CIA 小鼠血清中IL-27、IL-10、IL-17 的動(dòng)態(tài)分析①

郭亞春 封桂英 宋鴻儒 邢恩鴻 安 高 趙曉菲 (承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性、組織特異性的自身免疫性疾病，盡管很多研究證實(shí)多種細(xì)胞和因子參與了關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和組織破壞，但抗原特異性T 細(xì)胞的激活被認(rèn)為是RA 發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，CD4+T 細(xì)胞作為效應(yīng)T 細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答的各個(gè)階段，在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為Th1/Th2比例失衡在RA 發(fā)病過程中起重要作用［1］，但隨著CD4+T 新亞群Th17/Treg 的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究證實(shí)Th17/Treg 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子的失衡參與了RA 發(fā)病過程［2，3］，IL-27 是調(diào)控Th17/Treg 平衡的重要因子［4］，但在RA 發(fā)病機(jī)制中的作用還未肯定，本研究以雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠為模型，觀察動(dòng)物血清中IL-27、IL-17、IL-10 的動(dòng)態(tài)變化，探討IL-27、IL-17、IL-10 與RA 疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 54 只雄性SPF 級(jí)DBA1/J 小鼠，7～8 周齡，［上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼:SCXK(滬)2012-0002］。所有動(dòng)物于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室均自由飲食，室內(nèi)溫度20℃～25℃，室內(nèi)濕度為70%左右，定時(shí)換氣，保持通風(fēng)，每日光照10 h。

1.1.2 試劑與儀器 雞Ⅱ型膠原(Chondrex 公司)，弗氏完全佐劑(Sigma 公司)，Mouse Th1/Th2/Th17/Th22 13plex(eBioscience 公司)，F(xiàn)low Cytomix Kit，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD 公司)，ESJ200-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 參考文獻(xiàn)［5］，將雞Ⅱ型膠原2 mg/ml 與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑，無菌條件下以每只0.1 ml 的劑量在小鼠背部及尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，第21 天相同劑量加強(qiáng)1次。對(duì)照組按照上述方法注射等量生理鹽水。

1.2.2 關(guān)節(jié)癥狀評(píng)分 參考文獻(xiàn)［6］，用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index，AI)作為判斷模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)，肢體關(guān)節(jié)腫脹按0～Ⅳ級(jí)評(píng)分:0=無紅腫;Ⅰ=趾關(guān)節(jié)稍腫;Ⅱ=趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹;Ⅲ=踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹;Ⅳ=包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI 值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)評(píng)分之和(0 級(jí)為0 分、Ⅰ級(jí)為1 分、Ⅱ級(jí)為2 分、Ⅲ級(jí)為3 分、Ⅳ級(jí)為4 分，總分為16 分)，AI≥4 分為造模成功。AI指數(shù)越高，關(guān)節(jié)炎癥狀越嚴(yán)重。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及取材 54 只DBA1/J 小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組18 只(疾病早中晚期各6 只)和模型組36 只(疾病早中晚期各12 只)。各組小鼠均無菌摘眼球取血，制備血清，-80℃保存。

