道地藥材分子標(biāo)記的研究進(jìn)展

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道地藥材分子標(biāo)記的研究進(jìn)展

羅洪斌，商楠

湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

【關(guān)鍵詞】道地藥材；分子標(biāo)記；進(jìn)展

“道地藥材”又稱“地道藥材”[1]，是指在特定的土壤條件、自然氣候等環(huán)境因素影響下，來(lái)自特定產(chǎn)區(qū)、加工技術(shù)精細(xì)、在歷史上形成的品質(zhì)優(yōu)良、療效確切而被社會(huì)一致公認(rèn)的中藥材。從生物學(xué)角度出發(fā)，“道地性”與道地藥材的表型、遺傳背景及環(huán)境三者有關(guān)[2]， 它是遺傳、環(huán)境及藥材表型三者在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，在某個(gè)特定時(shí)空上的一個(gè)反映。換言之，道地藥材的形成是特定的基因型，在特定的生境下受到復(fù)雜的調(diào)控，導(dǎo)致某些代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)產(chǎn)生了時(shí)空差異的產(chǎn)物[2-3]。因此，有必要對(duì)道地藥材進(jìn)行遺傳資源的研究和保護(hù)。道地藥材的分子機(jī)制研究，就是要在分子水平揭示道地藥材居群水平的遺傳變異，明確道地藥材的基因型特征，以及環(huán)境對(duì)道地藥材基因表達(dá)的影響，從而揭示遺傳因素對(duì)道地藥材形成的貢獻(xiàn)率，并為道地藥材的鑒定提供特有的分子標(biāo)記，從而可以在分子水平實(shí)現(xiàn)道地藥材的鑒別。

目前，應(yīng)用于道地藥材鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)主要有SCAR、RFLP、RAPD、PCR-RFLP、ISSR、DNA測(cè)序和位點(diǎn)特異性鑒別PCR等，廣泛應(yīng)用于人參[4]、枳殼[5]、芍藥[6]、蒼術(shù)[7]、半夏[8-9]、厚樸[10]、石斛[11-13]等道地藥材的遺傳多樣性的評(píng)價(jià)。其中DNA測(cè)序技術(shù)可直接對(duì)基因序列進(jìn)行分析鑒定，通過(guò)直接測(cè)序的方法，掌握道地藥材特征性分子標(biāo)記的堿基序列發(fā)生的細(xì)微變化并加以比較，從而達(dá)到鑒別中藥材的目的。由于核酸分子包含著生物遺傳的信息，同時(shí)也記載著生物進(jìn)化的歷史，即核酸結(jié)構(gòu)不僅指導(dǎo)生物的形態(tài)建成和個(gè)體發(fā)育，而且還能夠反映生物之間的親緣關(guān)系。DNA核苷酸序列的測(cè)定，對(duì)于了解基因及其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)以及分子進(jìn)化等具有重要意義，同時(shí)確定DNA核苷酸序列也是獲得DNA分子間變異最為本質(zhì)的信息。在道地藥材道地性的分子機(jī)制研究中，通過(guò)基因直接測(cè)序技術(shù)而廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記主要有核糖體DNA(nrDNA)的18S rRNA基因和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)非編碼區(qū)序列、葉綠體DNA(cpDNA)的rbcL基因、matK基因和trnH-psbA非編碼區(qū)序列等。下面將對(duì)以上分子標(biāo)記進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1　18S rRNA基因

真核生物中18S rRNA基因編碼核糖體小亞基的18S RNA，為高重復(fù)序列，以連續(xù)排列方式存在于細(xì)胞內(nèi)，序列長(zhǎng)約1850bp，是唯一具有信息分子和功能分子兩種作用的編碼nrDNA的基因。目前，18S rRNA基因廣泛應(yīng)用于道地藥材的分子鑒定，如Fushimi等[14]從人參、西洋參和竹節(jié)參新鮮植物材料以及相關(guān)藥材中提取DNA，對(duì)18S rRNA片段進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3種人參屬植物在18S rRNA片段的第497、499、501和712號(hào)核苷酸序列不同，表明18S rRNA片段上500 bp左右位置的核苷酸序列差異可作為一種基因標(biāo)記用來(lái)鑒別人參及相關(guān)藥材。劉玉萍等[15]采用PCR直接測(cè)序技術(shù)分析了它們的核基因組18S rRNA序列，根據(jù)序列比較發(fā)現(xiàn)廣山藥與正品山藥的18S rRNA序列完全相同，而與土山藥和方山藥在序列上存在明顯差異，序列同源性分別為99.89%和 97.51%，結(jié)果表明DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定的18S rRNA基因序列可成為山藥基源鑒定準(zhǔn)確而有效的分子方法。本文作者也對(duì)恩施州道地藥材板橋黨參和五鶴續(xù)斷分別進(jìn)行了18S rRNA基因的序列分析[16-17]，結(jié)果表明18S rRNA基因序列可作為分析這兩種恩施獨(dú)有的道地藥材的鑒定分子標(biāo)記。羅集鵬等[18]對(duì)藿香屬內(nèi)廣藿香、土藿香和茴藿香的18S rRNA基因也進(jìn)行了克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)廣藿香和土藿香在18S rRNA序列有18個(gè)堿基變異位點(diǎn)和11個(gè)排序間隙，土藿香和茴藿香在18S rRNA序列有4個(gè)堿基變異位點(diǎn)和6個(gè)排序間隙，這些結(jié)果能很好的分辨出三者差異。

