脫二氧喹賽多在大鼠血漿及組織的藥代動力學(xué)研究

楊 雪，趙東豪，于 洋，周宇峰，時 偉，方炳虎，劉雅紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

喹賽多（Cyadox）屬喹噁啉類藥物，是一種新型的飼料添加劑，由于它具有較低的毒性和良好的促生長作用，因此應(yīng)用前景廣闊[1-2]。喹賽多在動物體內(nèi)可迅速代謝成多種化合物，已有喹賽多的主要代謝途徑及代謝物的相關(guān)報道[3-5]。其中脫二氧喹賽多（1，4-bisdesoxycyadox）是喹賽多的主要代謝產(chǎn)物之一，已有研究認(rèn)為其可能為喹賽多的殘留標(biāo)志物[6]，但目前針對脫二氧喹賽多在大鼠血漿及組織的藥動學(xué)研究尚未開展。因此了解脫二氧喹賽多在動物體內(nèi)的處置過程非常重要。Yan 和He 等建立了高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測喹賽多及脫二氧喹賽多的方法[7-8]。國內(nèi)外相繼報道了喹賽多及其代謝物在豬、雞、魚的藥動學(xué)及殘留消除研究[9-14]，為藥物在動物上的合理使用奠定了基礎(chǔ)。本研究探討了單劑量口服喹賽多后，其主要代謝物脫二氧喹賽多在健康大鼠血漿及各組織中的藥物動力學(xué)過程，通過分析藥動學(xué)參數(shù)，掌握其藥動學(xué)特征，深入了解脫二氧喹賽多在大鼠體內(nèi)的分布和消除情況。

1 材料與方法

1.1 主要材料 藥品：喹賽多原料藥，含量98%，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研究所合成。脫二氧喹賽多，含量98%，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理研究室提供。儀器：Agilent 1200 高效液相色譜儀，購自美國安捷倫公司；API 4000 電噴霧-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；試驗(yàn)動物：Wistar 雌性大鼠150 只，體重250±30 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)。150 只大鼠被隨機(jī)分為15 組，每組10只，其中1 組為空白對照組，其他14 組口服喹賽多（200 mg/kg 體重）后，分別在預(yù)設(shè)的14 個時間點(diǎn)采集樣品。

1.2 給藥及樣品采集 大鼠在給藥前稱重和編號。取喹賽多原料藥，用0.5%羧甲基纖維素鈉配成50 mg/mL 的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。大鼠保定好后，以200 mg/kg 體重的劑量口服給藥。給藥后分別在0.25、0.5、1、2、3、5、6、7、8、10、12、16、24 h 和48 h 將對應(yīng)的大鼠處死，采集血液及組織，同時從空白組采集空白樣品。將收集的1.5～2.0 mL 血液，置于含肝素鈉的塑料離心管中，3 000 r/min 離心10 min，分離血漿。采集的組織樣品重2 g 左右，經(jīng)生理鹽水清洗后，用濾紙吸干，裝入已編號的樣品袋中。所有樣品均在-20 ℃保存，并予1 周內(nèi)檢測完畢。

1.3 血漿及組織樣品處理[7-8]取血漿樣品0.25 mL，置于離心管中，加入0.25 mL乙腈，旋渦振蕩1 min后于12 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，備檢。取組織樣品0.5 g，用5 mL乙酸乙酯提取兩次，合并上清液于40 ℃下N2吹干，殘留物用6 mL甲醇/水（1/5）復(fù)溶，過Oasis MAX固相萃取小柱，最后用1 mL甲酸/乙腈（2/98）進(jìn)行洗脫。洗脫液12 000 r/min離心5 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)檢測。

1.4 色譜及質(zhì)譜工作條件 色譜柱：Luna C18（150×2.0 mm id，5 μm），購自美國Phenomenex 公司。流動相包括0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），流速0.2 mL/min。梯度洗脫程序如下：0～4.5 min 98～20%A，4.5～5.9 min 20%A，5.9～6.0 min 20～98%A，6.0～14.0 min 98%A；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式；電噴霧離子源；負(fù)離子掃描；噴霧電壓-4.2 kV，霧化氣壓力50 psi，輔助氣流速55 L/min，氣簾氣壓力20 psi，離子源溫度600 ℃，碰撞室壓力7 psi。監(jiān)測離子對為238.0→65.9，238.0→142.9，其中238.0→65.9 以其較高的靈敏性被選作定量離子對。

