雪里見中草酸鈣針晶形態(tài)結構與含量

劉育辰　劉剛　張勇　黃仕清　徐文芬　王進喜　杜江

摘要：利用顯微鏡和電鏡觀察雪里見（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）中草酸鈣針晶的形態(tài)，并采用RP-HPLC法測定草酸鈣的含量。結果表明，草酸鈣針晶細長，具有尖銳的針尖；草酸在0.099 64～1.992 80 g/L范圍內線性關系良好（r=0.999 3）；平均回收率為100.23%，RSD為1.52%。草酸鈣針晶顯微結構與同科植物的基本相同，建立的含量測定方法操作簡便，結果可靠，重復性好，可作為雪里見藥材質量控制的方法。

關鍵詞：雪里見（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）；草酸鈣針晶；顯微結構；反相高效液相色譜法

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0094-03

雪里見為天南星科植物雪里見（Arisaema rhizom C.E.C.Fisch）的根莖，別名大半夏、麻腳狼毒、半截爛、躲雷草、避蛇參等。貴州、云南、四川等地的土家族和苗族將其作為治療風濕麻木、跌打傷痛的要藥。雖然雪里見在治療某些頑固疾病和常見病方面具有獨特療效，但它對皮膚和黏膜具有強烈的刺激性[1]。2010年版《中國藥典》收載的天南星科藥材中，凡具有毒性或刺激性的藥材都含有草酸鈣針晶，而且國內也有學者對天南星科植物半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit]、虎掌南星（Pinellia pedatisecta Schott）、天南星[Arisaema eruberscens（Wall.） Schott]及白附子（Typhonium giganteum Engl.）進行了研究，認為刺激性成分可能是其具有特殊晶型的“毒針晶”，其“毒針晶”成分除了含有草酸鈣外，還含有蛋白質和微量糖類成分[2-4]。

目前對雪里見的研究多集中在藥材鑒定、化學成分、藥理活性等方面[5-8]，對其毒性成分研究較少，郭坤坤等[1]在前期的研究工作中，推斷雪里見對皮膚和黏膜的刺激性來自草酸鈣針晶。為此，擬從觀察雪里見中草酸鈣針晶的形態(tài)和測定雪里見中草酸鈣針晶的含量著手，通過與同科藥材中草酸鈣針晶形態(tài)的比較，并建立一個簡便、準確測定草酸鈣針晶含量的方法，以期為后續(xù)開展炮制對雪里見中草酸鈣針晶形態(tài)結構、含量的影響及炮制機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材：雪里見藥材經貴陽中醫(yī)學院杜江教授鑒定為天南星科植物雪里見的根莖。

試劑：草酸對照品（貴州迪大生物科技有限公司，純度≥98%）；磷酸二氫鉀、磷酸、鹽酸、冰醋酸、甘油為分析純；水為娃哈哈純凈水。

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀（四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器）；XS205型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；HS10260D型超聲波清洗器（天津恒奧）；HI98107型pH計（意大利HANNA）；愛國者數(shù)碼顯微鏡EV5610；HUS-5GB型高真空鍍膜機（日本HITACHI公司）、JFC-1600型離子濺射儀（日本JEOL公司）、JSM-6490LV型掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）。

1.2 方法

1.2.1 草酸鈣針晶形態(tài)觀察

1）顯微觀察樣品制備。將樣品粉碎，用冰醋酸-甘油-水（V/V，1∶1∶1）封片，于光學顯微鏡下觀察并拍照。

2）掃描電鏡樣品制備。將樣品粉末用膠帶粘置觀測臺上，于HUS-5GB型高真空鍍膜機中進行高真空鍍碳膜，再于JFC-1600型離子濺射儀中鍍鉑金膜，在電流100 HA、加速電壓20 kV的條件下掃描、觀察并進行顯微拍照。

1.2.2 草酸鈣含量測定

1）色譜條件及系統(tǒng)適應性試驗。色譜柱Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：0.5%KH2PO4-H3PO4水溶液（pH 2.3），流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫22 ℃，進樣量10 μL。

2）草酸對照品溶液的配制。稱取草酸對照品適量，精密稱定，加去離子水配制成1.992 80 g/mL的草酸溶液，作為對照品儲備液。

3）供試品溶液的制備。取雪里見粉末0.4 g置于離心管中，加入去離子水3 mL，混勻，超聲處理10 min，置70 ℃水浴鍋中加熱，并攪拌10 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液，殘渣以熱去離子水洗滌3次，每次2 mL，混勻，離心，合并上清液，然后加鹽酸（體積比1∶1）溶液0.4 mL，去離子水3 mL，混勻，方法同上，分離沉淀與上清液，沉淀用0.1 mol/L的HCl同上法處理2次，每次2 mL，離心，合并上清液定容至10 mL量瓶中，備用[9]。

