抗壞血酸對創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用

張 昊，劉佰運，4，茆 翔

抗壞血酸對創(chuàng)傷性腦損傷的保護作用

張 昊1，2，3，劉佰運1，2，3，4，茆 翔2，5

目的探討抗壞血酸對顱腦創(chuàng)傷后引起的繼發(fā)性腦損傷的保護作用。方法將實驗大鼠隨機分為假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組、打擊+抗壞血酸組，每組12只。建立中度顱腦損傷模型，顱腦創(chuàng)傷后24 h進行神經(jīng)功能損傷評分，測定腦含水量及血腦屏障的通透性；采用Western blot法測定顱腦創(chuàng)傷后24 h的損傷側(cè)腦組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和水通道蛋白4（AQP-4）的表達情況。結(jié)果與打擊+生理鹽水組比較，打擊+抗壞血酸組的神經(jīng)功能損傷程度減輕（P＜0.05），腦水腫程度降低（P＜0.05），血腦屏障的破壞程度明顯降低（P＜0.05），TNF-α和AQP-4的含量降低（P＜0.05）。結(jié)論抗壞血酸可以減輕打擊后腦水腫和血腦屏障的破壞，起到腦保護的作用。

顱腦創(chuàng)傷；抗壞血酸；腦水腫；氧化應(yīng)激

顱腦創(chuàng)傷是嚴重威脅人類健康的公害之一［1］。機體遭受外傷性腦損傷后所發(fā)生的各種繼發(fā)性腦損傷是導致遲發(fā)性神經(jīng)元障礙和死亡的主要原因［2］。創(chuàng)傷性腦水腫，血腦屏障的破壞和開放是外傷性腦損傷后發(fā)生的常見的繼發(fā)性腦損傷［3］，在創(chuàng)傷早期即已發(fā)生，隨著時間的推移進一步加重。最新研究［4］表明，炎性反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中起重要作用，造成血腦屏障的破壞，加重腦水腫的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是引起顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元損傷的主要介質(zhì)之一。探討如何減輕打擊后繼發(fā)性腦損傷及其可能的機制顯得十分重要［5］?？箟难崾且环N抗氧化劑，能保持巰基酶的活性和谷胱甘肽的還原狀態(tài)，防止自由基對人體的傷害。研究［6］表明，抗壞血酸可延緩外傷后早期的氧化應(yīng)激，延緩打擊后病情的發(fā)展，在臨床上補充抗壞血酸已成為減輕繼發(fā)性腦損傷的重要方法。然而抗壞血酸對顱腦創(chuàng)傷的保護原理及機制為何，之前的試驗研究卻未有涉及。該實驗將使用抗壞血酸對顱腦創(chuàng)傷后的大鼠進行干預(yù)，研究顱腦創(chuàng)傷加重的可能機制，并探討抗壞血酸對顱腦創(chuàng)傷保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組成年健康雄性SD大鼠，重（270 ±15）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。實驗動物隨機分為假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組、打擊+生理鹽水組、打擊+抗壞血酸組，每組12只。

1.2 試劑及藥品抗壞血酸；10%水合氯醛；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物公司）；水通道蛋白4抗體（aquaporin-4，AQP-4）（ab9512，英國Abcam公司）；大鼠TNF-α的ELISA試劑盒（BMS622，美國eBioscience公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立 4組大鼠按400 mg／kg采用10%水合氯醛麻醉，取頭皮正中切口，分離骨膜，暴露顱骨。在右側(cè)前囟和人字縫尖中間，開直徑為5 mm的骨窗，注意保持硬膜完整。將大鼠固定于立體定位儀上。將撞擊錘（直徑為4 mm）安置于顱窗內(nèi)，緊貼硬膜。采用PinPointTM顱腦損傷撞擊器，建立中度損傷的可控性皮質(zhì)打擊模型，打擊條件：撞擊速度2 m／s，撞擊深度2.5 mm，接觸時間85 ms。術(shù)后縫合創(chuàng)口。假手術(shù)組大鼠除不進行撞擊外，其余手術(shù)操作同打擊組。術(shù)中用恒溫手術(shù)臺維持實驗大鼠肛溫（37.0±0.5）℃。

1.3.2 給藥 生理鹽水和抗壞血酸均采用腹腔注射的給藥途徑。生理鹽水注射劑量為5 ml／kg，抗壞血酸注射劑量為200 mg／kg，注射時間均為傷后即刻開始。

1.3.3 神經(jīng)功能缺損評分 在損傷后24 h對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，采用18分的神經(jīng)功能量表從感覺試驗、平衡試驗、反射試驗等方面評價實驗大鼠的神經(jīng)功能缺損程度。分數(shù)越高，神經(jīng)功能缺損程度越重，采用雙盲法對各組進行評分。

1.3.4 腦含水量的測定 在損傷后24 h測定大鼠的腦水腫程度［7］。腦水腫通常通過腦含水量進行測定，采用干濕重的方法測量腦含水量。腦含水量（%）＝［（濕重-干重）／濕重］×100%。

