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    不同氮源對瘤胃真菌產(chǎn)纖維素酶活性的影響

    2015-03-18 07:48:24孫艷朋王利華
    中國獸醫(yī)雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:氯化銨羧甲基聚糖

    王 光,孫艷朋,王利華

    (青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東 青島 266109)

    氮是構(gòu)成微生物細(xì)胞蛋白和核酸的重要成分。微生物氮的來源可分為無機(jī)氮和有機(jī)氮,其中無機(jī)氮易溶解又有利于吸收;有機(jī)氮除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸外,還含有少量糖、脂肪、微量元素及維生素、生長素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。江微等分別用等量的無機(jī)氮源和復(fù)合有機(jī)氮源代替原培養(yǎng)基中的尿素,結(jié)果表明,釘子菇對復(fù)合氮源利用最好,菌絲生長旺盛,濃密潔白,與無機(jī)氮源差異顯著[2]。而朱永真等的研究表明,尿素為羊肚菌的最優(yōu)氮源,其次是硝酸鉀和硝酸鈣,然后才是酵母膏等有機(jī)氮源[3]。

    瘤胃真菌在反芻動物瘤胃中纖維物質(zhì)分解消化過程中發(fā)揮重要的作用[4]。氮源影響真菌生長,而瘤胃真菌又可以產(chǎn)生纖維素酶,所以本試驗研究酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨以及尿素作為真菌生長所需的氮源,以羧甲基纖維素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性和發(fā)酵液pH 值的變化為指標(biāo),來探討氮源對瘤胃真菌產(chǎn)纖維素酶活性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 本試驗采用的瘤胃厭氧真菌取自裝有永久性瘤胃瘺管的嶗山奶山羊,用真菌培養(yǎng)基稀釋10 倍,39 ℃培養(yǎng)3 d 后獲瘤胃真菌產(chǎn)酶接種用菌株。

    1.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基及試驗設(shè)計 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的配置參照朱崇淼[5]方法,發(fā)酵底物用花生蔓代替。

    試驗分6 個處理組,分別用相同質(zhì)量的供試氮源(酵母膏、菌糠、氯化銨、硫酸銨、尿素)代替產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的蛋白胨,以不加氮源為對照。

    1.3 測定項目和方法 各處理組分別稱取發(fā)酵底物花生蔓0.5 g,裝入封口袋中,然后依次加入45 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基和5 mL 培養(yǎng)3 d 的真菌培養(yǎng)液,每個處理設(shè)3 個重復(fù)。完畢后擠凈封口袋中空氣并封口,放入39 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),發(fā)酵時間分別為0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。在各時間點發(fā)酵結(jié)束,迅速從各封口袋中抽取適量發(fā)酵液上清,備測酶活性,酶活性測定方法參照朱崇淼[5]、王建等方法[6]。

    在各個發(fā)酵時間點,用pH 計測定發(fā)酵液中的pH 值。

    1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)均采用SAS軟件中的Glm 過程對氮源、培養(yǎng)時間及二者的互作效應(yīng)進(jìn)行方差分析,并針對每種氮源的不同培養(yǎng)時間、每個培養(yǎng)時間點不同氮源進(jìn)行方差分析,用Duncan 氏SSR 進(jìn)行多重比較。檢驗誤差為5%水平。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 木聚糖酶活性測定結(jié)果 由表1 可知,不同氮源及培養(yǎng)時間對木聚糖酶活性影響顯著,而且二者的互作顯著(P<0.001)。木聚糖酶活性達(dá)到最高點的時間大致在48 h 或是72 h,5 種氮源組的纖維素酶活性均顯著高于對照組(P<0.05),其中又以氯化銨組的酶活性為最高,顯著高于其他試驗組(P<0.05)。24 h 時有機(jī)氮源組的木聚糖酶活性高于無機(jī)氮源組,48 h 后無機(jī)氮源組木聚糖酶活性迅速升高,并超過有機(jī)氮源組達(dá)到最高酶活性。培養(yǎng)72 h 氯化銨組、硫酸銨組、菌糠組及酵母膏組的酶活性均達(dá)到高峰,但氯化銨組的酶活性顯著高于其他各氮源組(P<0.05)。

    2.2 羧甲基纖維素酶活性測定結(jié)果 表2結(jié)果表明,不同氮源及培養(yǎng)時間對羧甲基纖維素酶活性影響顯著,而且二者的互作顯著(P<0.001)。48 h 時,硫酸銨組和酵母膏組酶的活性達(dá)到高峰,但與其他氮源組相比差異不顯著(P>0.05)。72 h 時,氯化銨組、菌糠組和尿素組酶活性達(dá)到最高,氯化銨組與尿素組的酶活性無顯著差異(P>0.05),但氯化銨組酶活性顯著高于其他各時間點及各氮源組(P<0.05)。

