HMGB1 RAGE蛋白在肝癌中的表達(dá)及臨床意義*

莊利萍， 于 璐， 楊 倩， 范方淑， 余 潔

(1.四川省都江堰市中醫(yī)醫(yī)院病理科， 四川 都江堰 611830 2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院病理科， 云南 昆明 650031 3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院病理科， 廣東 佛山 528200)

侵襲和轉(zhuǎn)移是威脅腫瘤患者生命的主要因素，也是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率蛋白 B1(high－mobility group box－B1，HMGB1)是一種腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因，其表達(dá)和腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［2］。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)是細(xì)胞表面分子中免疫球蛋白超家族的成員之一，RAGE參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［3，4］。而 RAGE 是HMGB1的唯一受體［5］。關(guān)于 HMGB1和 RAGE蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)，檢測(cè)了HMGB1、RAGE蛋白在30例原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者癌灶組織中的表達(dá)情況，并與癌旁非癌組織進(jìn)行了對(duì)比，分析了HMGB1、RAGE蛋白表達(dá)與患者臨床病理的相關(guān)性，以期為肝癌治療、預(yù)后提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2008年1月至2011年3月昆明市第一人民醫(yī)院肝膽外科收治的30例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，30例患者中男24例，女6例，年齡36～75歲，平均(59.6±10.5)歲。瘤體＜5cm 者 16 例，≥5cm者14例。以距癌灶邊緣5cm為界分別留取癌灶組織和非癌組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌。

1.2 免疫組織化學(xué)法:兔抗人HMGB1多克隆抗體、鼠抗人RAGE單克隆抗體及S－P免疫組化試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)PTG公司，美國(guó)Santa Cruz公司、北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。肝癌及癌旁組織免疫組化以經(jīng)典的S－P法進(jìn)行(HMGB1工作濃度1∶100，RAGE工作濃度1∶200每片滴加HMGB1一抗，4℃冰箱過(guò)夜)DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已證實(shí)的HMGB1染色陽(yáng)性肝癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 免疫組化:每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野陽(yáng)性細(xì)胞百分比，細(xì)胞核和/或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色顆粒判定為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜15%為表達(dá)陰性(－)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)15%～50%為表達(dá)弱陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為表達(dá)中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于50%為過(guò)表達(dá)。同時(shí)觀察組織切片染色強(qiáng)度并計(jì)分:無(wú)色為陰性0分，淡黃色弱陽(yáng)性1分，黃色陽(yáng)性2分，棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性記3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比和組織切片染色強(qiáng)度兩項(xiàng)分值相乘為每例切片染色總積分，0分為陰性(－)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8 分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3.2 計(jì)算機(jī)圖像分析:應(yīng)用 HPIAS－1000高清晰度病理圖文分析系統(tǒng)定量分析免疫組化結(jié)果。每組標(biāo)本均在400×放大倍數(shù)下按照無(wú)偏采樣原則取5個(gè)視野，每個(gè)視野均按照無(wú)偏采樣原則取5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。依據(jù)陽(yáng)性單位(PU)結(jié)果來(lái)判斷免疫組化染色強(qiáng)度的差異。PU值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。RAGE陽(yáng)性表達(dá)比較用χ2檢驗(yàn)。RAGE蛋白表達(dá)強(qiáng)度采用(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，組間多重比較采用LSD－t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) ɑ=0.05。

2 結(jié) 果

表1 HMGB1、RAGE的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 HMGB1、RAGE的表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 HMGB1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中呈陽(yáng)性表達(dá)×400

圖2 RAGE在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中呈陽(yáng)性表達(dá)×400

HMGB1、RAGE的表達(dá)均與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)。肝癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HMGB1、RAGE的表達(dá)明顯高于肝癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，肝癌腫瘤組織包膜不完整者 HMGB1、RAGE的表達(dá)高于包膜完整者，HMGB1表達(dá)隨 Edmondson分級(jí)的增加而增高，而RAGE與表達(dá)Edmondson分級(jí)無(wú)相關(guān)關(guān)系。HMGB1和 RAGE 之間的表達(dá)呈正相關(guān)(rS=0.470，P=0.000)(詳見(jiàn)表1，2 圖1)。