1.3.5 血腦屏障通透性的測定 采用伊文氏藍（evans-blue，EB）測定血腦屏障的通透性，處死前2 h自股靜脈注入2%EB溶液（20 mg／kg），平衡后取出腦組織，加甲酰胺溶液3 ml，加蓋避光于54℃水浴箱中萃取3 d，在紫外分光光度計下測量提取液的光密度（optical density，OD）值，使用分光光度計（620～680 nm）測得其OD值，計算大鼠腦組織中EB含量。

1.3.6 TNF-α含量的測定 取打擊同側(cè)的海馬組織，準確稱取組織重量，剪碎標本，加入PBS（pH＝7.0～7.4）充分混合，3 660 r／min離心20 min后取上清液。切割標本，稱取質(zhì)量。加入PBS充分混合，混合后的緩沖液中可加入1 μg／L蛋白酶抑制劑。

1.3.7 Western blot法檢測 裂解的蛋白置于100℃水浴10 min后，上樣于10%SDS-PAGE中進行電泳；后將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，將該膜浸于50 g／L奶粉的1×TBST中室溫輕搖60 min用于封閉非特異性結(jié)合位點，1×TBST洗3次，每次5 min。加入兔抗大鼠AQP-4抗體，4℃孵育過夜，后移去一抗，1×TBST洗3次，每次5 min。加入二抗（辣根過氧化物酶標記的抗羊和抗兔IgG，1∶5 000），室溫孵育1 h，ECL光化學法顯色并拍片。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，對于連續(xù)變量采用表示；對于分級變量采用百分比（%）表示；對于連續(xù)變量，運用Kolmorogov-Smirnov檢驗方法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，而后進行方差齊性的分析。對于兩組正態(tài)連續(xù)變量，使用t檢驗進行比較。采用ANOVA方差分析及post-hoc檢驗或秩和檢驗對多組計量資料進行比較。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評分24 h后，假手術(shù)+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評分為（1.0±0.2）分，假手術(shù)+抗壞血酸組的神經(jīng)功能損傷評分為（0.9±0.3）分，打擊+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評分為（10.0±1.8）分，打擊+抗壞血酸組的神經(jīng)功能損傷評分為（7.9± 2.1）分。打擊+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評分明顯高于假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組和打擊+抗壞血酸組（P＜0.05）。假手術(shù)+生理鹽水組、假手術(shù)+抗壞血酸組與打擊+抗壞血酸組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 腦含水量24 h后，假手術(shù)+生理鹽水組的腦含水量為（82.4±0.1）%，假手術(shù)+抗壞血酸組的腦含水量為（82.8±0.15）%，打擊+生理鹽水組的腦含水量為（83.6±0.25）%，打擊+抗壞血酸組的腦含水量為（82.9±0.17）%。分別與假手術(shù)+生理鹽水、假手術(shù)+抗壞血酸組比較，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組腦含水量明顯增加（P＜0.05）；但打擊+抗壞血酸組腦含水量低于打擊+生理鹽水組（P＜0.05），見圖2。

2.3 血腦屏障通透性打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組的EB含量均高于假手術(shù)+生理鹽水組和假手術(shù)+抗壞血酸組（P＜0.05），而打擊+抗壞血酸組的EB含量低于打擊+生理鹽水組（P＜0.05），見圖3。

2.4 TNF-α的含量分別與假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組比較，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組TNF-α表達明顯增加（P＜0.05）；與打擊+生理鹽水比較，打擊+抗壞血酸組TNF-α表達減少（P＜0.05），見圖4。

2.5 AQP-4的含量分別與假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組比較，打擊+生理鹽水組和打擊+抗壞血酸組AQP-4表達明顯增加（P＜0.05）；與打擊+生理鹽水組比較，打擊+抗壞血酸組AQP-4表達減少（P＜0.05），見圖5。

3 討論

顱腦創(chuàng)傷致殘率、致死率高，給社會和家庭帶來巨大負擔，近幾年學者們主要集中研究顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷，尤其是顱腦創(chuàng)傷后的缺血低氧性損傷［8］。本實驗表明，打擊+生理鹽水組的神經(jīng)功能損傷評分、腦組織含水量、血腦屏障的通透性、TNF-α和AQP-4的含量明顯高于假手術(shù)+生理鹽水和假手術(shù)+抗壞血酸組，而打擊+抗壞血酸組在給予抗壞血酸治療后，各項指標均明顯降低；說明抗壞血酸能夠抑制顱腦創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)展，降低顱內(nèi)壓的進一步升高和神經(jīng)元的死亡；降低血腦屏障的破壞，減輕腦組織的炎性反應(yīng)，從而抑制顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損傷的進一步發(fā)展。

炎性反應(yīng)被認為在顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。TNF-α參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)。研究［9］表明顱腦創(chuàng)傷后，TNF-α在腦內(nèi)局部的濃度迅速升高，通過活化了腦內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，繼而引起一系列的損傷變化。本實驗結(jié)果顯示，抗壞血酸在創(chuàng)傷性腦損傷引起的繼發(fā)性腦損傷中可以通過抑制炎癥因子TNF-α的表達，從而減輕腦水腫和血腦屏障的破壞。

