蛋白吸附藍(lán)莓花青素顆粒對其單體的穩(wěn)定性和抗氧化活性研究

林曉玲，劉晨楠，張 昕，張笑晨，王嘉悅，陳 健

(1．北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京100083;

2．北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083)

牛血清白蛋白(BSA)是血漿中能與許多內(nèi)源及外源化合物發(fā)生可逆的非共價結(jié)合的載體蛋白，它能夠發(fā)揮重要的儲存和轉(zhuǎn)運作用［1］。由于樣品純度高且廉價易獲得，目前已經(jīng)作為一種常見的模型蛋白載體，用于結(jié)合具有生物活性的小分子。據(jù)報道，花青素主要與BSA中的色氨酸殘基以靜電引力的形式發(fā)生相互作用［2］。

藍(lán)莓中花青素的提取物以矢車菊素為主［3－4］，屬于類黃酮類化合物，基本結(jié)構(gòu)為α-苯基苯并吡喃型陽離子。已報道的花青素具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血糖升高、肝細(xì)胞保護、改善視力、癌細(xì)胞生長抑制等作用［3，5］108－112。因此，花青素被廣泛用于功能食品成分制劑和功能食品生產(chǎn)中。但花青素的多羥基水溶性限制了它在脂類產(chǎn)品中的應(yīng)用，其活潑酚羥基易被氧化成醌類物質(zhì)［6］，使其生物活性降低。另外，受加工儲藏中一些理化因素如溫度、光照以及添加劑等的影響，使得花青素在食品加工過程中的穩(wěn)定性較差。而蛋白大分子與類黃酮化合物的結(jié)合，可以減緩類黃酮化合物的氧化進程，起到保護類黃酮化合物的作用［7］。姚惠芳等的研究表明，在磷酸鹽緩沖液(pH 7．4)中，BSA與花青素通過自組裝形成顆粒，在腸模擬體系中BSA與花青素結(jié)合對花青素有明顯的保護作用［8］(1－6)。在此基礎(chǔ)上，通過評價BSA-花青素顆粒在不同環(huán)境因素中對花青素的穩(wěn)定性及其在不同體系中的抗氧化性能，有利于指導(dǎo)BSA-花青素顆粒在食品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 原料及試劑。藍(lán)莓鮮果購于遼寧丹東市有機食品有限公司，－80℃冷凍保存;牛血清白蛋白(BSA，純度大于98%，分子質(zhì)量68 000 D)，美國Amresco公司進口分裝;Amberlite XAD-7大孔樹脂，天津南開大學(xué)化工廠;色譜級甲醇，購于 Fisher公司;10×PBS(pH 7．2～7．4)，購于北京索萊寶科技有限公司;Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，購于上海葉舟生物科技有限公司;TFA、檸檬酸、檸檬酸鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;甲醇、氯化鉀、硫酸亞鐵、氯化鐵、葡萄糖、蔗糖、抗壞血酸、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、亞硫酸鈉、鹽酸、過氧化氫，北京化工廠;以上化學(xué)試劑除特殊說明外均為分析純;所用水均為蒸餾水。

1．1．2 主要儀器。Amberlite XAD-7層析柱(26 mm×70 cm);AL 104型電子天平，梅特勒－托利多儀器有限公司;RE2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備有限公司;QL-901旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電子恒溫水浴鍋，北京卓川電子科技有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;恒溫?fù)u床，上海天呈實驗儀器制造有限公司。

1．2 方法

1．2．1 樣品預(yù)處理。

1．2．1．1 矢車菊素-3-葡萄糖苷的制備。參照陳健的方法［9］:在0℃下用含0．5%TFA的甲醇浸提破碎好的藍(lán)莓鮮果24 h，取離心后的上清液在38℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到藍(lán)莓花色苷提取物的濃縮液。將濃縮液和乙酸乙酯以1∶1(V∶V)的比例進行3次萃取，得到藍(lán)莓花色苷樣品。再用Amberlite XAD-7柱色譜進行粗分離，最后經(jīng)制備型高效液相色譜制備出藍(lán)莓花青素主要單體Cy-3-glu。

