H2O2對(duì)牡丹愈傷組織分化及抗氧化酶活性的影響

賀丹　毛倉(cāng)倉(cāng)　陳穎　王政　何松林

摘要：以鳳丹白牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）繼代愈傷組織為材料，研究不同外源H2O2濃度下牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，探究酶活性變化與牡丹愈傷組織生長(zhǎng)、分化的關(guān)系。結(jié)果表明，在愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到50 μmol/L以上時(shí)，愈傷組織形態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的變化；100 μmol/L H2O2處理的SOD活性在第5天達(dá)到峰值，與其他處理呈顯著差異，之后逐漸下降；POD和CAT活性變化基本一致，在第5天出現(xiàn)明顯上升，之后下降，然后趨于平穩(wěn)。從形態(tài)觀察和3種抗氧化酶活性結(jié)果來(lái)看，100 μmol/L H2O2對(duì)牡丹胚性愈傷組織的形成和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：外源H2O2；牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）；愈傷組織分化；抗氧化酶活性

中圖分類號(hào)：S685.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0122-04

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）別名木芍藥、富貴花，為芍藥科芍藥屬宿根木本花卉[1]。目前，生產(chǎn)上仍以播種、分株、嫁接等傳統(tǒng)方法進(jìn)行繁殖，其結(jié)實(shí)率低，無(wú)性繁殖速度慢等問(wèn)題限制了品種選育工作的開(kāi)展。組織培養(yǎng)技術(shù)為縮短牡丹的繁育周期提供了可能，但還沒(méi)有形成較完善的技術(shù)體系[2]。牡丹愈傷組織分化困難一直是制約再生體系建立的瓶頸[3]，通過(guò)直接途徑獲得了少量的牡丹體細(xì)胞胚[4，5]。通過(guò)間接途徑即體細(xì)胞誘導(dǎo)成胚性愈傷組織，胚性愈傷組織再發(fā)育成體胚，誘導(dǎo)產(chǎn)生牡丹體胚尚未見(jiàn)報(bào)道。

過(guò)氧化氫（H2O2）是活性氧的重要代表之一，激素等信號(hào)以及生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累。近年來(lái)，有學(xué)者認(rèn)為H2O2可能是一種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)物質(zhì)，有可能通過(guò)細(xì)胞的信號(hào)傳遞系統(tǒng)影響基因的調(diào)控表達(dá)，從而誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成[6，7]。從本質(zhì)上講，胚性愈傷組織的形成過(guò)程也就是愈傷組織的分化過(guò)程，這一過(guò)程的核心是基因的差別表達(dá)。有研究表明，在枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，一定濃度的外源H2O2可提高愈傷組織中體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率，對(duì)細(xì)胞分化及體細(xì)胞胚發(fā)生有促進(jìn)作用[7]。過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等酶活性的變化與愈傷組織的生長(zhǎng)及分化過(guò)程密切相關(guān)。有研究表明，在枸杞的體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，3種酶相互配合來(lái)調(diào)節(jié)胚性細(xì)胞的分化與發(fā)育，且在胚胎發(fā)生與發(fā)育過(guò)程中具有特異性變化[7]；在大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，這3種酶活性的變化與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體胚的發(fā)育密切相關(guān)[8]；POD在石刁柏和小麥的體細(xì)胞胚胎發(fā)生、發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，其活性均高于對(duì)照[9，10]。本研究以鳳丹白牡丹的繼代愈傷組織為材料，嘗試?yán)猛庠碒2O2誘導(dǎo)牡丹胚性愈傷組織，研究誘導(dǎo)過(guò)程中POD、CAT和SOD活性的變化，探究酶活性變化與愈傷組織生長(zhǎng)、分化的關(guān)系，旨在為牡丹體細(xì)胞胚的發(fā)生提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2012年2月采集鳳丹白牡丹鱗芽，采集地點(diǎn)為洛陽(yáng)市土橋花木種苗有限公司牡丹苗木基地。將鱗芽滅菌后接種到MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d后獲得牡丹試管苗。然后將試管苗的葉柄在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D +7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后獲得愈傷組織。愈傷組織在無(wú)菌條件下再轉(zhuǎn)入MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，獲得繼代愈傷組織。以上培養(yǎng)條件均為溫度（24±1） ℃，光照度40 μmol/（m2·s），光照時(shí)間12 h/d。

1.2 試驗(yàn)方法

將獲得的鳳丹白繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入添加有4種不同濃度H2O2（處理Ⅰ 50 μmol/L、處理Ⅱ 100 μmol/L、處理Ⅲ 200 μmol/L、處理Ⅳ 300 μmol/L）的MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每處理接種20瓶。

1.3 測(cè)定方法

供試材料轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后，分別于0、5、10、15、20、25 d進(jìn)行隨機(jī)取樣。準(zhǔn)確稱取材料0.2 g，加2 mL磷酸緩沖液（50 mmo1/L，含1%PVP及0.2 mmo1/L EDTA，pH 7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨，勻漿液于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，上清液用于酶活性的測(cè)定，3次重復(fù)。

