玉米愈傷組織的耐鹽性篩選

趙邯鄲　關(guān)淑艷　徐丹丹　劉雙　陳沼汀

摘要：以玉米（Zea mays L.）自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將帶有pCAMBIA1301-BADH抗鹽堿基因轉(zhuǎn)入供試品種的胚性愈傷中， 通過(guò)愈傷組織對(duì)鹽（NaCl）的敏感性試驗(yàn)，確定愈傷組織適宜選擇壓，同時(shí)研究了2，4-D濃度對(duì)篩選結(jié)果的影響。結(jié)果表明，玉米自交系H99在鹽篩培養(yǎng)基中NaCl濃度為200 mmol/L，2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)篩選結(jié)果最佳。對(duì)移栽成活的48棵抗鹽轉(zhuǎn)pCAMBIA1301-BADH基因植株，經(jīng)PCR檢測(cè)有3株呈陽(yáng)性，陽(yáng)性株率達(dá)到6.3%，初步證明目的基因已整合到玉米基因組中。

關(guān)鍵詞：玉米（Zea mays L.）；愈傷組織；耐鹽性；篩選；NaCl

中圖分類號(hào)：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0206-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.054

鹽堿地在世界上分布廣泛，世界陸地總面積的7.6%為鹽堿地[1，2]。中國(guó)是世界鹽堿地大國(guó)之一，約有鹽堿地0.27億hm2[3]。土壤鹽堿化是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)境因素。隨著灌溉面積的擴(kuò)大，因灌溉水質(zhì)下降及不合理的灌溉方式而引起的土壤次生鹽漬化現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重[4，5]。因此，對(duì)現(xiàn)有作物品種進(jìn)行改良，培育耐鹽作物新類型，已成為十分重要的研究對(duì)象。玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物之一，也是最佳的飼料加工原料，還是重要的工業(yè)原料，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著舉足輕重的地位。在中國(guó)人口增加及耕地面積逐漸減少的情況下，對(duì)玉米的需求也正在與日俱增。另外，中國(guó)是世界玉米生產(chǎn)大國(guó)，玉米對(duì)中國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和市場(chǎng)穩(wěn)定具有非常重要的作用。

隨著轉(zhuǎn)基因作物商品化的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)深入生活，同時(shí)也創(chuàng)造出巨大的效益。因此，培育出具有高產(chǎn)、耐鹽、耐旱等優(yōu)良性狀的玉米一直是玉米育種工作者努力追求的奮斗目標(biāo)[6]。在20世紀(jì)90年代，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究工作得到了飛速發(fā)展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍介導(dǎo)法、PEG法、子房注射法等不僅在玉米上成功使用，而且技術(shù)完善成熟[7-9]。農(nóng)桿菌是自然界中存在的天然基因工程載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其他轉(zhuǎn)化方法相比，具有轉(zhuǎn)化效率高、可轉(zhuǎn)移較大的DNA片段、轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)低、遺傳較穩(wěn)定及整合機(jī)理清楚等優(yōu)點(diǎn)，所以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法改良糧食作物的產(chǎn)量及性狀一直是研究的熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)以玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織為材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將帶有pCAMBIA1301-BADH的抗鹽堿基因轉(zhuǎn)入玉米胚性愈傷中，通過(guò)愈傷組織對(duì)NaCl的敏感性試驗(yàn)，確定了篩選抗鹽基因玉米愈傷組織的有效選擇壓，研究了2，4-D濃度對(duì)篩選結(jié)果的影響，以期為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)，為玉米基因育種研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 外植體 采用玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，3份材料由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 菌種、質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株EHA105、質(zhì)粒pCAMBIA1301-BADH，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）基本培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基。

2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+700 mg/L L-脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D。

3）繼代培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+1.0 mg/L 2，4-D。

4）篩選培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基+不同濃度2，4-D+不同濃度NaCl。

以上培養(yǎng)基中均含4%蔗糖和0.8%瓊脂，pH 5.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)材料的處理 取經(jīng)人工套袋授粉10～15 d的飽滿且無(wú)病蟲害的玉米雌幼穗扒去最外層數(shù)片苞葉，留3～5個(gè)苞葉，切取雌果穗頭部無(wú)子粒部分，用75%乙醇浸泡10 min，扒去所有苞葉及花絲后再用50%的次氯酸鈉溶液浸泡15～20 min，然后將果穗置于超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌水沖洗3～4次，并削去中部子粒的上面1/3胚乳，用解剖針挑出大小約1.5～2.0 mm的幼胚。

