microRNA-204 在鼻咽癌中的表達(dá)及生物學(xué)意義研究

蔣成義 汪洪濤 周 蕾 江 濤 許亞佳 (蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，蚌埠 233004)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種惡性程度較高的鼻咽部上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤［1］，近年來，鼻咽癌的發(fā)病率不斷攀升，因其病變發(fā)展隱匿，大多數(shù)患者在就診時(shí)已處于腫瘤晚期。晚期鼻咽癌主要采用放射治療聯(lián)合全身化療的方法，但患者初治反應(yīng)率低，5 年生存率不足60%［2］。因而，鼻咽癌已成為危害廣大群眾健康的重要因素之一。

microRNAs(miRNA)是一類短鏈的非編碼RNA，它能夠與靶基因的mRNA 特異性結(jié)合進(jìn)而降解mRNA 單鏈或抑制其翻譯［3］。研究表明，NPC 組織中存在多種miRNA 的異常表達(dá)，如miR-21 在NPC 組織中表達(dá)升高并與NPC 臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21 通過下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白PDCD4 及Fas-L 來促進(jìn)腫瘤抗凋亡作用［4］;高生物活性的miR-18a 可以通過降解microRNA 成熟過程中的關(guān)鍵酶DICER1 而促進(jìn)NPC 細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力［5］。miR-204 已經(jīng)被證實(shí)是一種重要的腫瘤調(diào)節(jié)基因，在多種人類惡性腫瘤中存在表達(dá)下調(diào)甚至缺失，并與腫瘤增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)［6-8］。通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)，B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及人組蛋白脫乙酰酶1(Sirtuin type 1，SIRT1)是miR-204 的下游靶點(diǎn)之一，并在多種腫瘤的體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。但是，miR-204 在人鼻咽癌中的臨床病理意義及其具體分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過檢測miR-204 在鼻咽癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況及其對下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2、SIRT1 的調(diào)控作用，研究miR-204 在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義作用機(jī)制，為鼻咽癌的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本及主要試劑 本課題經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)審核后開展。收集2012 年3 月至2014 年3 月間于我院耳鼻喉頭頸外科行組織病理活檢的鼻咽癌及對應(yīng)癌旁鼻黏膜組織標(biāo)本43 例，其中男33 例，女10 例，年齡42～74 歲，平均年齡(55.7 ±1.6)歲。所有入組患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本于離體30 min 內(nèi)取材，分別置于液氮或4%多聚甲醛溶液中保存。Trizol 試劑及脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000)購自美國Invitrogen 公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(#1622)購自美國Fermentas 公司;real time PCR 試劑盒SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(#RR420A)購自寶生生物工程(大連)有限公司;miR-204 特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、RNU6B 引物及人工合成的miR-204 模擬物(miR-204 mimics)均購自廣州銳博生物科技有限公司;Bcl-2 引物(5'-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3';5'-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3')，SIRT1 引物(5'-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3';5'-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3')，β-actin 引 物(5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3';5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3')由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成;兔抗人Bcl-2多克隆抗體(sc-492)、兔抗人SIRT1 多克隆抗體(sc-74504)及鼠抗人β-actin 單克隆抗體(sc-47778)均購自美國SANTA CRUZ 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒及ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Milipore 公司。