POD、CAT活性測(cè)定參照李合生[11]的方法，略加改動(dòng)。SOD活性測(cè)定參照趙世杰[12]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法（SSR法）檢測(cè)其差異顯著性，采用Excel軟件和DPS軟件3.01版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2對(duì)牡丹愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響

供試材料轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)25 d的培養(yǎng)后，觀察牡丹愈傷組織的生長(zhǎng)變化，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，在不同濃度H2O2處理?xiàng)l件下，牡丹愈傷組織的生長(zhǎng)呈不同的變化。處理Ⅰ的愈傷組織呈綠色至黃綠色，形態(tài)較致密；處理Ⅱ出現(xiàn)了一定程度的褐化，愈傷組織表面及邊緣出現(xiàn)較多類似球形胚的凸起，與周?chē)鷤M織易于剝離；處理Ⅲ與處理Ⅳ愈傷組織表面出現(xiàn)少量凸起，多呈黃綠色至白色，處理Ⅳ的褐化情況較嚴(yán)重，接種的20瓶中均有不同程度的污染。endprint

2.2 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中POD活性的變化

如圖2所示，牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后，4個(gè)處理愈傷組織的POD活性整體呈上升-下降-平穩(wěn)的趨勢(shì)。其中0～5 d，除處理Ⅲ外，其他處理的POD活性均大幅上升；5～10 d，處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的POD活性急速下降，處理Ⅲ愈傷組織的POD活性呈緩慢下降的趨勢(shì)，并于第10天出現(xiàn)最低值132.75 U/（g·min）；10～15 d，處理Ⅰ愈傷組織的POD活性平緩下降，處理Ⅱ、Ⅳ愈傷組織的POD活性繼續(xù)大幅下降，而處理Ⅲ的POD活性則緩慢上升；15～25 d，處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ愈傷組織的POD活性則保持緩慢上升的趨勢(shì)，第25天分別達(dá)到279.94、309.38、308.06 U/（g·min）。從POD活性的整體變化來(lái)看，除處理Ⅲ外，其他處理在5 d前后出現(xiàn)了劇烈變化，15 d后變化趨于平緩。

2.3 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中SOD活性的變化

如圖3所示，將牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后，4個(gè)處理的SOD活性整體變化趨勢(shì)較為平緩。其中0～5 d，4個(gè)處理的SOD活性均有上升，處理Ⅱ的變化最大，達(dá)到了382.56 U/（g·min）；5～10 d，處理Ⅱ的SOD活性有小幅下降，并于第10天出現(xiàn)較低值317.69 U/（g·min），而處理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的SOD活性均呈上升趨勢(shì)；10～15 d， 4個(gè)處理的SOD活性均緩慢上升，且于第15天分別達(dá)到342.58、340.71、348.21、347.44 U/（g·min）；之后，4個(gè)處理的SOD活性呈下降趨勢(shì)，第25天分別降至219.72、177.33、201.61、291.62 U/（g·min）。從SOD的活性變化來(lái)看，處理Ⅱ的SOD活性在第5天達(dá)到了峰值，并與其他處理顯著差異。

2.4 牡丹愈傷組織生長(zhǎng)過(guò)程中CAT活性變化

如圖4所示，將牡丹愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度H2O2的培養(yǎng)基后，0～5 d，4個(gè)處理的CAT活性均呈上升趨勢(shì)；5～10 d時(shí)，又迅速下降；10～15 d，處理Ⅰ、Ⅱ的CAT活性持續(xù)下降，并于第15天降至最低值237.5、187.5 U/（g·min），而處理Ⅳ的CAT活性則又出現(xiàn)上升；15～20 d，處理Ⅲ的CAT活性繼續(xù)下降并于第20天出現(xiàn)最低值187.5 U/（g·min）；20～25 d，處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的CAT活性保持快速上升趨勢(shì)，處理Ⅳ的CAT活性則緩慢下降。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究H2O2對(duì)牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的作用，通過(guò)對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)形態(tài)的觀察及抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性的測(cè)定，初步發(fā)現(xiàn)一定濃度的H2O2對(duì)誘導(dǎo)牡丹體細(xì)胞胚形成起促進(jìn)作用。這3種酶與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有密切關(guān)系，它們相互配合調(diào)節(jié)胚性愈傷組織的生長(zhǎng)與分化[8]。