2　ITS

ITS為nrDNA的非編碼區(qū)，并被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分，其轉(zhuǎn)錄物對(duì)nrDNA的成熟起重要作用。ITS區(qū)既具有核苷酸序列的高度變異性又有長(zhǎng)度上的保守性，因此這些間隔區(qū)的序列易在近緣類群間排序，同時(shí)又提供了豐富的遺傳信息。通常，ITS在研究屬內(nèi)種間和較近屬間關(guān)系時(shí)都表現(xiàn)出較高的趨異率和信息位點(diǎn)百分率，而且對(duì)于揭示異域或間斷分布居群間的關(guān)系也具有潛力[19]。這些特點(diǎn)使ITS不僅適宜藥材真?zhèn)舞b定，還成為道地性評(píng)價(jià)的一種有力手段。 目前，ITS是這一領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的基因片段之一，已在許多藥用植物的研究中得到了應(yīng)用。周聯(lián)等[20]以各地產(chǎn)姜科藥用植物陽(yáng)春砂及常見(jiàn)偽品為材料，對(duì)其nr-DNA-ITS序列進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果表明，6個(gè)陽(yáng)春砂和綠殼砂的ITS2序列完全一致，各樣品的5.8S序列也完全一致，但各樣品在ITS1中卻有不同的堿基位點(diǎn)。據(jù)此，周聯(lián)等認(rèn)為，應(yīng)用ITS1序列可對(duì)陽(yáng)春砂的道地性進(jìn)行鑒別。余永邦等[21]對(duì)14個(gè)不同地區(qū)產(chǎn)太子參居群新鮮樣品nrDNA基因ITS區(qū)的堿基序列進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)非道地產(chǎn)區(qū)安徽與道地產(chǎn)區(qū)江蘇、 福建、山東的基因型完全不同，而且同一地區(qū)野生與栽培居群亦不同，表明土壤、 海拔等環(huán)境因素對(duì)基因分化有明顯影響。丁小余等[22]對(duì)鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)6個(gè)F型( 楓斗型)和H型(非楓斗型)居群12個(gè)新鮮樣品nrDNA基因ITS區(qū)的堿基序列進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛F型和H型居群內(nèi)分別都具有相同的堿基序列，但這兩類居群間存在2個(gè)堿基變異位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，并證明鐵皮石斛的“rDNA基因ITS序列-生活型性狀特征-居群類型” 三者間存在著一定的相關(guān)性。本文第一作者[23]對(duì)恩施州道地藥材板橋黨參的ITS非編碼區(qū)序列進(jìn)行了相應(yīng)研究，發(fā)現(xiàn)野生和栽培板橋黨參的nrDNA-ITS序列存在兩個(gè)遺傳變異位點(diǎn)，具有遺傳差異性。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)nrDNA中ITS非編碼區(qū)能很好地鑒定道地藥材的遺傳相關(guān)性。

3　rbcL基因

rbcL基因編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基，位于cpDNA的大單拷貝區(qū)，長(zhǎng)約1400bp，是植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用最普遍的基因之一，已在中藥材的系統(tǒng)發(fā)育中得到一定應(yīng)用。袁佐清等[24]對(duì)云南西雙版納地區(qū)的石斛屬植物進(jìn)行了rbcL基因序列的變異及系統(tǒng)發(fā)育研究，表明石斛在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的遺傳多樣性，可以很好地應(yīng)用于其道地性研究。秦民堅(jiān)等[25]對(duì)射干及類似藥用植物的cpDNA rbcL基因序列進(jìn)行了分析，認(rèn)為通過(guò)該基因序列能很好地鑒別這幾種植物。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)rbcL基因在中藥材道地性研究中能得到很好地應(yīng)用。但相比以上兩種分子標(biāo)記來(lái)說(shuō)，rbcL基因在道地藥材分子鑒定應(yīng)用方面還應(yīng)用不普及，受到一定限制，可加強(qiáng)此方面研究。