1．2．1．2 蛋白載體的制備。牛血清白蛋白用0．1 mol/L PBS(pH 7．4)配制成1．5×10－4mol/L的儲備液，置于4 ℃的冰箱保存;提取得到的藍(lán)莓花青素單體Cy-3-glu用去離子水(pH=6．3)配成3．0×10－3mol/L 儲備液。根據(jù)姚惠芳等的研究，BSA與花青素的摩爾濃度比為1∶20時，BSA納米載體對花青素的結(jié)合達(dá)到飽和［8］(1－6)。在 pH 7．4 的 PBS 緩沖體系中，BSA與花青素按照1∶1體積比添加，滿足BSA與花青素的濃度比為1∶20。用旋渦混合儀混合均勻，靜置得到Cy-3-glu顆粒。

1．2．2 檢測方法。

1．2．2．1 未吸附藍(lán)莓花青素的檢測方法［10－11］。pH 1．0 的緩沖液的配制:將0．02 mol/L KCl溶液與0．02 mol/L HCl溶液以25∶67 的比例混合，用KCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH(1．0 ±0．1)。

pH 4．5 的緩沖液的配制:將 1 mol/L NaAc、1 mol/L HCl與 H2O 以100∶60∶90 的比例配制，用鹽酸調(diào) pH(4．5 ±0．1)。

采用pH示差法，分別取1 ml待測樣品于反應(yīng)容器中，往里各加入9 ml pH為1．0、4．5的緩沖液，40℃水浴平衡40 min后在520 nm波長下分別測定吸光度，記作A0、A0′并按照下列公式計算:

花青素含量(C，mg/L)=(A×MW)/(Σ×1)×Df×1 000保存率(%)=C2/C1×100

式中，A=A0－A0′;C1、C2分別為處理前后花青素含量;MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量(449．2);Σ為摩爾消光系數(shù);Df為稀釋因子(樣品總的稀釋倍數(shù))。

由于MW、Df和Σ在同一樣品處理時是一致的，故保存率可以簡化為:

保存率(%)=A2/A1×100

式中，A1、A2分別為處理前、后的藍(lán)莓花青素在pH 1．0和pH 4．5緩沖液下測定的吸光值之差。

1．2．2．2 吸附后顆粒中藍(lán)莓花青素的檢測方法。參照方茹等的試驗方法［6］(108－112)，用 NaOH 將0．68%K2HPO4調(diào)至 pH 7．4，吸附后的顆粒在該中性體系下，在 528 nm［8］(1－6)波長下測定吸光值，并計算保存率。

保存率=A4/A3×100

式中，A3、A4分別為處理前、后的Cy-3-glu顆粒的吸光值。

1．2．3 不同條件對吸附后藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響。

1．2．3．1 Cy-3-glu顆粒的熱穩(wěn)定性。分別取3份40 ml制備好的Cy-3-glu顆粒溶液放入40、60、80℃的水浴鍋中，每隔2 h測定其含量變化。對照組取等量未經(jīng)過吸附的藍(lán)莓花青素溶液進行相同處理，同樣測定其含量變化。按照同樣方法進行3次獨立重復(fù)試驗。

1．2．3．2 Cy-3-glu顆粒的光穩(wěn)定性。分別取2份40 ml制備好的Cy-3-glu顆粒溶液，一份置于棕色試劑瓶并避光保存，另一份置于白色試劑瓶在自然光條件下儲存，每隔2 d測定其含量變化。對照組取等量未經(jīng)過吸附的藍(lán)莓花青素溶液進行相同處理，同樣測定其含量變化。按照同樣方法進行3次獨立重復(fù)試驗。