1.2 qRT-PCR 按RNA 提取試劑說明書方法提取NPC 及癌旁組織中的microRNA 及mRNA，按以下條件進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):預(yù)變性70℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄37℃1 h，酶滅活85℃5 min。以2 μl cDNA 配制Real-time PCR 體系，按如下條件進(jìn)行PCR 反應(yīng):預(yù)變性95℃30s，變性95℃5 s，退火延伸60℃30 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。以RNU6B 基因或β-actin 基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-204 相對表達(dá)量。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3 免疫組化 組織標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片制作4 μm。切片經(jīng)脫蠟、水化后，pH6.0 枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù);30 ml/L H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，100 ml/L 山羊血清封閉;分別滴加兔抗人Bcl-2 抗體(1∶100)、兔抗人Sirt1 多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育過夜;洗滌后，加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min;洗滌后滴加辣根過氧化物酶-鏈酶卵白素復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片經(jīng)由2 位高年資病理醫(yī)師，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，按以下標(biāo)準(zhǔn)［9］單獨(dú)閱片、評(píng)分:染色強(qiáng)度評(píng)分:0 分:陰性;1 分:弱陽性;2分:中度陽性;3 分:強(qiáng)陽性。陽性腫瘤細(xì)胞(或肝細(xì)胞)百分比評(píng)分:陽性細(xì)胞≤5% 為0 分;6%～25%為1 分;26%～50% 為2 分;51%～75% 為3 分;75% 為4 分。每視野評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性腫瘤細(xì)胞(或鼻黏膜細(xì)胞)百分比評(píng)分，取10 個(gè)視野的平均得分作為切片的最終評(píng)分。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS 的1 × DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。每2～4 d 傳代一次，穩(wěn)定傳代2～3 代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 CNE-2 細(xì)胞接種于6 孔板中，用含10%FBS 的1 ×DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)50%左右，實(shí)驗(yàn)分組及處理如下:實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 pmol miR-204 mimics 及5 μl 轉(zhuǎn)染試劑;對照組每孔加入100 pmol 陰性對照(Negative Control，NC)mimics 及5 μl 轉(zhuǎn)染試劑。每孔加入不含血清的1 ×DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h 后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.6 Western blot 取轉(zhuǎn)染72 h 后的CNE-2 細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液置冰上裂解10 min，裂解液收集于1.5 ml EP 管中，4℃、14 000 r/min 離心10 min 后取上清。BCA 法測定總蛋白濃度，每孔加入50 μg 蛋白樣品，10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白。采用Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，20 V 轉(zhuǎn)膜1 h，5%BSA 室溫封閉1.5 h 后加入1∶1 000 稀釋的Bcl-2一抗、SIRT1 一抗及β-actin 一抗，4℃搖晃孵育過夜，0.01 mol/L TBST 漂洗5 min ×3 次后加入1∶5 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h。0.01 mol/L TBST 漂洗5 min × 3 次。于暗室內(nèi)，在膜上滴加ECL 溶液，并使膠片曝光，全自動(dòng)洗片機(jī)洗片。每樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織及對應(yīng)癌旁組織中miR-204 的相對表達(dá)量 經(jīng)qRT-PCR 技術(shù)檢測，43 例鼻咽癌組織中miR-204 的相對表達(dá)量顯著低于癌旁鼻黏膜組織(2.351 ±0.193 vs 8.743 ±0.361)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)證明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 miR-204 表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理特征間相關(guān)性 為研究miR-204 表達(dá)水平與腫瘤臨床特征間的相關(guān)性，將43 例鼻咽癌組織按患者性別、吸煙與否、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分型及TNM 分期等臨床病理資料間的相關(guān)性進(jìn)行卡方分析，經(jīng)Student-t檢驗(yàn)，NPC組織中miR-204 低表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM 分期(Ⅲ+Ⅳ)間具有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。

2.3 腫瘤組織中miR-204 與Bcl-2 及Sirt1 蛋白表達(dá)間的相關(guān)性 為探討鼻咽癌組織中miR-204 與其下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2 及SIRT1 表達(dá)間的相關(guān)性，我們分別在miR-204 低表達(dá)及高表達(dá)鼻咽癌組織中對Bcl-2 及SIRT1 進(jìn)行免疫組化染色，并對統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。免疫組化結(jié)果顯示，miR-204 低表達(dá)組中Bcl-2 及SIRT1 蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于miR-204 高表達(dá)組(P＜0.05，圖2A、B)。Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-204 與Bcl-2 及SIRT1 的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05，圖2C)。

圖1 miR-204 在鼻咽癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-204 in NPC and tumor adjacent tissues

表1 miR-204 表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n=43)Tab.1 Clinical correlation of miR-204 expression in NPC(n=43)

圖2 Bcl-2 及SIRT1 在鼻咽癌組織中的表達(dá)及與miR-204 的相關(guān)性Fig.2 Expression correlation of Bcl-2，SIRT1 and miR-204 in NPC tissues

圖3 過表達(dá)miR-204 下調(diào)CNE-2 細(xì)胞中Bcl-2 及SIRT1的表達(dá)Fig.3 miR-204 knocked down expression of Bcl-2 and SIRT1 in CNE-2 cells

2.4 過表達(dá)miR-204 對鼻咽癌CNE-2 細(xì)胞中Bcl-2及SIRT1 表達(dá)的影響 與對照組相比，向CNE-2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染入miR-204 mimics 后可將CNE-2 細(xì)胞內(nèi)miR-204 的表達(dá)量升高約(3.403 ± 0.197)倍(圖3A，P＜0.05)。qRT-PCR 及Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)miR-204 顯著下調(diào)了CNE-2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2(1.000 vs 0.303 ± 0.032)及SIRT-1(1.000 vs 0.347 ±0.021)mRNA(圖3B)和蛋白(圖3C)的表達(dá)水平(P＜0.05)。

