hkarenral M.Reichling J,Geiss H K,et al.Comparative study on the in vitro antibacterial activity of Austrilian tea tree oil, cajeput oil,niaouli oil,Manuka oil,kanuka oil,and eucalyptus oil [J].Pharmazie,1999,54(6):460.

    [14] 周艷艷.牛至浸膏對(duì)腸道運(yùn)動(dòng)及解熱鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,3(3):22-24.

    The variety identification of HORTELA in Brazil based on a combined analysis ofmacroscopic-m icroscopic-DNA barcoding

    YU Chun-xia,ZANG Yi-mei,GU Xuan,et al.Henan Province for DrugEvaluation Certification Center,Zhengzhou 450004,China

    LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

    Objective To study the variety identification of HORTELA of Origanum Linn.in Brazil with a combined analysis ofmacroscopic-microscopic-DNA barcoding.M ethods Macroscopic identification was used to identify the authenticity of samples preliminarily;then the resultswas verified bymicroscopic identification;finally,ITS sequences were amplified by PCR and sequenced,and BLAST in NCBI(basic local alignment search tool)database was used to calculate the similarity of sequences to identify variety of samples.Results The combined analysis of macroscopic-microscopic-DNA barcoding indicated that Hortela collected from market in Brazil is the dried overground part of Origanum elongatum (Bonnet)Emb.&Maire.Conclusion HORTELA may be amulti-source herb,which originates from the dried overground part of Origanum elongatum(Bonnet)Emb.&Maire and Mentha rotundifolia(Linn.)Huds.

    Origanum Linn.; Variety identification; DNA barcoding

    R284.1

    A

    10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.009

    2015-08-18)

    (本文編輯:蒲曉田)

    國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

    450004 鄭州,河南省藥品審評(píng)認(rèn)證中心(余春霞);北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院[臧藝玫(碩士研究生)、顧選、吳浩忠、劉春生、馬長(zhǎng)華],針灸推拿學(xué)院(趙百孝),中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)研究所[韓麗(碩士研究生)];北京華邈中藥工程技術(shù)開(kāi)發(fā)中心(顧選)