1.2.4 細(xì)胞因子的檢測(cè) 按試劑盒說明書將樣品中的待測(cè)物與連接有熒光珠的抗體緊密結(jié)合。加入與生物素結(jié)合的第二抗體混合物，特異性抗體與被第一抗體檢測(cè)到的待檢測(cè)物結(jié)合，加入三抗，蛋白鏈霉素-藻紅蛋白與生物素偶聯(lián)物和放射性熒光信號(hào)結(jié)合，通過辨別微球的熒光強(qiáng)度和型號(hào)大小，用Flow cytomix 法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-27、IL-17、IL-10 的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況、足爪腫脹度及AI 值 加強(qiáng)免疫后模型組小鼠活動(dòng)遲緩，進(jìn)食減少，體重較正常組明顯減輕(見表1)，在模型鼠的背部及尾根部形成多處大小不一的潰瘍，至加強(qiáng)后7 d 95%以上模型鼠AI 指數(shù)在4 分以上。在CIA 鼠疾病的早期(加強(qiáng)免疫7 d)，模型鼠足墊增厚，足爪充血紅腫明顯，運(yùn)動(dòng)受限。隨著疾病進(jìn)展，至加強(qiáng)14 天，即疾病中期，足爪充血紅腫達(dá)高峰，不能負(fù)重。至疾病進(jìn)展晚期(加強(qiáng)35 d)，模型鼠足爪充血紅腫明顯減輕，但足墊依然增厚，足爪開始出現(xiàn)畸形，行動(dòng)不便;而正常對(duì)照組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期一般狀態(tài)良好，四肢關(guān)節(jié)無明顯變化。各組小鼠足爪腫脹度動(dòng)態(tài)變化見表2，AI 指數(shù)變化見表3。

2.2 CIA 小鼠血清細(xì)胞因子水平 模型組IL-27 在疾病早期顯著降低(P＜0.05)，直至疾病中期依然下降明顯(P＜0.01)，至疾病晚期開始恢復(fù)，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);模型組IL-17 在疾病早期有增高趨勢(shì)，但與正常組比較無明顯區(qū)別(P ＞0.05)，到疾病中期明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，疾病晚期逐漸下降，與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。IL-10 在CIA 小鼠發(fā)病過程中，模型組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。CIA 小鼠血清細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化見表4。

表1 各組小鼠在疾病不同時(shí)期體重變化情況( ±s，n=6，g)Tab.1 Changes of body weight of mice in each group at different time(±s，n=6，g)

表1 各組小鼠在疾病不同時(shí)期體重變化情況( ±s，n=6，g)Tab.1 Changes of body weight of mice in each group at different time(±s，n=6，g)

Note:1)P＜0.01 vs normal group.

表2 各組小鼠在疾病不同時(shí)期足爪腫脹度變化情況( ±s，n=6，cm)Tab.2 Paws swelling of mice in each group at different time(±s，n=6，cm)

表2 各組小鼠在疾病不同時(shí)期足爪腫脹度變化情況( ±s，n=6，cm)Tab.2 Paws swelling of mice in each group at different time(±s，n=6，cm)

Note:1)P＜0.01 vs normal group.

表3 各組小鼠在疾病不同時(shí)期AI 值動(dòng)態(tài)變化( ±s，n=6)Tab.3 AI of mice in each group at different time(±s，n=6)

表3 各組小鼠在疾病不同時(shí)期AI 值動(dòng)態(tài)變化( ±s，n=6)Tab.3 AI of mice in each group at different time(±s，n=6)

Note:1)P＜0.05 vs normal group.

表4 CIA 小鼠血清細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化(±s，n=6，pg/ml)Tab.4 Changes of cytokines of mice in each group at different time(±s，n=6，pg/ml)

表4 CIA 小鼠血清細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化(±s，n=6，pg/ml)Tab.4 Changes of cytokines of mice in each group at different time(±s，n=6，pg/ml)

Note:1)P＜0.05 ;2)P＜0.01 vs normal group.

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎癥性、組織特異性的自身免疫性疾病，目前為止，其發(fā)病原因并不是很清楚。許多研究表明，免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展。IL-17 是Th17 分泌的主要細(xì)胞因子，Th17 細(xì)胞在RA 中的作用主要靠IL-17 來實(shí)現(xiàn)，本研究也證明了在CIA 小鼠疾病的中期，即關(guān)節(jié)紅腫最嚴(yán)重時(shí)期，IL-17 水平明顯升高，說明IL-17 參與了CIA 小鼠的炎癥反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。IL-17 可能通過單獨(dú)或與TNF-α、IL-1β 等協(xié)同刺激關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8 等炎性因子，IL-17 也可能促進(jìn)滑膜血管新生、軟骨基質(zhì)的破壞等參與RA 的發(fā)?。?］，有文獻(xiàn)表明抑制IL-17 可以改善RA 患者的病情［7］。