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其男性發(fā)病率約為20.2/10 萬人，女性為7.8/10 萬人。由于鼻咽癌發(fā)病隱匿，生物學(xué)惡性程度較高，大部分患者就診時(shí)已處于臨床晚期，行單純放射治療的5 年生存率僅為30%左右［10］。隨著放療技術(shù)的進(jìn)步，化療藥物及方案的不斷更新，以放療為主、化療及生物靶向治療相結(jié)合的綜合治療方案，在鼻咽癌的診療中呈現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。然而，腫瘤患者的個(gè)體生物學(xué)差異限制了鼻咽癌患者的初次治療效果，一線方案治療失敗后的補(bǔ)救治療效果亦較差［11］。因而，尋找新的靶向抗腫瘤分子并探究其抗腫瘤機(jī)制，已成為提高化療效果、改善鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)鍵方法之一。

鼻咽癌組織中存在大量microRNA 異常表達(dá)，并在鼻咽癌的生物學(xué)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。例如，miR-320a 在鼻咽癌組織及鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)量均顯著降低，體外過表達(dá)miR-320a 可通過下調(diào)BMI-1的表達(dá)而顯著抑制NPC 細(xì)胞的生長、遷移及侵襲能力［12］;而在1 077 例NPC 組織中的研究發(fā)現(xiàn)［13］，miR-30a 在NPC 組織中的表達(dá)量則較正常鼻黏膜組織明顯升高并與患者不良預(yù)后相關(guān)，體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)miR-30a 通過促進(jìn)NPC 細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。本課題通過研究證實(shí)，miR-204 在NPC 組織中的表達(dá)水平顯著低于對應(yīng)癌旁組織，并且其低表達(dá)狀態(tài)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM 分期等惡性臨床病理特征密切相關(guān)。提示miR-204 在NPC 進(jìn)展中具有重要的調(diào)控作用。

作為一種重要的抑癌分子，miR-204 可通過下調(diào)腫瘤中MEIS1、FOXC1、Mcl-1 等多個(gè)癌基因的表達(dá)水平來發(fā)揮其抗腫瘤作用［14-16］。為進(jìn)一步研究miR-204 在NPC 中的抑癌分子機(jī)制，我們首先在組織學(xué)水平檢測了miR-204 下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2 及SIRT1 的表達(dá)情況，結(jié)果證實(shí)，miR-204 與Bcl-2 及SIRT1 的表達(dá)間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示在NPC 中miR-204 可能對Bcl-2 及SIRT1 發(fā)揮調(diào)控作用。我們進(jìn)而通過體外轉(zhuǎn)染方法，在NPC 細(xì)胞CNE-2 中成功過表達(dá)miR-204，通過qRT-PCR 及Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-204 后CNE-2 細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 及SIRT1 mRNA 及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)。在臨床實(shí)踐中，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方案在NPC 的化療中具有重要作用，新近研究證實(shí)，miR-204 可通過下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)來增強(qiáng)胃癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤對順鉑的化療敏感性［17，18］，本課題研究結(jié)果也表明miR-204 可顯著下調(diào)NPC 腫瘤細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，結(jié)合miR-204 在NPC 組織中的低表達(dá)狀態(tài)，提示miR-204 表達(dá)缺失可能是NPC 患者對鉑類藥物化療耐藥的重要機(jī)制之一。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制之一，在胃癌中的研究表明［19］，miR-204 能夠通過下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)SIRT1 蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控E 鈣黏蛋白、N 鈣黏蛋白等多種EMT 重要分子的表達(dá)水平，最終實(shí)現(xiàn)抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。本課題體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-204 可顯著下調(diào)NPC 細(xì)胞中SIRT1 的表達(dá)水平，組織學(xué)研究表明，miR-204 低表達(dá)與NPC 腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM 分期密切相關(guān)，結(jié)合既往研究結(jié)果可以推測miR-204 可能通過下調(diào)NPC 細(xì)胞中SIRT1 的表達(dá)、抑制腫瘤EMT 來發(fā)揮其抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移作用。

綜上所述，miR-204 在鼻咽癌組織表達(dá)顯著下調(diào)，低表達(dá)miR-204 與鼻咽癌惡性臨床病理特征密切相關(guān)。miR-204 可能通過下調(diào)Bcl-2 及SIRT1 的表達(dá)水平從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。因此，miR-204 在鼻咽癌的診斷及生物分子治療中具有一定的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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