1．2．3．3 添加劑對Cy-3-glu顆粒的穩(wěn)定性影響。取制備好的Cy-3-glu顆粒溶液各30 ml，分別加入等量不同質(zhì)量濃度的VC、葡萄糖和蔗糖，對照組加入等量的蒸餾水。置于37℃，100 r/min搖床中，每隔2 h測定其含量變化。按照同樣方法進行3次獨立重復(fù)試驗。

1．2．3．4 氧化還原劑對Cy-3-glu顆粒的穩(wěn)定性影響。分別取2份制備好的Cy-3-glu顆粒溶液各30 ml，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為20%的過氧化氫和5%的亞硫酸鈉。對照組取等量未經(jīng)過吸附的藍(lán)莓花青素進行相同處理，置于37℃，100 r/min搖床中，每隔2 h測定其含量變化。按照同樣方法進行3次獨立重復(fù)試驗。

1．2．4 蛋白吸附對Cy-3-glu的抗氧化性能影響。

1．2．4．1 清除羥基自由基(·OH)能力［12－13］。用 95% 乙醇配制0．05%的溴甲酚紫溶液;用重蒸水配制1 mmol/ml Fe-SO4以及0．1 mol/L H2O2。將 0．4 ml 0．05% 的溴甲酚紫溶液、0．5 ml 0．1 mol/L HCl和 1．0 ml 1．0 mmol/L FeSO4溶液分別加入到試管中，稀釋至刻度并搖勻，在30℃下反應(yīng)8 min。按照上述方法重復(fù)試驗3次，在波長420 nm處測定溶液的吸光值，取平均值記作為A0。按照上述加樣方法，補充添加0．5 ml 0．1 mol/L H2O2，稀釋至刻度后搖勻。同樣測定其吸光值記作A。

Cy-3-glu清除·OH的測定:按照同樣加樣方法，在加入0．5 ml 0．1 mol/L H2O2后，再分別加入經(jīng)蛋白吸附和未經(jīng)蛋白吸附的Cy-3-glu，稀釋至刻度搖勻后在同樣條件下測定其吸光值，記作AS。則Cy-3-glu對·OH的清除率為:

D(%)=(AS－A)/(A0－A)×100

1．2．4．2 鐵還原力測定。采用孫建霞的方法［14］，配制由2.5 ml 10．0 mmol/L 的 TPTZ 溶液，2．5 ml 20．0 mmol/L 的FeCl3和25．0 ml 0．3 mol/L醋酸鹽緩沖液組成的TPTZ工作液。用0.5%TFA 水和甲醇(7∶3，V/V)配制濃度為25、50、100、200、400和600 mmol/L的 Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取 40 μl與TPTZ工作液反應(yīng)30 min后，用分光光度計在波長593 nm處測定其吸光值，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取吸附的Cy-3-glu與未吸附的Cy-3-glu，各稀釋10倍至40μl，與260μl TPTZ工作液分別在弱光、中等光強和強光下反應(yīng)30 min后，用分光光度計在波長593 nm處測定其吸光值。以相當(dāng)于 nmol/ml Trolox(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)的鐵還原能力來表示Cy-3-glu的鐵還原能力。

2 結(jié)果與分析

2．1 溫度對吸附前后Cy-3-glu的穩(wěn)定性影響 由圖1～3可知，隨著溫度的升高和時間的遷移，吸附前后的Cy-3-glu的保存率均呈現(xiàn)下降趨勢，并且溫度越高，保存率的下降幅度越大。在40℃和60℃加熱2 h后，未吸附的Cy-3-glu保存率的下降速率明顯高于吸附后的Cy-3-glu，說明吸附后的Cy-3-glu耐熱性提高。80℃時吸附前后Cy-3-glu保存率的下降趨勢與速率基本一致。由于蛋白對花青素穩(wěn)定性的提高與兩者之間的分子間氫鍵有關(guān)，氫鍵結(jié)合作用越強，蛋白對花青素保護越明顯［9］，由于在80℃時BSA變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與花青素間的氫鍵斷裂，蛋白質(zhì)不能有效地保護被吸附的花青素。在40℃和60℃加熱10 h后，吸附后的Cy-3-glu的保存率分別為90．97%和72．59%，高于未吸附的Cy-3-glu，說明在一定溫度范圍內(nèi)，蛋白吸附能使Cy-3-glu的熱穩(wěn)定性提高。