3 討 論

高遷移率蛋白B1因分子量小(＜30kD)，在聚丙烯酰胺凝膠電泳快速遷移而被命名。HMGB1存在于絕大多數(shù)的真核細(xì)胞內(nèi)，人HMGB1含215個(gè)氨基酸殘基，編碼基因定位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂12區(qū)，其基因序列高度保守。小鼠與兔的氨基酸序列的同源性為100%，而人和嚙齒動(dòng)物的氨基酸序列同源性為99%。HMGB蛋白家族特征性的序列位于151～183位氨基酸，該區(qū)域可能含有結(jié)合HMGB1受體RAGE的基序［6］。HMGB1參與穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、DNA重組和修復(fù)、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及類固醇激素調(diào)控等生命活動(dòng)［7，8］。HMBG1廣泛存在于心、腦、腎、肝、胃、脾等組織中。目前國(guó)內(nèi)外研究廣泛報(bào)道，HMGB1在多種腫瘤中呈過(guò)表達(dá)［2，9］，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、頭頸部鱗癌、膀胱癌等，可促進(jìn)一系列轉(zhuǎn)移調(diào)控基因的上調(diào)，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。且其配體晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)在腫瘤細(xì)胞中也有相應(yīng)表達(dá)［9］，給予HMGB1或RAGE抑制劑，可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［3］。RAGE［4，5］是侵襲相關(guān)基因家族的成員之一，RAGE是細(xì)胞表面分子中單跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族跨膜受體，RAGE在人體內(nèi)分布相當(dāng)廣泛，可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、2型肺泡上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、多種干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等，RAGE是一個(gè)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，可在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)，而且RAGE是HMGB1的唯一受體。HMGB1與RAGE有較高的親和力，二者結(jié)合后，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)JNK、NF－κB、和p42/p44、Rac1/Cdc42等信號(hào)途徑，進(jìn)而激活MAPKs，PI3K/Akt，Rho GTP 酶，Jak/STAT，and Src family kinases(沉降紅細(xì)胞家族激酶)等［10］信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起明膠酶A(MM P－2)和明膠酶B(MMP－9)的激活，引起纖維蛋白溶酶等系統(tǒng)激活，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤缺血區(qū)域移動(dòng)和新生血管形成，加快腫瘤生長(zhǎng)。因此，肝癌發(fā)病中HMGB1及其受體RAGE充當(dāng)重要角色。

研究報(bào)道［11］，HMGB1、RAGE 協(xié)同表達(dá)參與了多種腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。Taguchi［12］等發(fā)現(xiàn)，HMGB1和RAGE相互作用介導(dǎo)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)劑轉(zhuǎn)移，阻斷這一相互作用可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移，減少增生、浸潤(rùn)，HMGB1和RAGE在結(jié)直腸癌、宮頸及食道鱗癌中的協(xié)同表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。迄今為止，關(guān)于HMGB1、RAGE與肝癌相關(guān)研究的報(bào)道少見(jiàn)。Sakuraoka Y［13］等檢測(cè)結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞株HepG2中有RAGE mRNA及其蛋白的表達(dá)，說(shuō)明HMGB1能刺激人肝癌細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)、增殖。Cheng等［14］研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者HMGB1的血清水平比慢性肝炎及肝硬化患者明顯升高，血清HMGB1的表達(dá)與肝癌的TNM分期、病理學(xué)分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，由此可見(jiàn)血清HMGB1與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本課題組前期的研究表明，HMGB1在肝癌組織中呈過(guò)表達(dá)，HMGB1在包膜不完整、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌中的表達(dá)分別高于包膜完整及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。HMGB1可能是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的一種新的潛在的腫瘤特異性標(biāo)志物。與以往學(xué)者的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAGE在肝癌組織有陽(yáng)性表達(dá)，而在癌旁組織中弱或無(wú)表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以往學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，RAGE mRNA和蛋白在肝癌組織中表達(dá)均明顯升高，認(rèn)為RAGE可能參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展［4］。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與無(wú)轉(zhuǎn)移和包膜完整的肝癌患者相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肝癌患者和腫瘤包膜不完整的肝癌患者RAGE蛋白表達(dá)均明顯增加，結(jié)果表明，RAGE的高表達(dá)還與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其結(jié)果與過(guò)往學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RAGEmRNA的表達(dá)水平隨著肝細(xì)胞性肝癌臨床分期的增加而升高，患者預(yù)后越差的結(jié)果相似［6］。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(rS=0.470，P=0.000)，二者在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中存在協(xié)同高表達(dá)二者高表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移正相關(guān)。(P＜0.05)。提示在原發(fā)性肝細(xì)胞癌分化、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)展中，HMGB1基因和RAGE基因有相互誘導(dǎo)或信息傳遞的條件關(guān)系。有學(xué)者［13］采用Westem印跡和RT－qPCR方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株Huh7中HMGB1和RAGE的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示二者的表達(dá)水平與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，HMGB1可能通過(guò)其受體RAGE結(jié)合，從而激活NF－kB，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。

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