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    腹股溝皮下注射法免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究

    2015-03-18 11:41:40趙振安趙婉君王青云曹忠勝蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科蘇州215004
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2015年6期
    關(guān)鍵詞:洗液免疫治療生理鹽水

    趙振安 戴 吉 趙婉君 王青云 曹忠勝 (蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科,蘇州 215004)

    變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后由IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放,并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?]。目前,特異性免疫治療(Specific immunotherapy,SIT)是唯一對(duì)因治療AR 的方法,其臨床治療周期長(zhǎng),患者依從性差,機(jī)理也不完全清楚[2]。因此,尋找快速可行的SIT 方法是非常必要的。本研究通過(guò)建立AR 動(dòng)物模型用腹股溝皮下注射方法進(jìn)行SIT,以期縮短SIT 周期,探討其可行性。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 卵清蛋白(OVA),購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;氫氧化鋁凝膠,購(gòu)自Thermo 公司;小鼠IL-4和IFN-γ ELISA 試劑盒,購(gòu)自ebioscience 公司;小鼠OVA-sIgE ELISA 試劑盒購(gòu)自Cusabio 公司。

    1.2 動(dòng)物 36 只清潔級(jí)雌性BALB/c 小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量16.5~17.2 g,購(gòu)自蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司(SCXK 2009-0001)。

    1.3 建立模型 參照Z(yǔ)heng 等[3]的方法建立AR模型,然后進(jìn)行治療。將小鼠隨機(jī)分為6 組,分別為A 空白組,A 模型組,A 治療組,B 空白組,B 模型組,B 治療組(A 為腹股溝皮下注射,B 為頸背部皮下注射)。致敏階段:模型組和治療組,每組給予0.1 mg OVA+2 mg 氫氧化鋁凝膠,用生理鹽水共配成0.3 ml,分別在0、7、14 d 進(jìn)行腹腔注射,空白組用等體積生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。第21~24 天進(jìn)行鼻腔激發(fā),空白組用20 μl 生理鹽水激發(fā),其余各組都用0.4 mg OVA 溶于20 μl 的生理鹽水進(jìn)行激發(fā)。第25~55 天,隔天一次,共15 次,脫敏治療。A 治療組給予0.5 mg 的OVA,溶于0.1 ml 的生理鹽水進(jìn)行腹股溝皮下注射。B 治療組給予0.5 mg的OVA,溶于0.1 ml 的生理鹽水進(jìn)行頸背部皮下注射。A 空白組和模型組腹股溝皮下注射等體積的生理鹽水,B 空白組和模型組頸背部皮下注射等體積的生理鹽水。頸背部注射方法:將小鼠頸背部皮膚提起形成一個(gè)窩,然后于形成的窩處45°角進(jìn)針,回抽無(wú)血即可推注。腹股溝注射方法:將小鼠腹股溝皮膚提起,約45°角進(jìn)針,有落空感,回抽如無(wú)血液即可推注。第56~62 天進(jìn)行鼻腔激發(fā),除空白組用等體積生理鹽水激發(fā)外其余各組溶于20 μl 生理鹽水的0.4 mg 的OVA 進(jìn)行激發(fā)。治療的劑量和時(shí)間是綜合其他研究者的方法選取的[4-7]。治療期間所有小鼠狀態(tài)良好,無(wú)一死亡。

    1.4 癥狀評(píng)分 用移液器將OVA 溶液滴于雙側(cè)前鼻孔,每側(cè)10 μl,維持致敏狀態(tài),每次鼻腔致敏后10 min 內(nèi),記錄小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況,按照鼻炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠是否有發(fā)生變應(yīng)性鼻炎。(1)鼻癢:輕度,輕擦鼻幾次,1 分;重度,撓鼻面不止,到處擦磨,3 分;介于兩者之間,2 分;(2)噴嚏:1~3 個(gè)1 分,4~10 個(gè)2 分,11 個(gè)以上3 分;(3)清涕:流至前鼻孔1 分,超過(guò)前鼻孔2 分,流涕滿面3 分;采用疊加量化計(jì)分法計(jì)分[8]。

    1.5 標(biāo)本采集 最后一次激發(fā)24 h 后進(jìn)行取材。麻醉后摘除眼球放血,進(jìn)行鼻腔灌洗,每只用1 ml 生理鹽水。保留灌洗液;取鼻中隔黏膜,液氮保存。血液室溫靜置1~2 h 后,3 000 r/min,離心15 min,取上清。鼻腔灌洗液,12 000 r/min,離心5 min,取上清。所有上清立即凍于-80℃冰箱。鼻黏膜取出后立即固定于4%的多聚甲醛,4℃,48 h,石蠟包埋,切片。