4　matK基因

matK基因位于葉綠體trnK基因的內(nèi)含子中，長(zhǎng)約1550bp，編碼一種參與RNA轉(zhuǎn)錄體中II型內(nèi)含子剪切的成熟酶，是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進(jìn)化最快的基因之一[26]。目前有很多學(xué)者都應(yīng)用了該基因進(jìn)行中藥材道地性的研究。羅集鵬等[18]應(yīng)用PCR直接測(cè)序技術(shù)對(duì)6個(gè)不同產(chǎn)地的廣藿香干燥葉片的matK基因和18S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析研究。結(jié)果表明，廣藿香6個(gè)樣本間的matK基因序列存在47個(gè)變異位點(diǎn)，18S rRNA基因存在17個(gè)變異位點(diǎn)。結(jié)合有關(guān)揮發(fā)油化學(xué)組成數(shù)據(jù)，為廣藿香的物種鑒定和道地性評(píng)價(jià)提供了分子依據(jù)。黃瓊林等[27]認(rèn)為matK基因序列能很好地鑒別陽(yáng)春砂仁和海南砂仁，二者存在多個(gè)基因位點(diǎn)的差異。劉安莉等[28]在蜘蛛抱蛋屬藥用植物的分子鑒定研究中發(fā)現(xiàn)，matK的鑒定成功率在獲得的單一序列中最高(85%)，多序列組合在鑒定效率方面比單一序列有所提高，其中matK與其它序列的多序列組合進(jìn)行的鑒定成功率為100%，因此，matK和psb序列可用于蜘蛛抱蛋屬藥用植物的鑒定。上述資料及其它證據(jù)均支持matK基因在道地藥材的分子鑒別中是必不可少的要素。

5　trnH-psbA

trnH-psbA非編碼區(qū)序列為葉綠體基因9個(gè)間隔區(qū)中的一個(gè)，編譯速度較快，在植物種內(nèi)級(jí)別分辨率高，能很好地鑒別種內(nèi)差異。目前，該序列在中藥材的鑒別中應(yīng)用較少，僅見(jiàn)劉濤等在蒿屬藥用植物中使用trnH-psbA非編碼區(qū)序列鑒別黃花蒿和茵陳蒿、青蒿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者具有顯著的不同特征差異，可依據(jù)各自特有的信息位點(diǎn)區(qū)分開(kāi)來(lái)[29]。劉震等[30]對(duì)忍冬科藥用植物DNA條形碼通用序列進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明trnH-psbA非編碼區(qū)序列可作為ITS2序列分類鑒定標(biāo)記基因的補(bǔ)充序列進(jìn)行分子鑒定，可以顯著彌補(bǔ)ITS2在鑒定忍冬屬物種水平上的不足。蔣昱等[31]在四川淫羊藿屬植物DNA條形碼篩選與鑒定研究中發(fā)現(xiàn)，10種四川淫羊藿屬植物的分類鑒定中trnH-psbA的鑒定效果較好，ITS和rbcL鑒定效果次之，matK出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定。因此，建議將trnH-psbA作為淫羊藿屬植物的條形碼，具有作為其分子鑒定標(biāo)記的可行性。綜上所述，運(yùn)用trnH-psbA非編碼區(qū)序列可應(yīng)用于道地性的研究?jī)?nèi)容。

目前，以植物DNA條形碼技術(shù)為代表的新技術(shù)在植物的分類鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。DNA條形碼技術(shù)就是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定[32]。在藥用植物道地性研究中，主要也是研究其種內(nèi)差異性，因此應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)來(lái)研究中藥材道地性應(yīng)有較為廣泛的應(yīng)用前景。2009年11月7日至13日在墨西哥召開(kāi)的第三屆DNA條形碼國(guó)際學(xué)術(shù)大會(huì)上，一致建議在rbcL和matK 基礎(chǔ)之上，選擇進(jìn)化速率較快的ITS和trnH-psbA，共同運(yùn)用對(duì)陸地植物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的快速鑒定。同時(shí)本課題組具已有文獻(xiàn)認(rèn)為18S rDNA序列在道地性藥材的分子鑒定也能較好地應(yīng)用，是行之有效的分子標(biāo)記，因此，建議將該五種基因序列作為恩施州乃至全國(guó)道地藥材鑒定的分子標(biāo)記，該方法是可行的。

由于恩施土家族苗族自治州地處“老少邊窮”地區(qū)，當(dāng)?shù)氐赖厮幉呢S富并已形成產(chǎn)業(yè)化，是當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)，因此有必要大力發(fā)展道地藥材的栽培及深加工。在此過(guò)程中，道地藥材種類基源品質(zhì)的保證就顯得格外重要。形態(tài)學(xué)鑒定具有一定的局限性和隨意性，易于混淆，運(yùn)用具有特征性的分子標(biāo)記進(jìn)行分子分類可避免形態(tài)學(xué)鑒定的局限性，能更好地反映道地藥材的道地性形成機(jī)制，而目前僅有少數(shù)相關(guān)報(bào)道對(duì)其進(jìn)行研究，因此有必要運(yùn)用本項(xiàng)目設(shè)計(jì)的技術(shù)手段進(jìn)行道地性形成的分子機(jī)制研究，可為制定分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)資料，也為當(dāng)?shù)氐赖厮幉腉AP研究及規(guī)范化種植保持并提高其獨(dú)有的品質(zhì)提供一些分子生物學(xué)的依據(jù)。

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[收稿日期2013-05-10]

【中圖分類號(hào)】R282.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1008-8164(2014)03-0073-04