崔凱榮等[7]、邢更妹等[13]認(rèn)為當(dāng)繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，SOD活性呈上升趨勢(shì)，直到多細(xì)胞原胚期，SOD活性達(dá)到最高峰，表明SOD活性升高對(duì)胚性細(xì)胞的分化以及早期胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中第5天，除處理Ⅱ的SOD活性達(dá)到峰值，之后下降，而其他處理的變化趨勢(shì)較為平緩，因此在本試驗(yàn)中處理5 d可能是胚性細(xì)胞分化的時(shí)期。崔凱榮等[7]以枸杞為材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基的繼代愈傷組織只有在SOD活性升高時(shí)才會(huì)發(fā)生細(xì)胞分化，同時(shí)認(rèn)為細(xì)胞的分化取決于SOD與H2O2的相互作用。另外，很多研究表明，胚性愈傷組織中SOD、POD、CAT的活性均較高[15]，說(shuō)明胚性愈傷組織細(xì)胞的適應(yīng)性、抗逆性強(qiáng)于非胚性愈傷組織，能夠?yàn)榕咝约?xì)胞分化、體胚的產(chǎn)生創(chuàng)造有利的條件[16，17]。POD與CAT是與清除H2O2相關(guān)的酶類[18]，本試驗(yàn)中當(dāng)H2O2濃度為100 μmol/L時(shí)，兩者的變化基本一致，這與枸杞[7]、木薯[19]的體胚發(fā)生過(guò)程中POD、CAT活性變化趨勢(shì)相一致。而詹園鳳等[8]在研究大蒜體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，POD活性的變化趨勢(shì)與SOD和CAT活性的變化趨勢(shì)相反，這可能是不同作物體胚發(fā)生過(guò)程中抗氧化系統(tǒng)的協(xié)調(diào)方式不同所致。

在體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及發(fā)生時(shí)間方面，不同物種的差異不大。枸杞在由繼代愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，經(jīng)3 d培養(yǎng)即開(kāi)始有胚性細(xì)胞形成，15 d左右時(shí)即形成大量球形胚[7]。櫻桃番茄在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后，14 d球形胚開(kāi)始形成，經(jīng)歷心形胚、魚(yú)雷胚后35 d開(kāi)始形成子葉胚[20]。石刁柏在培養(yǎng)1個(gè)月后，可以在培養(yǎng)物中挑選出愈傷組織、球形胚、梨形胚、成熟胚等[21]。本試驗(yàn)的形態(tài)觀察和3種抗氧化酶活性的結(jié)果表明，100 μmol/L H2O2對(duì)牡丹胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，后期應(yīng)在培養(yǎng)方式、培養(yǎng)時(shí)間等方面進(jìn)一步深入研究，以獲得理想的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 包滿珠.花卉學(xué)（第二版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2] 趙 鑫，詹立平，鄒學(xué)忠.牡丹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，21（2）：156-159.

[3] 朱向濤，王 雁，彭鎮(zhèn)華，等.牡丹愈傷組織掃描電鏡觀察[J].林業(yè)科學(xué)研究，2011，24（5）：609-612.

[4] 朱向濤，王 雁，彭鎮(zhèn)華，等.牡丹‘鳳丹體細(xì)胞胚發(fā)生技術(shù)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（5）：54-58.

[5] 殷麗青，周 音，胡永紅，等.毒莠定對(duì)牡丹愈傷誘導(dǎo)及體胚發(fā)生的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（8）：1106-1110.

[6] BURDON R H. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation[J]. Free Radical Biology & Medicine，1995，18（4）：775-794.endprint

[7] 崔凱榮，任紅旭，邢更妹，等.枸杞組織培養(yǎng)中抗氧化酶活性與體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)性的研究[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，34（3）：93-99.

[8] 詹園鳳，吳 震，金瀟瀟，等.大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中抗氧化酶活性變化及某些生理特征[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（9）：1799-1802.

[9] 楊和平，程井辰，周吉源，等.石刁柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)及同工酶變化的研究[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1992，25（1）：17-23.

[10] 王亞馥，崔凱榮，汪麗虹，等.小麥體細(xì)胞胚發(fā)生中蛋白質(zhì)組分和過(guò)氧化物酶同工酶的變化[J]. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 1993，29（3）：189-193.

[11] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2003.

[12] 趙世杰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[13] 邢更妹，李 杉，崔凱榮，等.植物體細(xì)胞胚發(fā)生中某些機(jī)理探討[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2000，10（8）：684-692.

[14] 邢更妹，李 杉，崔凱榮，等.植物體細(xì)胞胚發(fā)生中抗氧化系統(tǒng)代謝動(dòng)態(tài)和程序性細(xì)胞死亡[J].生命科學(xué)，2000，12（5）：214-216.

[15] 林小蘋(píng)，賴鐘雄，黃 淺.不同光質(zhì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)和細(xì)胞膜保護(hù)酶活性的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，37（3）：253-256.

[16] DARE K S C， OBERLEY T D， MOUSE K E. Expression of manganese superoxide dismutase promoted cellular differentiation[J]. Free Radical Biology & Medicine，1994，16：275-282.

[17] 辛福梅，張存旭，王 紅.栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織抗氧化物酶的研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（3）：67-70.

[18] 洪森榮，尹明華，紹興華.野葛塊根愈傷組織形成過(guò)程中生理生化指標(biāo)的變化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：64-67.

[19] 王 靜，李瑞梅，郭建春.木薯體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中抗氧化酶活性變化[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2010，1（1）：45-49.

[20] 關(guān)正君，郭 斌，尉亞輝.櫻桃番茄葉體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中抗氧化酶活性和生理參數(shù)的變化[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，25（3）：594-601.

[21] 楊和平，程井辰，周吉源，等.石刁柏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中超氧化物歧化酶活性的變化[J].植物學(xué)報(bào)，1993，35（6）：490-493.endprint