2．2 光照對吸附前后Cy-3-glu的穩(wěn)定性影響

2．2．1 黑暗儲存。由圖4、5可看出，隨著時間的推移，Cy-3-glu的保存率呈下降趨勢，吸附與未吸附的Cy-3-glu避光儲存的保存率顯著高于在自然光照下儲存的保存率，說明光照對藍(lán)莓花青素有顯著影響(P＜0．05)。李穎暢等研究也表明，光照能降解藍(lán)莓提取液中的花青素，并導(dǎo)致其不穩(wěn)定［15］。10 d，自然光處理下蛋白吸附花青素的保存率和未吸附的保存率分別為78．1%和45．5%;黑暗處理兩者的保存率分別為88．4%和78．5%?？梢?，蛋白吸附能夠提高Cy-3-glu的保存率，使其在不同的光照條件下處于一個相對穩(wěn)定的態(tài)勢。

2．3 添加劑對Cy-3-glu顆粒中Cy-3-glu穩(wěn)定性的影響

2．3．1 VC對Cy-3-glu顆粒中Cy-3-glu穩(wěn)定性的影響。研究表明，VC在有氧條件下，被分解產(chǎn)生過氧化氫會影響花青素的穩(wěn)定性［16］。由圖6可看出，VC添加量為0．10%與0．25%對吸附后Cy-3-glu的保存率的影響在10 h內(nèi)大致相同。0.50%的添加量相對于其他濃度的添加量能夠顯著提高吸附后Cy-3-glu的保存率，但當(dāng)添加量達(dá)到1．00%時，吸附后Cy-3-glu降解加速。與對照組相比，由于VC具有抗氧化功能，使得不同濃度的VC能夠提高吸附后Cy-3-glu的保存率，10 h吸附后的花青素的保存率均在87%左右。添加不同濃度的VC對吸附后Cy-3-glu影響沒有顯著性差異(P＞0．05)，說明添加適量VC可以增加吸附后Cy-3-glu的穩(wěn)定性。

2．3．2 葡萄糖對Cy-3-glu顆粒中Cy-3-glu穩(wěn)定性的影響。由圖7可知，當(dāng)葡萄糖的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時，在前5 h使花青素的保存率小幅下降，說明低濃度葡萄糖對吸附后Cy-3-glu的穩(wěn)定性影響不大。在該試驗中，與對照組相比吸附后Cy-3-glu的保存率隨著所添加的葡萄糖濃度的增大而增大，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到30%時，吸附后Cy-3-glu的保存率在91%以上。由于添加不同濃度的葡萄糖對吸附后Cy-3-glu影響沒有顯著性差異(P＞0．05)，說明添加適量葡萄糖可以增加吸附后Cy-3-glu的穩(wěn)定性。

2．3．3 蔗糖對Cy-3-glu顆粒中Cy-3-glu穩(wěn)定性的影響。由圖8可看出，相對于對照組，隨著蔗糖濃度的增大，吸附后Cy-3-glu保存率總體呈上升的趨勢。何玲等認(rèn)為，蔗糖對紅提、葡萄有一定的增色作用［17］。而在該試驗條件下，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到20%時，10 h后吸附后Cy-3-glu的保存率最大并達(dá)到92．8%。高濃度(30%)的蔗糖溶液對吸附后Cy-3-glu的影響與5%的大致相同，保存率反而不存在上升趨勢。由于添加不同濃度的蔗糖對吸附后Cy-3-glu影響沒有顯著性差異(P＞0．05)，說明添加適量蔗糖與葡萄糖同樣可以增加吸附后Cy-3-glu的穩(wěn)定性。