    余春霞(1972-),女,本科,工程師。研究方向:中藥制劑與分析。E-mail:ycxzzh@126.com

    劉春生(1964-),教授,博士生導(dǎo)師。研究方向:藥用植物與分子生藥學(xué)。E-mail:max_liucs@263.net

    猜你喜歡
    植物藥基原條形碼
    牡丹皮的本草考證
    中國(guó)植物學(xué)會(huì)第十七屆全國(guó)藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會(huì)
    創(chuàng)意條形碼
    多基原藏藥“唐沖”名稱、品種、藥性和植物親緣關(guān)系相關(guān)性考證研究
    多基原郁金的性狀、顯微及氣味差異性研究
    從條形碼到二維碼
    從條形碼到二維碼
    超聲提取植物藥有效成分的研究進(jìn)展
    中成藥(2017年7期)2017-11-22 07:33:41
    敗醬及墓頭回基原的沿革與變遷
    條形碼大變身
    亚洲人成电影免费在线| 日韩欧美三级三区| 久久精品国产清高在天天线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 人人妻人人澡欧美一区二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成人国产一区最新在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 有码 亚洲区| АⅤ资源中文在线天堂| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 国产毛片a区久久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜两性在线视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 舔av片在线| 超碰av人人做人人爽久久 | 欧美大码av| 一级毛片女人18水好多| 精品久久久久久久久久免费视频| 窝窝影院91人妻| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲色图av天堂| 久久香蕉精品热| 两个人的视频大全免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 少妇丰满av| 亚洲,欧美精品.| 露出奶头的视频| 精品免费久久久久久久清纯| 免费搜索国产男女视频| 国产精华一区二区三区| 久久久国产成人免费| 无人区码免费观看不卡| 99热6这里只有精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精华一区二区三区| 在线看三级毛片| 成年女人毛片免费观看观看9| 色尼玛亚洲综合影院| 免费观看精品视频网站| 韩国av一区二区三区四区| 激情在线观看视频在线高清| 国产乱人伦免费视频| 99视频精品全部免费 在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产精品sss在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品av视频在线免费观看| 99热只有精品国产| 久久香蕉国产精品| 舔av片在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜精品久久久久久毛片777| 夜夜夜夜夜久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久成人亚洲精品观看| 免费人成在线观看视频色| netflix在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 全区人妻精品视频| 国产男靠女视频免费网站| 国产主播在线观看一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日韩欧美免费精品| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩一级在线毛片| 精品日产1卡2卡| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美在线乱码| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本与韩国留学比较| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 岛国视频午夜一区免费看| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜福利欧美成人| 五月玫瑰六月丁香| av在线天堂中文字幕| 69人妻影院| 夜夜爽天天搞| 久久久久九九精品影院| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99久国产av精品| 高清在线国产一区| 人人妻人人看人人澡| 国产毛片a区久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 好男人电影高清在线观看| 精品久久久久久,| 国产高清激情床上av| 波多野结衣高清作品| 国产精品爽爽va在线观看网站| av视频在线观看入口| 免费看十八禁软件| 久9热在线精品视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国内精品久久久久精免费| 一本综合久久免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 好男人电影高清在线观看| avwww免费| 免费无遮挡裸体视频| 久久亚洲真实| 国产精品精品国产色婷婷| 精品久久久久久久末码| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 在线视频色国产色| 99热只有精品国产| 国产黄色小视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 免费在线观看亚洲国产| 国产成人啪精品午夜网站| 看黄色毛片网站| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品人妻少妇| 91麻豆精品激情在线观看国产| 嫩草影院精品99| 久久午夜亚洲精品久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 中文在线观看免费www的网站| 人人妻人人看人人澡| 亚洲av二区三区四区| 国产精品国产高清国产av| av中文乱码字幕在线| 九色成人免费人妻av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 色av中文字幕| 久久久久久久久中文| 一个人看视频在线观看www免费 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 听说在线观看完整版免费高清| 乱人视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产色爽女视频免费观看| 在线观看66精品国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产亚洲精品久久久com| 国产成人欧美在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 99热只有精品国产| 母亲3免费完整高清在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲第一电影网av| 搡老熟女国产l中国老女人| 两个人的视频大全免费| 热99在线观看视频| av在线天堂中文字幕| 最近在线观看免费完整版| 国产在视频线在精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av美国av| 嫩草影院入口| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲熟妇熟女久久| 日本一二三区视频观看| 人妻久久中文字幕网| 看免费av毛片| 国产精品久久久久久久电影 | 老司机福利观看| 窝窝影院91人妻| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成人系列免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 日本一二三区视频观看| 久久伊人香网站| 搞女人的毛片| 国产三级在线视频| 丰满乱子伦码专区| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产探花极品一区二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费电影在线观看免费观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲国产欧美网| 国产99白浆流出| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日本a在线网址| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 免费在线观看影片大全网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本 欧美在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 天堂√8在线中文| 亚洲av免费高清在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久人人精品亚洲av| 变态另类丝袜制服| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产成人系列免费观看| 亚洲av一区综合| 久久久久性生活片| 成人一区二区视频在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 热99在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 成人av在线播放网站| 级片在线观看| 国产乱人伦免费视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 女人被狂操c到高潮| 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩黄片免| 美女黄网站色视频| 老鸭窝网址在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 丰满的人妻完整版| 久久6这里有精品| 亚洲欧美激情综合另类| 免费在线观看日本一区| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 90打野战视频偷拍视频| 久久午夜亚洲精品久久| 精品久久久久久久久久免费视频| av福利片在线观看| 成人三级黄色视频| a级毛片a级免费在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 免费看a级黄色片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 动漫黄色视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 在线观看舔阴道视频| 91字幕亚洲| 国产三级黄色录像| 一进一出抽搐动态| 怎么达到女性高潮| 白带黄色成豆腐渣| 久久久成人免费电影| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜两性在线视频| 亚洲18禁久久av| 久久久色成人| 脱女人内裤的视频| 1000部很黄的大片| 丰满乱子伦码专区| 美女高潮的动态| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 香蕉丝袜av| 婷婷丁香在线五月| 国语自产精品视频在线第100页| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲欧美日韩东京热| av欧美777| 天天躁日日操中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99视频精品全部免费 在线| 久久亚洲精品不卡| 中亚洲国语对白在线视频| 精品日产1卡2卡| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 99热只有精品国产| 国产精华一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 51国产日韩欧美| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲美女黄片视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜激情欧美在线| 亚洲国产欧美网| 国产av在哪里看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产久久久一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 久久久久久久久久黄片| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产av麻豆久久久久久久| 