1.5 數(shù)據(jù)處理 血漿和組織樣品中脫二氧喹賽多的濃度經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀的Analyst 1.5 軟件處理得到。所有的藥物濃度-時間數(shù)據(jù)經(jīng)WinNonlin 6.1（美國Pharsight 公司）軟件的非房室模型擬合，計(jì)算脫二氧喹賽多在血漿及各組織中的藥動學(xué)參數(shù)，同時以藥物濃度平均值對時間作藥-時曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 色譜分析 通過測定不同濃度脫二氧喹賽多的信噪比（S/N），確定該代謝物的檢測限（S/N=3）為1 μg/L，定量限（S/N=10）為2 μg/L。在5～500 ng/mL 的范圍內(nèi)，脫二氧喹賽多的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。血漿和各組織的脫二氧喹賽多的回收率為86.40%-99.20%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.80%-13.80%，批間變異系數(shù)為3.51%-9.60%。

2.2 藥物代謝動力學(xué)特征 大鼠口服200 mg/kg體重的喹賽多后，不同時間點(diǎn)的血漿及組織藥時曲線如圖1。采用非房室模型法計(jì)算血漿及組織中的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1。

圖1 大鼠口服喹賽多（200mg/kg體重）后血漿及各組織的藥物濃度-時間對數(shù)曲線

表1 大鼠單劑量口服喹賽多（200mg/kg體重）脫二氧喹賽多在血漿及各組織中的藥動學(xué)參數(shù)

3 結(jié)論與討論

3.1 脫二氧喹賽多在血漿中的藥動學(xué)特征 從藥時曲線上可以看出，除了肝臟，其他組織均在2 h后檢測出較高濃度的脫二氧喹賽多，這表明喹賽多在動物體內(nèi)生成代謝產(chǎn)物的過程相對較慢。血漿藥動學(xué)結(jié)果表明，脫二氧喹賽多在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)適合用非房室模型擬合，其T1/2β為4.63 h，稍低于Zhao[12]報道的豬（40 mg/kg體重）的T1/2β（5.77 h），而稍高于郭軍朋[11]報道的豬（40 mg/kg 體重）的T1/2β（3.85 h），說明脫二氧喹賽多在大鼠體內(nèi)的消除速率在種屬間的差異較小。本研究中脫二氧喹賽多在血漿中的Tmax 為7.00 h，略大于邱銀生[10]報道的豬（40 mg/kg 體重）的Tmax（6.30 h），而與Zhao[12]報 道的豬的Tmax（7.25 h）相近，說明脫二氧喹賽多的達(dá)峰時間在種屬間差異較小。本研究中脫二氧喹賽多的AUC0→∞為9937.08 h*μg/L，高于Zhao[12]報道的豬的AUC0→∞（1380.00 h*μg/L）、殷居易[9]報道的鯉（40 mg/kg 體重）的AUC0→∞（1890.00 h*μg/L），這說明AUC0→∞在種屬間有一定的差異。大鼠口服喹賽多后脫二氧喹賽多的血漿清除率Cl/F 為20.13 L/h·kg，表觀分布容積V/F 為134.35 L/kg，說明脫二氧喹賽多在大鼠體內(nèi)分布廣泛，清除緩慢。