    1.6 HE 染色和變色酸2R 染色[9]HE 染色觀察小鼠鼻黏膜組織學(xué)狀況,變色酸2R 染色可以特異性的將EOS 的胞漿染成粉紅或鮮紅色[9],方便計(jì)數(shù)EOS。對(duì)小鼠鼻黏膜EOS 變色酸2R 染色分別選取5 個(gè)高倍鏡(×100)視野,進(jìn)行EOS 計(jì)數(shù)。

    1.7 ELISA 實(shí)驗(yàn) ELISA 法檢測(cè)血清OVA-sIgE、鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的濃度,并計(jì)算IFN-γ 與IL-4 的比率。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s 表示,兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn),三組或三組以上均數(shù)比較采用F 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 癥狀評(píng)分 小鼠AR 癥狀評(píng)分。未治療前,A模型組、B 模型組和治療組小鼠激發(fā)后第2 天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀,總分大于5分,表明造模成功。對(duì)照組都無(wú)典型癥狀,偶有抓撓表現(xiàn),總分小于5 分。治療之后激發(fā),第5 天開(kāi)始A模型組、B 模型組和B 治療組出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀,A 治療組癥狀比較輕。第7 天,記錄鼻腔激發(fā)后10 min 內(nèi),小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況,進(jìn)行記分。結(jié)果顯示,A 治療組小鼠的癥狀明顯改善,評(píng)分小于5 分。前后兩次分別記錄小鼠癥狀評(píng)分?jǐn)?shù)(見(jiàn)圖1)。

    2.2 鼻黏膜的HE 染色和變色酸2R 染色 HE 染色觀察鼻黏膜基本組織學(xué)狀態(tài),見(jiàn)圖2。變色酸2R染色可以特異性的對(duì)EOS 進(jìn)行染色,以便計(jì)數(shù),見(jiàn)圖3。

    2.3 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 的計(jì)數(shù) 見(jiàn)表1和圖4。模型組與空白組相比,P<0.05,差異

    分別都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明AR 建模是成功的;A 治療組與A 模型組相比,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明腹股溝皮下注射法有效;B 治療組與B 模型組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明背部皮下注射法效果不佳。

    圖1 小鼠的癥狀評(píng)分Fig.1 Symptom scores were documented in mice

    圖2 顯微鏡下鼻黏膜HE 染色(×40)Fig.2 Hematoxylin-eosin(HE)staining(×40)

    圖3 顯微鏡下鼻黏膜變色酸2R 染色(×100)Fig.3 Dye of chromotropic acid 2R(×100)

    表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

    表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

    Note:Model group compared with the control group,1)P<0.05;Treatment A group compared with the model A group,2)P<0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

    表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

    表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

    Note:The OVA-sIgE concentration of control groups showed negative,other showed positive.

    表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice,ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

    表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice,ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

    Note:Model group compared with the control group,1)P<0.05;treatment A group compared with the model A group,2)P<0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

    2.4 小鼠外周血OVA-sIgE 在各組之間的變化趨勢(shì)見(jiàn)表2。

    2.5 小鼠鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的水平 見(jiàn)表3 和圖5~7。A、B 模型組各項(xiàng)指標(biāo)差異甚小,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A 治療組與A 模型組相比,IL-4和IFN-γ 濃度明顯的降低,IFN-γ/IL-4 的比值明顯的升高,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明腹股溝皮下治療有效。而B(niǎo) 治療組與B 模型組相比,各項(xiàng)指標(biāo)差異非常小,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明背部皮下治療效果不佳。

    圖4 小鼠鼻黏膜EOS 計(jì)數(shù)Fig.4 Count of EOS in nasal mucosa of mice

    圖5 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 的濃度Fig.5 Concentration of IL-4 in nasal lavage

    圖6 各組小鼠鼻腔灌洗液中IFN-γ 的濃度比較Fig.6 Concentration of IFN-γ in nasal lavage

    圖7 IFN-γ/IL-4 的比值Fig.7 Ratio of interferon-γ and interleukin-4

    3 討論

    AR 嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,目前,SIT 是唯一可改變AR 自然進(jìn)程的對(duì)因治療方法。但SIT周期需要3~5 年,患者常常不能堅(jiān)持治療,所以希望有更好的治療方法,既有效療程又短。