1.2.2 玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代 取剝離玉米穗中部子粒的幼胚，將盾片向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。分別將H99、丹988、丹598玉米自交系的玉米幼胚接種到20個(gè)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種30個(gè)盾片，從誘導(dǎo)出的愈傷組織中挑選不透明、淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織夾碎到2～3 mm大小，每皿接種30塊，視各基因型產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量的差異，擴(kuò)繁的數(shù)量也不同，以滿足后續(xù)試驗(yàn)需求為宜。每15 d繼代1次，共繼代4次。

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，并用含有質(zhì)粒pCAMBIA1301-BADH的農(nóng)桿菌菌株劃板于YEP固態(tài)培養(yǎng)基（含1 mg/L Kan）中培養(yǎng)，挑單菌落接種于5 mL YEP液態(tài)培養(yǎng)基（含1 mg/L Kan）中，28 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，隔天放入50 mL YEP液態(tài)培養(yǎng)基中至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD值為0.5～0.6，離心收集菌體將其重懸于侵染液中備用，將預(yù)培養(yǎng)愈傷組織置于重懸后的菌液中，浸泡25 min，輕搖振蕩，倒掉菌液，將外植體放入鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干愈傷組織表面多余的菌液，然后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基（含200 μg/L As），黑暗條件下培養(yǎng)3 d。

1.2.4 鹽脅迫培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上獲得的3個(gè)品種H99、丹988、丹598的胚性愈傷組織接種到不同濃度的鹽脅迫篩選培養(yǎng)基上，NaCl濃度梯度依次為0、50、100、150、175、200、250、275、300 mmol/L， 2，4-D濃度梯度依次為0、1.0、2.0、3.0 mg/L，每個(gè)梯度設(shè)置3次重復(fù)。以不添加NaCl和2，4-D的培養(yǎng)基為對(duì)照，20 d后及時(shí)統(tǒng)計(jì)愈傷組織存活率。根據(jù)愈傷組織存活率，確定愈傷組織最適宜的選擇壓。將篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，分化出的苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基[11]。endprint

愈傷組織存活率=存活的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%。

1.3 PCR檢測(cè)

取抗性植株的葉片按照CTAB方法提取植物基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性55 s，退火50 ℃ 55 s，72 ℃延伸55 s，72 ℃后延伸10 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射儀分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度對(duì)玉米自交系篩選結(jié)果的影響

用玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈傷組織進(jìn)行耐鹽性研究，觀察統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織成活情況，用愈傷組織成活率分析玉米愈傷組織的耐鹽性敏感濃度，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高，各基因型的愈傷組織存活率明顯下降，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到300 mmol/L時(shí)，愈傷組織全部死亡；NaCl的半致死濃度稍高于175 mmol/L，對(duì)篩選結(jié)果有較明顯影響；在NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)鹽篩結(jié)果最佳，這3種不同基因型玉米自交系中，H99的鹽篩結(jié)果最佳。

2.2 不同2，4-D濃度對(duì)玉米自交系篩選結(jié)果的影響

如圖2所示，2，4-D濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響不同基因型玉米自交系愈傷組織在篩選培養(yǎng)基中的存活率，其中2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)鹽篩結(jié)果最佳。2，4-D濃度不同對(duì)不同基因型玉米自交系的篩選結(jié)果也不相同。由不同濃度的2，4-D對(duì)3種基因型玉米自交系愈傷組織篩選的影響可知，其對(duì)H99基因型的鹽篩結(jié)果的影響最明顯。

2.3 抗性植株的PCR檢測(cè)

用CTAB法提取的玉米再生植株葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化玉米獲得轉(zhuǎn)BADH基因再生植株，利用BADH引物按照PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果（圖3）表明，轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出1 500 bp左右的特異條帶，與陽(yáng)性質(zhì)粒作模板的PCR擴(kuò)增條帶大小吻合，而非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株則無(wú)此特異條帶，初步證明BADH基因已整合到再生玉米植株中。經(jīng)過(guò)篩選、分化、生根、移栽，有48株轉(zhuǎn)基因植株成活，通過(guò)在大棚種植，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)，其中陽(yáng)性植株為3株，PCR陽(yáng)性植株率為6.3%。