久久人人精品亚洲av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产v大片淫在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| 在线视频色国产色| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人aa在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品影院久久| 国产伦人伦偷精品视频| 久久伊人香网站| 三级国产精品欧美在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲欧美激情综合另类| 免费无遮挡裸体视频| 一进一出好大好爽视频| 好男人在线观看高清免费视频| 一区二区三区国产精品乱码| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜老司机福利剧场| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲国产精品成人综合色| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品 国内视频| 国产激情欧美一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美人成| 少妇的丰满在线观看| 小说图片视频综合网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| www日本在线高清视频| 久久久久久久久大av| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久成人免费电影| 国产麻豆成人av免费视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 99精品欧美一区二区三区四区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产黄片美女视频| 男女床上黄色一级片免费看| 99热6这里只有精品| 网址你懂的国产日韩在线| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女 人体艺术 gogo| www日本在线高清视频| 久久精品影院6| 最新在线观看一区二区三区| 在线a可以看的网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 午夜福利成人在线免费观看| 国产高潮美女av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 最近最新中文字幕大全电影3| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天天躁日日操中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| av欧美777| 美女 人体艺术 gogo| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 床上黄色一级片| 色尼玛亚洲综合影院| 精品电影一区二区在线| 日本 欧美在线| 午夜日韩欧美国产| 国产欧美日韩一区二区三| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费人成视频x8x8入口观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 女警被强在线播放| tocl精华| 在线观看午夜福利视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产av在哪里看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产成人aa在线观看| 欧美日韩精品网址| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本免费一区二区三区高清不卡| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品电影一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人国产综合亚洲| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久国产成人免费| 少妇高潮的动态图| 国产成人系列免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 精品福利观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 一本精品99久久精品77| 国产av在哪里看| 国产亚洲精品久久久com| 日本熟妇午夜| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本在线视频免费播放| 亚洲精品一区av在线观看| 十八禁人妻一区二区| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲国产欧美人成| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 一级作爱视频免费观看| 免费av不卡在线播放| 18禁在线播放成人免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 最新中文字幕久久久久| 51国产日韩欧美| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费一级毛片在线播放高清视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| av在线蜜桃| 免费看十八禁软件| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产高清三级在线| 在线观看一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 欧美乱妇无乱码| 天天一区二区日本电影三级| 久久精品影院6| 制服人妻中文乱码| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产中年淑女户外野战色| 三级国产精品欧美在线观看| 成人无遮挡网站| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产亚洲欧美在线一区二区| xxx96com| 国产主播在线观看一区二区| 色视频www国产| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本一二三区视频观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一区福利在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 性色avwww在线观看| 亚洲色图av天堂| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久久久久久中文| 国产成人福利小说| 亚洲av成人精品一区久久| 国产免费av片在线观看野外av| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜福利在线在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 成人国产综合亚洲| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费高清视频大片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产69精品久久久久777片| 亚洲 国产 在线| 操出白浆在线播放| 不卡一级毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 麻豆成人av在线观看| 日韩av在线大香蕉| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久大精品| 国内精品久久久久精免费| 免费人成在线观看视频色| 日本 av在线| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲精品成人久久久久久| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 俺也久久电影网| 婷婷亚洲欧美| 69人妻影院| 日韩国内少妇激情av| 亚洲性夜色夜夜综合| 色综合婷婷激情| 国产三级黄色录像| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 中文在线观看免费www的网站| 草草在线视频免费看| 婷婷丁香在线五月| 美女免费视频网站| 亚洲精品456在线播放app | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品,欧美在线| 色尼玛亚洲综合影院| 在线观看一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 男女午夜视频在线观看| 很黄的视频免费| 97碰自拍视频| 日韩有码中文字幕| 两个人的视频大全免费| 午夜精品在线福利| 全区人妻精品视频| 免费看十八禁软件| 国产视频一区二区在线看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一本综合久久免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 91在线观看av| 露出奶头的视频| 在线国产一区二区在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲欧美在线一区二区| 中文字幕久久专区| 国产精品一区二区三区四区久久| xxx96com| 国产精品一区二区三区四区久久| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久国产精品麻豆| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品日韩av在线免费观看| 一级毛片高清免费大全| 一个人免费在线观看的高清视频| 免费人成在线观看视频色| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 高清在线国产一区| 国产欧美日韩一区二区三| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文字幕av成人在线电影| 热99re8久久精品国产| 精品人妻1区二区| 国产成人欧美在线观看| 色在线成人网| 又爽又黄无遮挡网站| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av不卡在线观看| 在线视频色国产色| 亚洲人成网站在线播| 久久亚洲精品不卡| 观看免费一级毛片| 十八禁网站免费在线| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲国产欧美人成| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩欧美免费精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲真实伦在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲不卡免费看| 欧美午夜高清在线| 国产色婷婷99| 久久久久久大精品| 特级一级黄色大片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 99久久九九国产精品国产免费| 日本 欧美在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产淫片久久久久久久久 | 一个人看视频在线观看www免费 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 禁无遮挡网站| 国产爱豆传媒在线观看| 国产69精品久久久久777片| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美黑人巨大hd| 动漫黄色视频在线观看| av女优亚洲男人天堂| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色av中文字幕| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品野战在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一区二区三区免费毛片| 国内精品美女久久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 一级作爱视频免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产久久久一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 天天一区二区日本电影三级| 中亚洲国语对白在线视频| 老汉色∧v一级毛片| av片东京热男人的天堂| 欧美成人性av电影在线观看| 一个人看视频在线观看www免费 |