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    非綜合征型唇腭裂患兒血清抗-HCV 化學發(fā)光法出現假陽性的原因分析①

    2015-03-18 11:41:40王菊英周立榮唐秀英寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心銀川750004
    中國免疫學雜志 2015年6期
    關鍵詞:病例抗體綜合征

    王菊英 李 鋒 周立榮 唐秀英 李 莉 (寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心,銀川 750004)

    20 世紀90 年代以來,實驗室診斷丙型肝炎病毒(HCV)感染主要利用基因工程表達的HCV 抗原來測定丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)。本實驗室在日常檢測中發(fā)現,非綜合征型唇腭裂患兒的血清抗-HCV 化學發(fā)光法(CLIA)有反應性樣本的檢出率較高,但均為弱反應性,臨床難以明確診斷。由于丙型病毒性肝炎是一種對患者健康及生命危害較大的疾病,早期明確診斷對其防治至關重要。為此本研究通過以同期、同齡手術患兒為對照,對有反應性病例采用免疫印跡法(RIBA)及熒光定量(FQ-PCR)法確證及追蹤監(jiān)測抗-HCV 來明確其感染狀態(tài),并通過排除高濃度血清免疫球蛋白G(IgG)、類風濕因子(RF)及自身抗體(ANA)等常見影響因素來明確其出現假陽性的原因。以便早期明確診斷,減輕患兒父母的精神及經濟負擔,避免不必要的醫(yī)患糾紛。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 選取2010 年10 月~2014 年5 月,就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院口腔外科的4 050 例非綜合征型唇腭裂住院患兒作為病例組,女孩1 221例,男孩2 829 例,年齡5 個月~3.2 歲,平均年齡(1.5 ±0.8)歲。選取同期8 547 例手術科室住院患兒作為對照組,其中女孩2 565 例,男孩5 982 例,年齡5 個月~3.8 歲,平均年齡(1.6 ±0.9)歲,年齡、性別對比差異均無統(tǒng)計學意義(t=1.32,P >0.05),具有可比性。

    1.2 儀器和試劑 抗-HCV 檢測采用強生VITROS3600 分析儀及其配套試劑;RIBA 試劑盒由新加坡MP 公司提供;HCV-RNA 檢測所用儀器為德國Rotor-Gene Q 擴增儀,試劑盒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供;血清IgG 及RF 檢測采用西門子BNII 分析儀及其配套試劑;ANA 檢測試劑盒由歐蒙(杭州)醫(yī)學實驗診斷有限公司提供。

    1.3 方法

    1.3.1 檢測程序 先采用CLIA 檢測抗-HCV,有反應性病例采用RIBA 及FQ-PCR 確證;病例組有反應性病例采用CLIA 法進行3 個月、6 個月、12 個月及以上抗-HCV 追蹤監(jiān)測至轉陰,分析比較其轉陰前后血清IgG、RF 及ANA 的檢測結果的差異。

    1.3.2 質量保證 方法學進行了性能驗證;室內質控在控;分析程序嚴格執(zhí)行各儀器標準操作規(guī)程(SOP)及檢測項目SOP,標本采集、轉運、保存均嚴格執(zhí)行相應SOP;-20℃保存樣本檢測時恢復室溫后充分混勻;有反應性樣本離心后復檢。

    1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0 軟件統(tǒng)計分析,樣本率應用χ2檢驗,計量資料應用t 檢驗,均以P<0.05 為有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 兩組病例抗-HCV 篩查及確認結果比較 病例組抗-HCV 有反應性檢出率為(1.07%)高于對照組(0.2%),對比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=41.4,P<0.05);病例組抗-HCV 假陽性率為(100%)高于對照組(88.2%),對比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.57,P<0.05),具體見表1。

    2.2 病例組42 例有反應性病例臨床資料 42 例有反應性病例及母親均無輸血史,母親抗-HCV 均為陰性;乙肝全套(HBV-M)檢測結果:HBV-M(-)8例,抗-HBs(+)28 例,抗-HBS(+)+抗-HBc(+)4例(與其母結果相同),抗-HBs(+)+抗-HBe(+)+抗-HC(+)2 例(與其母結果相同);肝功能(AST/ALT)異常有14 例。

    2.3 病例組有反應性病例抗-HCV 追蹤監(jiān)測結果經1 個月~19 個月追蹤監(jiān)測均轉為陰性,轉陰時間隨S/CO 值增大而延長,具體見圖1。

    2.4 病例組42 例有反應性病例轉陰前后相關檢測結果對比 轉陰前后IgG 測定結果最高值均未超出生物參考區(qū)間(7.16 g/L)上限,轉陰前后比對差異無統(tǒng)計學意義(t=1.71,P >0.05),RF 轉陰前后所有測定值均為10.7 U/ml,ANA 均為陰性,具體見表2。

    表1 兩組病例HCV 感染篩查及確證結果Tab.1 Results of HCV infective screening and confirming test

    表2 42 例有反應性病例轉陰前后檢測結果(IgG,±s)Tab.2 Results of 42 reactive cases during transformation(IgG,±s)

    表2 42 例有反應性病例轉陰前后檢測結果(IgG,±s)Tab.2 Results of 42 reactive cases during transformation(IgG,±s)

    圖1 唇腭裂患者抗-HCV S/CO 值與所需轉陰時間關系Fig.1 Relation between anti-HCV S/CO and time to be negative in cleft lip and palate patients