2．4 氧化還原劑對Cy-3-glu顆粒中Cy-3-glu的穩(wěn)定性影響

2．4．1 過氧化氫對吸附前后Cy-3-glu的影響。由圖9可看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%過氧化氫對花青素的影響顯著，10 h后吸附與未吸附的Cy-3-glu保存率均下降到35%以下。由于過氧化氫作為強還原劑，能與Cy-3-glu明顯反應(yīng)使顏色變淺。但添加相同濃度的過氧化氫，未吸附的Cy-3-glu比已吸附的Cy-3-glu保存率下降的趨勢更快。因此，吸附后的Cy-3-glu對強還原劑的穩(wěn)定性提高。

2．4．2 亞硫酸鈉對吸附前后Cy-3-glu的影響。由圖10看出，在中性條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硫酸鈉對花青素影響比較明顯，10 h后吸附與未吸附的花青素保存率均明顯下降。由于亞硫酸鈉作為強氧化劑，與花青素反應(yīng)明顯，反應(yīng)物顏色淺。吸附后的Cy-3-glu，花青素與BSA通過靜電引力緊密結(jié)合在一起［8］(1－6)，被亞硫酸漂白的機率下降。而未經(jīng)過吸附的Cy-3-glu保存率下降更明顯，10 h后保存率不到35%?？梢姡胶驝y-3-glu對強氧化劑的穩(wěn)定性提高。

2．5 Cy-3-glu的抗氧化性能

2．5．1 清除羥基自由基(·OH)的能力。由圖11可看出，吸附前后的Cy-3-glu均有較強的清除自由基的能力，并且清除能力隨著Cy-3-glu濃度的增大而增強。當(dāng)?shù)鞍着c花青素的濃度比相同時，吸附后的顆粒對·OH的清除率高于未吸附的Cy-3-glu，說明顆粒能較好地使Cy-3-glu的酚羥基基團發(fā)揮抗氧化的作用，使其抗氧化能力增強。

2．6．2 鐵還原力。

2．6．2．1 鐵還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。將平行測定結(jié)果平均值進行線性回歸，作出鐵還原力標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為:Y=3．7E －5x+0．015 3，R2=0．991 1。

2．6．2．2 Cy-3-glu的鐵還原力測定。由圖13～15可看出，在以抗壞血酸為參照的情況下，隨著光照強度的增強，吸附與未吸附的Cy-3-glu對鐵的還原力均增強，并且隨著Cy-3-glu濃度的增大，兩者對鐵的還原力也逐漸增強。在不同的光照條件下，吸附后的Cy-3-glu對鐵的還原力均高于未吸附的Cy-3-glu，并且均在蛋白與花青素濃度為1∶30處達(dá)到最高:弱光條件下相當(dāng)于3 280 nmol/L Trolox溶液對鐵的還原力，中等光強下相當(dāng)于10 397 nmol/L Trolox溶液對鐵的還原力，強光條件下相當(dāng)35 667 nmol/L Trolox溶液對鐵的還原力，不同光照條件對吸附后藍(lán)莓花青素影響有顯著性差異(P＜0．05)，說明光照條件對Cy-3-glu對鐵還原力的測定有不同的影響，Cy-3-glu顆粒能夠提高花青素的抗氧化能力。

3 結(jié)論

相對于未吸附藍(lán)莓花青素，牛血清白蛋白與藍(lán)莓花青素結(jié)合形成的Cy-3-glu顆?？梢燥@著提高光、熱穩(wěn)定性以及對強氧化還原劑的穩(wěn)定性，可以推斷提高藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性的根本原因是蛋白吸附。一定濃度的VC、蔗糖、葡萄糖和過氧化氫等可以提高Cy-3-glu顆粒的穩(wěn)定性，并且Cy-3-glu顆粒對羥基自由基有較好的清除能力，在不同光照條件下對鐵的還原力也比未吸附的藍(lán)莓花青素強，具有一定的抗氧化能力。

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