    表1 不同氮源對木聚糖酶活性的影響

    表2 不同氮源對羧甲基纖維素酶活性的影響

    2.3 β-葡萄糖苷酶活性測定結(jié)果 不同氮源及培養(yǎng)時間對β-葡萄糖苷酶活性影響顯著,而且二者的互作顯著(P<0.001)。β-葡萄糖苷酶活性變化趨勢與羧甲基纖維素酶大致相同(見表3),不同之處在于48 h 時,尿素組β-葡萄糖苷酶活性最高。72 h 時,氯化銨組的β-葡萄糖苷酶活性達(dá)到最高峰,與酵母膏差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他各氮源組(P<0.05)。

    2.4 不同氮源組pH值變化結(jié)果 由圖1 可知,各組pH 值隨著時間增長逐漸下降,5 種氮源組120 h 的pH值下降值與對照組相比差異顯著(P<0.05),其中以菌糠組下降最快,相比0 h 時下降了0.86。酵母膏組和尿素組次之,二者之間差異不顯著(P>0.05)。氯化銨組和硫酸銨組pH 值差異不顯著(P>0.05)。

    3 討論

    3.1 不同氮源對纖維素酶活性的影響 對照組的最高纖維素酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于5 種氮源組,證明了氮源對厭氧真菌生長的重要性。本試驗還發(fā)現(xiàn)瘤胃厭氧真菌對無機(jī)氮源的利用效果要優(yōu)于有機(jī)氮源。Dijkerman 等報道,Piromyces E2 菌在以銨鹽為氮源時生長最好,以谷氨酸、清蛋白、尿素等為氮源時,該菌的生長效果不好[7]。松乳菇對NH4+-N 和NO3--N 都能加以較好地利用,而其他外生菌和真菌利用NO3--N 的能力較差[8]。史宏志等研究表明,在中等施氮水平下,無機(jī)氮比例較大時有利于提高淀粉酶的活性[9]。但也有一些學(xué)者認(rèn)為氨基酸類氮源比銨鹽更有利于真菌生長,而且可以直接合成真菌所需的蛋白質(zhì)[10]。白愛枝等認(rèn)為以NaNO3為單一氮源時,72 h 木聚糖酶活力可達(dá)211.0 IU/mL,而且一般復(fù)合氮源對木聚糖酶產(chǎn)量的提高有利[11]。

    表3 不同氮源對β-葡萄糖苷酶活性的影響

    圖1 不同氮源在不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵液pH 值的影響

    從本試驗測得的酶活性大小看,遠(yuǎn)不如Wood等和Lee 等所報道的數(shù)據(jù)[12-13]。分析原因可能是與菌種差異及不同的發(fā)酵工藝有關(guān),本試驗所用發(fā)酵底物為粗纖維含量較高的花生蔓,沒有添加玉米、麥麩等碳源。

    3.2 不同氮源對發(fā)酵液pH 值變化的影響 體外培養(yǎng)時發(fā)酵液pH 值的變化受發(fā)酵底物,有機(jī)酸積聚以及氮源的影響。植物纖維素在消化道內(nèi)被分解為纖維二糖,再由6-磷酸葡萄糖經(jīng)過一系列過程生成丙酮酸,丙酮酸再生成丙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸。厲學(xué)武等研究表明,在培養(yǎng)液中按培養(yǎng)底物秸稈添加2%篩選的瘤胃厭氧真菌可顯著提高培養(yǎng)液中菌體蛋白和揮發(fā)性脂肪酸含量[14]。能量飼料發(fā)酵后會產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,蛋白飼料發(fā)酵后會產(chǎn)生一定量的NH3-N[15]。本試驗表明,菌糠組pH 值下降最為明顯,可能是菌糠相比其他氮源成分比較復(fù)雜(粗蛋白7.5%、粗脂肪7.2%、粗纖維45.16%、粗灰分11.3%、無氮浸出物38.19%),發(fā)酵時無氮浸出物可能被分解成有機(jī)酸,pH 值下降顯著。

    4 結(jié)論

    添加不同氮源對瘤胃厭氧真菌產(chǎn)纖維素酶有一定的影響。從本試驗的結(jié)果來看,以氯化銨做氮源可以產(chǎn)生較高活性的纖維素酶;不同氮源對發(fā)酵液pH 值也有影響,其中菌糠的影響最為明顯。

    [1]樊軍浩,梁新紅,孫俊良,等.不同氮源對枯草芽孢桿菌產(chǎn)α-淀粉酶活力的影響[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械,2011,20:161-163.

    [2]江微,杜雙田,常昕,等.不同碳源及氮源對釘子菇菌絲生長的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,39(5):203-207.

    [3]朱永真,杜雙田,車進(jìn),等.不同碳源及氮源對羊肚菌菌絲生長的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,39(3):113-118.

    [4]毛朝陽,馬桂變,吳瑞欽.反芻動物瘤胃厭氧真菌的研究進(jìn)展[J].當(dāng)代畜牧,2007,9:34-35.

    [5]朱崇淼.產(chǎn)纖維降解酶厭氧真菌菌株的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

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    [15]李永福.不同氮源對瘤胃發(fā)酵和可利用粗蛋白影響的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

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