    3 討論

    CLIA 是將具有高度敏感的化學發(fā)光測量技術與高度特異性的免疫反應相結合的檢測技術。應用CLIA 檢測血清抗-HCV 敏感、特異、穩(wěn)定性好,適合臨床推廣應用[1]。但本研究42 例抗-HCV 弱反應性非綜合征型唇腭裂病例經RIBA 及HCVRNA 檢測均為陰性,所以抗-HCV 檢測弱反應性并不能確診丙肝,應同時加做RIBA 試驗[2,3]或進行HCVRNA檢測[4]。

    關于HCV 抗體檢測的影響因素,國內外文獻報道大多針對ELISA 方法,而化學發(fā)光法的影響因素報道很少,ELISA 影響因素主要有[5-7]:樣本溶血、脂血、黃疸、凝固不全等外源性因素;操作影響;內源性物質干擾,如類風濕因子、高濃度免疫球蛋白、自身抗體、超氧化物歧化酶等;試劑抗原不純、多克隆抗體和酶結合物純度低等。本研究依據以上影響因素,對非綜合征型唇腭裂患兒抗-HCV CLIA 法出現假陽性的原因進行了求證。

    (1)外源性及操作因素。本研究抗-HCV 檢測所使用儀器為VITROS3600 全自動酶免分析儀,有經過培訓的專業(yè)人員操作,儀器使用前進行了性能驗證,檢測及維護保養(yǎng)均嚴格執(zhí)行相應的標準操作規(guī)程,每日進行質控監(jiān)測。另外,該分析儀具有INTELLICHECK 技術,可有效監(jiān)測樣本性狀(溶血、凝固不全、脂血)、樣本及試劑加樣量、洗滌程度、孵育溫度等整個分析過程,故可避免加樣不準確、孵育溫度有波動、時間不精確等系統(tǒng)誤差,同時弱反應性樣本均進行了離心后復檢,因此有效避免了偶然誤差。

    (2)針對內源性物質干擾,本研究進行了轉陰前后血清IgG、RF 及ANA 比對,對比差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05),說明假陽性的影響因素不在研究范圍。也有文獻報道高滴度抗HBc-IgG 致抗-HCV測定結果假陽性[8],但本研究中HBc-IgG 陽性病例僅為14.3%(6/42),且其血清IgG 均未超出生物參考區(qū)間上限,不至于造成假陽性。

    (3)試劑本身的原因。本研究病例組假陽性率為100%,對照組假陽性率為88.2%(兩組病例有反應性樣本S/CO 值均<8),這與王正芳等報道[9]當S/CO 值<12 時,所有檢測樣本經RIBA 確證陽性率僅為6.5%基本一致,說明CLIA 法弱反應性樣本中存在大量假陽性,這可能與抗原、多克隆抗體或酶結合物純度低等有關[9]。但病例組抗-HCV 有反應性檢出率及假陽性率均高于對照組,對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),又說明他們之間引起假陽性的影響因素還是存在一定的差異。有文獻報道非綜合征性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異[10,11],宋具昆等[10]研究認為至少存在3 種以上的不同的代謝產物,分別為三羥丁酸甲基類物質、精氨酸和纈氨酸等。非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝產物以纈氨酸和三羥丁酸甲基類物質為主,而正常人血漿代謝產物則以精氨酸為主;黃光磊等[11]研究表明至少存在4 種不同代謝產物,分別為天門冬素、門冬氨酸、肌酐、脯氨酸、膽堿、絡氨酸。非綜合征型唇腭裂患者血漿代謝產物以天門冬素、門冬氨酸及絡氨酸為主,而正常人血漿代謝產物以膽堿、肌酐及脯氨酸為主。雖然非綜合征型唇腭裂病例較易出現抗-HCV 假陽性的原因尚不清楚,試想是否可歸因于他們的代謝產物與HCV 抗原存在相似的表位,其刺激機體產生的抗體與試劑HCV 抗原發(fā)生了交叉反應?抑或是這些異常蛋白質干擾了CLIA 反應?經過手術矯正康復后其血漿代謝恢復正常致抗-HCV 轉陰?確切的原因尚待進一步研究。為什么不是所有非綜合征型唇腭裂病例均為抗-HCV CLIA有反應性呢?其因為免疫學反應中只有抗原抗體比例合適時才能呈現有反應性。

    鑒于非綜合征性唇腭裂患兒抗-HCV CLIA 弱反應性樣本中存在大量的假陽性,故實驗室在結果報告時要慎重,尤其遇到像研究病例中的14 例肝功能異常的有反應性病例,檢測者很容易將其作為實驗室診斷依據報告為陽性。中國社科院發(fā)布報告指出我國中西部和農村醫(yī)療資源與東部相比差距較大[12],中西部一些邊遠或經濟不發(fā)達地區(qū)還沒有條件開展RIBA 和HCV RNA 試驗。不過,本研究42 例抗-HCV弱反應性病例經1 個月~19 個月追蹤監(jiān)測均轉為陰性,表明如果檢測結果S/CO 值<8.0、患者無輸血史、垂直傳播史、乙型肝炎病毒感染史等,對其進行血清抗-HCV 追蹤監(jiān)測無疑是切實可行的辦法。

    [1]曾艷華,孟存仁,張朝霞,等.化學發(fā)光法檢測HCV 抗體診斷丙型肝炎價值的Meta 分析[J].中國循證醫(yī)學雜志,2014,14(6):246-247.

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    [12]程錦錐,朱恒鵬.中國藥品市場報告[M].北京:社會科學文獻出版社,2012:1-348.

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