3 小結(jié)與討論

植物組織和細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生多種變異，若在加有高濃度鹽分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織和細(xì)胞，有可能篩選出耐鹽細(xì)胞并再生出植株[12，13]。這種方法近10多年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，并取得了一定的進(jìn)展，現(xiàn)已篩選出煙草、水稻、首蓓、番茄、蘆葦?shù)戎参锏哪望}變異體并再生了植株[14]。玉米是一種對(duì)鹽分中度敏感的作物，選出具有分化能力高、耐鹽性的愈傷組織是篩選出耐鹽植株的關(guān)鍵。許多材料的愈傷組織或培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的耐鹽篩選后，往往喪失再生植株的能力，本試驗(yàn)過(guò)程中也遇到了同樣的現(xiàn)象。NaCl濃度過(guò)低，不易篩選出耐鹽性較高的愈傷組織，同時(shí)也會(huì)造成過(guò)多的非轉(zhuǎn)化植株存活，增加后續(xù)轉(zhuǎn)化株的鑒定工作量[15-17]。相反NaCl濃度過(guò)高，會(huì)扼殺已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，篩選出的愈傷組織不能再生植株，且篩選頻率很低。為了獲得耐鹽再生植株，本試驗(yàn)采用了盡量減少耐鹽愈傷組織繼代次數(shù)和降低培養(yǎng)基中NaCl濃度等措施，取得了一定成效[18]。

本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈傷組織在含有不同濃度NaCl及不同濃度2，4-D的篩選培養(yǎng)基上的愈傷存活率的情況，結(jié)果表明，當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L，2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)玉米愈傷組織存活率最高，其中H99、丹988、丹598 3種基因型中H99的愈傷組織存活率最高。轉(zhuǎn)化玉米獲得轉(zhuǎn)BADH基因再生植株，陽(yáng)性植株率達(dá)6.3%，對(duì)于其他相關(guān)因素還需進(jìn)一步的分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王麗燕，趙可夫. 玉米幼苗對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng)[J]. 作物學(xué)報(bào)，2005，31（2）：264-266.

[2] 王 寧.不同玉米品種苗期對(duì)鹽脅迫的生物學(xué)響應(yīng)及耐性機(jī)制研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] BIAN J，TANG J，LIN N.Relationship between saline-alkali soil formation and neotectonic move-ment in Songnen Plain，China[J].Environmental Geology，2008，55（7）：1421-1429.

[4] 李佐同，高聚林，王玉鳳，等.硅對(duì)NaCl脅迫下玉米幼苗生理特性的影響[J].玉米科學(xué)，2011（5）：73-76.

[5] ASHRAF M，SAEED M M. Effect of improved cultural practices on crop yield and soil salinity under relatively saline groundwater applications[J]. Irrigation and Drainage Systems，2006，20（1）：111-124.

[6] 胡笑形，羅 艷.2011年全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展概況[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品，2012，20（4）：17-18.

[7] 赫福霞，郎志宏，張 杰，等.轉(zhuǎn)Bt cry1Ah/2mG2-epsps雙價(jià)基因抗蟲/耐除草劑玉米研究[J]. 作物雜志，2012（6）：29-33.

[8] ARMSTRONG C L， GREEN C E. Establishment and maintenance of friable embryo genic maize callus and involvementofL-proline[J]. Planta，1985，164：207-214.

[9] REUTER H， MIDDLELHOFF U， GRAEF F， et al. Information system for monitoring environmental impacts of genetically modified organisms[J]. Environmental Science and Pollution Research，2010，17（8）：1479-1490.

[10] 邢 勇，張小冰，燕海梅，等.鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米種子萌芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，39（10）：19-21.

[11] 黃 璐，衛(wèi)志明.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1999，32（4）：381-378.

[12] 朱新廣，張其德，匡廷云.NaCl對(duì)小麥光合功能的傷害主要是由離子效應(yīng)造成的[J].植物學(xué)通報(bào)，2000，17（4）：360-365.

[13] 楊愛芳，姜素云，胡孝瑞，等.魯梅克斯離體培養(yǎng)及耐鹽植株的再生[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（2）：43-47.

[14] 尹祥佳，翁建峰，謝傳曉，等.玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用[J].作物雜志，2010（6）：1-9.

[15] SIDOROV V， GILBERTSON L， ADDAE P， et al. Agrobacterium-mediated transformation of seedling-derived maize callus[J]. Plant Cell Reports， 2006，25（4）：320-328.

[16] 王宏偉，梁業(yè)紅，史振聲，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[J].玉米科學(xué)，2011，19（3）：73-75.

[17] 蘇 金，朱汝財(cái).滲透脅迫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)對(duì)植物抗旱耐鹽性的影響[J].植物學(xué)通報(bào)，2001，18（2）：129-136.

[18] 權(quán)瑞黨，尚 梅，張舉仁.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系愈傷組織轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2003，29（3）： 245-250.endprint