    應(yīng)用動(dòng)物模型是快捷研究AR 的SIT 的重要途徑。目前比較成熟的AR 動(dòng)物模型是OVA 致敏模型[10]。常見(jiàn)的OVA-SIT 方法包括頸背部皮下注射治療,例如,Yoon-Seok 等[11]在研究小鼠背部皮下免疫治療適宜的時(shí)間和劑量時(shí)證明,小鼠在OVA 320 μg/次,治療16~24 次時(shí)治療效果和安全性比較好,而超過(guò)OVA 600 μg/次時(shí)部分小鼠不太活躍;舌下含服治療,例如Mascarell 等[12]研究小鼠巨噬樣細(xì)胞在舌下免疫治療中的作用,模型建立方法是將小鼠麻醉后給予舌下含服OVA 500 μg/次,治療16 次。頸背部皮下治療方式相對(duì)比較簡(jiǎn)單,但治療周期長(zhǎng);舌下含服治療,需要將動(dòng)物麻醉,然后舌下給藥,整個(gè)過(guò)程比較繁瑣,需要掌握好麻醉劑的用量,而且舌下含服變應(yīng)原的利用率不穩(wěn)定,可能會(huì)被隨時(shí)吞咽,治療時(shí)間也長(zhǎng)。目前,對(duì)于AR 的SIT,腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射法逐漸得到認(rèn)可,例如Gabriela Senti 等[13]對(duì)貓過(guò)敏的AR 患者腹股溝淋巴管內(nèi)注射變應(yīng)原提取液進(jìn)行SIT,分3 次進(jìn)行,每月一次,治療后患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)。但是需要超聲的引導(dǎo)才能進(jìn)行,操作較困難,至于起效的原理還不清楚,只能推測(cè)與淋巴結(jié)有關(guān),可能由于免疫反應(yīng)發(fā)起在二級(jí)淋巴器官(Secondary lymphoid organs,SLOs),包括淋巴結(jié)、脾白髓和組織與黏膜相關(guān)淋巴組織器官。SLOs 突出的特點(diǎn)是它們能夠幫助免疫細(xì)胞建立一個(gè)有效的免疫應(yīng)答[14]。所以我們推測(cè)腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富,進(jìn)行腹股溝皮下注射后變應(yīng)原會(huì)較快達(dá)到淋巴結(jié)進(jìn)而較快產(chǎn)生療效。綜合其他研究者頸背部皮下注射和舌下含服治療的用藥劑量,我們進(jìn)行了頸背部和腹股溝皮下注射治療。其中,IgE是判斷AR 的標(biāo)志性因子;EOS 是AR 主要效應(yīng)細(xì)胞,EOS 浸潤(rùn)的多少可以間接判斷AR 的嚴(yán)重程度;IFN-γ 是Th1 細(xì)胞標(biāo)志性的因子,IL-4 是Th2 標(biāo)志性的細(xì)胞因子,正常情況下,Th1/Th2 處于平衡狀態(tài),當(dāng)發(fā)生AR 時(shí),兩者之間的比例失衡,即Th2 >Th1。而SIT 治療AR 的基本原理就是通過(guò)抑制Th2免疫反應(yīng)和刺激Th1 免疫反應(yīng),達(dá)到治療目的。所以通過(guò)檢測(cè)IL-4/IFN-γ 的比值,可以反映SIT 的效果[15,16]。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠的AR 癥狀評(píng)分大于5,血清中OVA-sIgE 和IL-4 明顯增高而IFN-γ 明顯下降,并且鼻黏膜EOS 數(shù)明顯增加,具有明顯的Th2 反應(yīng)優(yōu)勢(shì),表明AR 建模成功。OVA 免疫治療30 d 后,A 治療組小鼠癥狀評(píng)分小于5,而B(niǎo) 治療組癥狀評(píng)分仍大于5,說(shuō)明A 治療比B治療有效且起效時(shí)間快。相對(duì)于模型組和B 治療組,A 治療組小鼠血清中IFN-γ/IL-4 的比值明顯增高,變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)出現(xiàn)明顯減少,差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明A 治療有效抑制了Th2 免疫反應(yīng)而刺激了Th1 免疫反應(yīng),達(dá)到了治療目的。A 治療組效果比較好的原因可能是腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富,變應(yīng)原會(huì)較快吸收達(dá)到SLOs 產(chǎn)生免疫應(yīng)答,相對(duì)縮短了治療時(shí)間,而B(niǎo) 治療組變應(yīng)原的注射部位遠(yuǎn)離淋巴結(jié),所以起效慢。

    綜上所述,腹股溝皮下注射免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎效果好,周期短,操作簡(jiǎn)單,可行性好,是特異性免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎的一種新方法。

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