AQP-4在腦組織中廣泛分布于星形膠質(zhì)細胞終突的末端，在介導水跨胞膜的流動中起著關(guān)鍵作用。研究［10］表明AQP-4表達量的高低，與腦水腫產(chǎn)生及腦組織損傷呈正相關(guān)性。星形膠質(zhì)細胞膜上的AQP-4蛋白增加，可促進足突的水腫，導致血腦屏障結(jié)構(gòu)進一步被破壞，加重繼發(fā)性腦損傷。本實驗結(jié)果進一步說明了抗壞血酸可以抑制AQP-4的表達，減少血腦屏障緊密連接的分解及完整性的破壞，降低血腦屏障的開放及減輕腦水腫。

抗壞血酸為顯示抗壞血酸生物活性的化合物的通稱，是一種在氧化還原代謝反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用的抗氧化劑，其烯二醇結(jié)構(gòu)具有電子供體的特征，在與自由基相結(jié)合后，首先失電子生成抗壞血酸自由基，緊接著再次失電子，形成穩(wěn)定的去氫抗壞血酸，從而起到了清除自由基的功效［11］。本實驗表明抗壞血酸較好地消除了自由基對神經(jīng)細胞的損害，減少了細胞毒性腦水腫；降低了血腦屏障的破壞，從而減少了血中大分子物質(zhì)及水分從腦血管內(nèi)滲出從而進入腦組織內(nèi)后累積于腦細胞外間隙造成的血管源性腦水腫，起到了顱腦創(chuàng)傷后的保護作用。本研究結(jié)果提示，打擊加重的可能機制為：當機體遭受外傷性腦損傷時，處于低氧狀態(tài)，通過酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如醛基、酮基、羥基、羧基、氫過氧基以及新的氧自由基。脂質(zhì)過氧化還通過鏈式或鏈式支鏈反應(yīng)，放大活性氧的作用，造成各種繼發(fā)性腦損傷，顱腦創(chuàng)傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)在繼發(fā)性腦損傷中起重要的作用。抗壞血酸作為一種抗氧化劑，通過自身與自由基的結(jié)合反應(yīng)和保護其他抗氧化劑的途徑，有效的防止自由基對人體的傷害［12］，起到了抗氧化應(yīng)激的作用。因此抗壞血酸對減輕顱腦創(chuàng)傷后的繼發(fā)性腦損傷具有較好的神經(jīng)功能保護作用。本實驗為抗壞血酸進一步應(yīng)用于臨床治療提供了重要的實驗依據(jù)，為顱腦創(chuàng)傷的臨床治療提供了新思路，但涉及的具體機制還有待于進一步研究。

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The protective effect mechanisms about ascorbic acid on traumatic brain injury in rats

Zhang Hao1，2，3，Liu Baiyun1，2，3，4，Mao Xiang2，5（1General Hospital of Armed Police Forces Clinical College of Anhui Medical University，Beijing 100039；2Neurotrauma Laboratory，Beijing Neurosurgical Institute，Capital Medical University，China National Clinical Research Center for Neurological Diseases，Nerve Injury and Repair Center of Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing Key Laboratory of Central Nervous System Injury，Beijing 100050；3Dept of Neurotrauma，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039；4Dept of Neurosurgery，Beijing Tian Tan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050；5Dept of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the protective effect of ascorbic acid on secondary brain injury caused by trau-matic brain injury and its possible mechanism.MethodsThe rats were randomly divided into sham+saline group，sham+ascorbic acid group，hit+saline group and hit+ascorbic acid groups.Moderate traumatic brain injury model was established，24 hours after traumatic brain injury，the neurological injury score，brain water content and permeability of blood brain barrier were evaluated.24 hours after traumatic brain injury，the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and aquaporin 4（AQP-4）in damaged brain tissue were evaluated by Western blot method.ResultsCompared with the hit+saline group，the hit+ascorbic acid group＇s degree of neurologic injury mitigated and brain edema reduced，the extent of damage to blood brain barrier reduced significantly，TNF-α and AQP-4 reduced.ConclusionAscorbic acid can reduce brain edema and fight against the destruction of the blood brain barrier.

traumatic brain injury；ascorbic acid；brain edema；oxidative stress

R 651.15

A

1000-1492（2015）12-1734-05

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.012.html

2015-09-30接收

國家自然科學基金（編號：81471238）

1安徽醫(yī)科大學武警總醫(yī)院臨床學院，北京 1000392北京市神經(jīng)外科研究所顱腦創(chuàng)傷室、國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心、北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷與修復研究所、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷研究北京市重點實驗室，北京 100050

3中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院神經(jīng)創(chuàng)傷科，北京100039

4首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京100050

5安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，合肥 230022

張 昊，男，碩士研究生；

劉佰運，男，教授，主任醫(yī)生，碩士生導師，責任作者，E-mail：liubaiyun1212＠163.com