1.2.3 標準曲線的繪制 精密吸取草酸對照品溶液適量，依次用去離子水稀釋成0.099 64、0.199 28、0.498 20、0.797 20、0.996 40、1.992 80 g/L的對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀。以對照品進樣濃度（g/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：■=7 038.8 x+242.95，r=0.999 3。結果表明草酸在0.099 64～1.992 80 g/L范圍內線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 草酸鈣針晶形態(tài)觀察結果

從圖1和圖2可以看出，雪里見的草酸鈣針晶細長，具有尖銳的針尖，多是單個散在，很少成束，長短不一，晶體有的表面光滑，有的具有小的突起，有的表面還具有凹槽。

2.2 草酸鈣含量測定結果

2.2.1 對照及樣品色譜圖 對照及樣品色譜圖見圖3。endprint

2.2.2 精密度試驗 精密吸取草酸對照品溶液（濃度0.498 20 g/L）10 μL，重復進樣6次，測定草酸峰面積，計算并折算成樣品中草酸鈣含量，其RSD為0.76%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取同一批號樣品，平行制備供試品溶液6份，分別進樣10 μL，測定草酸峰面積，計算并折算成樣品中草酸鈣含量，其RSD為1.18%，表明試驗的重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定草酸峰面積，計算并折算成樣品中草酸鈣含量，其RSD為0.15%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.5 準確度 采用加樣回收法。精密稱取已測定含量的雪里見樣品粉末6份各約0.2 g，分別加入草酸對照品適量，按“1.2.2”的制備方法及色譜條件測定，計算并折算成樣品中草酸鈣含量，計算加樣回收率和RSD值，結果見表1。結果表明試驗準確度良好。

2.2.6 樣品含量測定 取樣品制備供試品溶液，RP-HPLC測定，計算并折算成樣品中草酸鈣含量，具體見表2。

3 小結與討論

3.1 雪里見中草酸鈣的顯微形態(tài)

從雪里見草酸鈣針晶的電鏡掃描圖可以看出，與同科的半夏、虎掌南星、天南星及禹白附藥材的針晶形態(tài)相似[4]，針晶都是極為細長，具有尖銳的針尖，但其表面有的比較光滑，有的具有小的突起，有的還具有凹槽，其具體原因有待進一步研究。有文獻報道，粉碎粒度對草酸鈣針晶的形態(tài)、數(shù)量和存在的方式有所改變[10]，因此建議考察粉碎粒度對雪里見中草酸鈣形態(tài)的影響。由于雪里見有毒，一般需要炮制后使用，建議考察不同炮制方法對其草酸鈣形態(tài)的影響。

3.2 雪里見中草酸鈣的含量測定

草酸鈣針晶不溶于水及有機溶劑，因此對樣品進行簡單處理，先將可溶性的草酸鹽去除，然后再通過酸處理使草酸鈣轉化為草酸，再采用RP-HPLC法測定草酸的含量并換算成藥材中所含有的不溶性草酸鈣針晶的含量[2，3，5]。

分別對流動相組成、流動相pH、流速、柱溫、檢測波長進行了考察，結果表明，以0.5% KH2PO4-H3PO4水溶液作為流動相且pH為2.3時，流速0.8 mL/min，柱溫22 ℃，檢測波長210 nm時色譜峰信號強，且分離度良好，基線平穩(wěn)。

雖然天南星科藥材中都含有草酸鈣針晶，但含量差別很大，半夏、水半夏、白附子、天南星中草酸鈣的含量分別為1.222 8%、1.147 2%、0.668 5%、0.688 6%[11]，而雪里見中草酸鈣針晶的含量都在2%以上，天南星科藥材中草酸鈣針晶的含量與其毒性是否存在相關性還有待進一步研究。試驗采用RP-HPLC法測定雪里見中草酸鈣針晶含量，該方法簡便、易行、快速，結果準確可靠，可作為雪里見藥材質量控制的方法。同時該方法為后期比較雪里見藥材炮制前后草酸鈣針晶含量影響及機理研究打下了基礎。

參考文獻：

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