Treg 細(xì)胞作為一種專職的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群，在抑制自身免疫性疾病的發(fā)生，維持自身耐受中發(fā)揮重要作用。Treg 通過分泌IL-10 和TGF-β 發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。其中IL-10 是T 細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞的有效抑制因子，也可以抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1 和TNF-α 的釋放，促進(jìn)IL-1 受體拮抗劑和可溶性TNF-α 受體的產(chǎn)生［8］。在RA 中IL-10 可以抑制Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促使Treg的生成，減輕RA 滑膜組織中淋巴細(xì)胞浸潤和破骨細(xì)胞的活化，減輕關(guān)節(jié)腫脹，抑制病變發(fā)展，發(fā)揮明顯的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能［9，10］。也有研究表明RA 患者IL-10 的水平明顯高于對(duì)照組，但與活動(dòng)期組和緩解期組無顯著性差異，說明IL-10 可能參與了RA 的發(fā)?。?1］，本研究發(fā)現(xiàn)在CIA 小鼠整個(gè)病程中IL-10 的變化與正常組比較無明顯區(qū)別，說明在CIA 小鼠的發(fā)病過程中，IL-10 的分泌紊亂可能失去了其有效的保護(hù)性調(diào)節(jié)功能。

IL-27 是屬于IL-12 超家族的細(xì)胞因子，主要由樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞分泌產(chǎn)生，已有的研究證明IL-27 在自身免疫和組織炎癥反應(yīng)中起到雙重的調(diào)控作用，是平衡促炎和抑炎的關(guān)鍵的細(xì)胞因子。IL-27 可以阻止Th2 細(xì)胞的分化而促進(jìn)Th1 細(xì)胞及其細(xì)胞因子的分泌，但在Th1 細(xì)胞高度極化時(shí)，IL-27 可以限制Th1 型免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，從而保護(hù)機(jī)體免受過度的免疫反應(yīng)的損傷［12］，同時(shí)IL-27 可以促進(jìn)Treg 的分化而抑制Th17 的產(chǎn)生，在抑炎方面起重要作用［13］。有研究表明，在膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠(CIA)中，注射IL-27，可以使IL-6 和IL-17 等炎性細(xì)胞因子水平降低，改善關(guān)節(jié)炎的癥狀，另外還有研究表明IL-27 可能在RA 病情加重時(shí)具有免疫病理作用，有可能作為疾病活動(dòng)度的新的替代指標(biāo)，用其作為治療自身免疫性疾病的抑制劑的效果并不樂觀［14］。本研究通過觀察小鼠血清中IL-27 在疾病的發(fā)病過程中動(dòng)態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)在CIA 小鼠關(guān)節(jié)明顯紅腫的早期、中期IL-27 的水平較正常組明顯下降，說明IL-27 可能參與了CIA 小鼠的急性期的炎癥反應(yīng)，其抑炎的免疫調(diào)控功能失調(diào)，其機(jī)制可能在調(diào)節(jié)Th17/Treg及其分泌細(xì)胞因子IL-17、IL-10 平衡的方面出現(xiàn)障礙。而在小鼠關(guān)節(jié)紅腫減弱，關(guān)節(jié)畸形明顯的時(shí)期，IL-27 的水平和正常組無明顯區(qū)別，說明IL-27 有可能和關(guān)節(jié)畸形的發(fā)生有一定的關(guān)系。

綜上所述，免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)參與了RA 的發(fā)生和發(fā)展，不同免疫細(xì)胞及其細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)平衡可能在RA 發(fā)病的不同時(shí)期起不同的作用，研究免疫細(xì)胞及其細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)平衡的調(diào)節(jié)可能為RA 的治療提供新的思路，但關(guān)于IL-27、IL-17、IL-10 的平衡與RA 疾病進(jìn)展關(guān)系的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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