3.2 脫二氧喹賽多在各組織中的藥動學(xué)特征本研究中脫二氧喹賽多在各組織內(nèi)T1/2β的順序?yàn)椋焊闻K＞腎臟＞肌肉＞脂肪。T1/2β的數(shù)值表明化合物在各組織中的消除速率較慢，其中腎臟T1/2β高于顏丹丹[14]報道的雞（50 mg/kg 體重連續(xù)多劑量灌服給藥7 d）腎臟T1/2β（3.71 h），與Li[13]報道的豬（20 mg/kg 體重連續(xù)多劑量灌服5 d）的各組織T1/2β（肝臟、腎臟、肌肉和脂肪分別為29.84、26.55、20.00 h 和19.52 h）有一定的差異，這可能和動物的種屬差異和不同的給藥方式有關(guān)。本研究中脫二氧喹賽多在各組織內(nèi)的AUC0→∞順序?yàn)榧∪猓靖闻K＞腎臟＞脂肪，說明脫二氧喹賽多在大鼠肌肉中的殘留水平較高，在脂肪中較低，該結(jié)果和Li[13]報道的腎臟＞肝臟＞脂肪＞肌肉有一定的差別。本研究中脫二氧喹賽多在各組織內(nèi)的平均MRT 大小順序?yàn)楦闻K＞肌肉＞腎臟＞脂肪，其中腎臟MRT稍高于顏丹丹[14]報道的雞的腎臟MRT（6.48 h），該結(jié)果可以為臨床上喹賽多休藥期的制定提供參考。

3.3 總結(jié) 本文研究了大鼠單劑量口服喹賽多后，其代謝產(chǎn)物脫二氧喹賽多在血漿及組織中的藥動學(xué)，通過與其他種屬藥動學(xué)特征的比較，可以看出，喹賽多代謝為脫二氧喹賽多的過程比較緩慢、消除速率低、達(dá)峰濃度高、在大鼠體內(nèi)分布廣泛。本文填補(bǔ)了喹賽多單劑量給藥下各組織藥物濃度變化的研究空白，為今后關(guān)于喹賽多及其代謝物的藥動學(xué)研究提供參考，也可作為建立生理模型并外推至其他動物的前期工作。目前關(guān)于喹賽多在動物體內(nèi)的殘留標(biāo)志物和殘留靶組織仍沒有確切的規(guī)定，本研究的結(jié)果可以為其他動物的殘留消除研究提供借鑒，為休藥期的制定提供參考，從而在生產(chǎn)中更合理的使用該藥物。

[1]Wang X，He Q H，Wang Y L，et al.Achronic toxicity study of cyadox in Wistar rats [J].Regul Toxicol Pharm，2011，59（2）：324-333.

[2]姚觀崇，林彬全，郭俊杰，等.喹賽多對肉兔的促生長作用研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2008，21（1）：6-9.

[3]Wu H X，Li L X，Shen JZ，et al.In vitro metabolism of cyadox in rat,chicken and swine using ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J].JPharmaceut Biomed，2012，67-68：175-185.

[4]Xu N，Huang L L，Liu Z L，et al.Metabolism of cyadox by the intestinal mucosa microsomes and gut flora of swine，and identification of metabolites by high-performance liquid chromatography combined with ion trap/time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Sp，2011，25（16）：2333-2344.

[5]Liu Z Y，Huang L L，Dai MH，et al.Metabolism of cyadox in rat,chicken and pig liver microsomes and identification of metabolites by accurate mass measurements using electrospray ionization hybrid ion trap/time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Sp，2009，23（13）：2026-2034.

[6]胥寧.喹賽多在豬、雞、魚和大鼠體內(nèi)代謝及分布研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[7]Yan DD，He L M，Zhang G J，et al.Simultaneous determination of cyadox and its metabolites in chicken tissues by LC-MS/MS[J].Food Anal Method，2012，5（6）：1497-1505.

[8]He L M，Liu K Y，Su Y J，et al.Simultaneous determination of cyadox and its metabolites in plasma by high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].JSep Sci，2011，34（15）：1755-1762.

[9]殷居易.喹賽多在鯉體內(nèi)的藥物動力學(xué)及殘留的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[10]邱銀生.喹賽多在豬體內(nèi)的藥動學(xué)和殘留研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.

[11]郭軍朋，張展，遠(yuǎn)立國，等.喹賽多及其主要代謝物在豬體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(9):228-231.

[12]Zhao N，Wang L，Lu X X，et al.Pharmacokinetics of cyadox and its major metabolites in swine after intravenous and oral administration [J].JIntegr Agr，2013，12（3）：495-501.

[13]Li Y F，Zhao N，Zeng Z L，et al.Tissue deposition and residue depletion of cyadox and its three major metabolites in pigs after oral administration [J].JAgr Food Chem，2013，61：9510-9515.

[14]顏丹丹.喹賽多及其主要代謝物在雞組織中的殘留檢測方法及消除規(guī)律研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.