腹股溝皮下注射法免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究

趙振安 戴 吉 趙婉君 王青云 曹忠勝 (蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，蘇州 215004)

變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后由IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放，并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾?。?］。目前，特異性免疫治療(Specific immunotherapy，SIT)是唯一對(duì)因治療AR 的方法，其臨床治療周期長(zhǎng)，患者依從性差，機(jī)理也不完全清楚［2］。因此，尋找快速可行的SIT 方法是非常必要的。本研究通過(guò)建立AR 動(dòng)物模型用腹股溝皮下注射方法進(jìn)行SIT，以期縮短SIT 周期，探討其可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 卵清蛋白(OVA)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;氫氧化鋁凝膠，購(gòu)自Thermo 公司;小鼠IL-4和IFN-γ ELISA 試劑盒，購(gòu)自ebioscience 公司;小鼠OVA-sIgE ELISA 試劑盒購(gòu)自Cusabio 公司。

1.2 動(dòng)物 36 只清潔級(jí)雌性BALB/c 小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量16.5～17.2 g，購(gòu)自蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司(SCXK 2009-0001)。

1.3 建立模型 參照Z(yǔ)heng 等［3］的方法建立AR模型，然后進(jìn)行治療。將小鼠隨機(jī)分為6 組，分別為A 空白組，A 模型組，A 治療組，B 空白組，B 模型組，B 治療組(A 為腹股溝皮下注射，B 為頸背部皮下注射)。致敏階段:模型組和治療組，每組給予0.1 mg OVA+2 mg 氫氧化鋁凝膠，用生理鹽水共配成0.3 ml，分別在0、7、14 d 進(jìn)行腹腔注射，空白組用等體積生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。第21～24 天進(jìn)行鼻腔激發(fā)，空白組用20 μl 生理鹽水激發(fā)，其余各組都用0.4 mg OVA 溶于20 μl 的生理鹽水進(jìn)行激發(fā)。第25～55 天，隔天一次，共15 次，脫敏治療。A 治療組給予0.5 mg 的OVA，溶于0.1 ml 的生理鹽水進(jìn)行腹股溝皮下注射。B 治療組給予0.5 mg的OVA，溶于0.1 ml 的生理鹽水進(jìn)行頸背部皮下注射。A 空白組和模型組腹股溝皮下注射等體積的生理鹽水，B 空白組和模型組頸背部皮下注射等體積的生理鹽水。頸背部注射方法:將小鼠頸背部皮膚提起形成一個(gè)窩，然后于形成的窩處45°角進(jìn)針，回抽無(wú)血即可推注。腹股溝注射方法:將小鼠腹股溝皮膚提起，約45°角進(jìn)針，有落空感，回抽如無(wú)血液即可推注。第56～62 天進(jìn)行鼻腔激發(fā)，除空白組用等體積生理鹽水激發(fā)外其余各組溶于20 μl 生理鹽水的0.4 mg 的OVA 進(jìn)行激發(fā)。治療的劑量和時(shí)間是綜合其他研究者的方法選取的［4-7］。治療期間所有小鼠狀態(tài)良好，無(wú)一死亡。

1.4 癥狀評(píng)分 用移液器將OVA 溶液滴于雙側(cè)前鼻孔，每側(cè)10 μl，維持致敏狀態(tài)，每次鼻腔致敏后10 min 內(nèi)，記錄小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況，按照鼻炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠是否有發(fā)生變應(yīng)性鼻炎。(1)鼻癢:輕度，輕擦鼻幾次，1 分;重度，撓鼻面不止，到處擦磨，3 分;介于兩者之間，2 分;(2)噴嚏:1～3 個(gè)1 分，4～10 個(gè)2 分，11 個(gè)以上3 分;(3)清涕:流至前鼻孔1 分，超過(guò)前鼻孔2 分，流涕滿面3 分;采用疊加量化計(jì)分法計(jì)分［8］。

1.5 標(biāo)本采集 最后一次激發(fā)24 h 后進(jìn)行取材。麻醉后摘除眼球放血，進(jìn)行鼻腔灌洗，每只用1 ml 生理鹽水。保留灌洗液;取鼻中隔黏膜，液氮保存。血液室溫靜置1～2 h 后，3 000 r/min，離心15 min，取上清。鼻腔灌洗液，12 000 r/min，離心5 min，取上清。所有上清立即凍于-80℃冰箱。鼻黏膜取出后立即固定于4%的多聚甲醛，4℃，48 h，石蠟包埋，切片。

1.6 HE 染色和變色酸2R 染色［9］HE 染色觀察小鼠鼻黏膜組織學(xué)狀況，變色酸2R 染色可以特異性的將EOS 的胞漿染成粉紅或鮮紅色［9］，方便計(jì)數(shù)EOS。對(duì)小鼠鼻黏膜EOS 變色酸2R 染色分別選取5 個(gè)高倍鏡(×100)視野，進(jìn)行EOS 計(jì)數(shù)。

1.7 ELISA 實(shí)驗(yàn) ELISA 法檢測(cè)血清OVA-sIgE、鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的濃度，并計(jì)算IFN-γ 與IL-4 的比率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s 表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，三組或三組以上均數(shù)比較采用F 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀評(píng)分 小鼠AR 癥狀評(píng)分。未治療前，A模型組、B 模型組和治療組小鼠激發(fā)后第2 天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀，總分大于5分，表明造模成功。對(duì)照組都無(wú)典型癥狀，偶有抓撓表現(xiàn)，總分小于5 分。治療之后激發(fā)，第5 天開(kāi)始A模型組、B 模型組和B 治療組出現(xiàn)明顯的噴嚏、抓撓鼻和流涕癥狀，A 治療組癥狀比較輕。第7 天，記錄鼻腔激發(fā)后10 min 內(nèi)，小鼠鼻涕量、噴嚏次數(shù)及搔鼻情況，進(jìn)行記分。結(jié)果顯示，A 治療組小鼠的癥狀明顯改善，評(píng)分小于5 分。前后兩次分別記錄小鼠癥狀評(píng)分?jǐn)?shù)(見(jiàn)圖1)。

2.2 鼻黏膜的HE 染色和變色酸2R 染色 HE 染色觀察鼻黏膜基本組織學(xué)狀態(tài)，見(jiàn)圖2。變色酸2R染色可以特異性的對(duì)EOS 進(jìn)行染色，以便計(jì)數(shù)，見(jiàn)圖3。

2.3 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 的計(jì)數(shù) 見(jiàn)表1和圖4。模型組與空白組相比，P＜0.05，差異

分別都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明AR 建模是成功的;A 治療組與A 模型組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明腹股溝皮下注射法有效;B 治療組與B 模型組相比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明背部皮下注射法效果不佳。

圖1 小鼠的癥狀評(píng)分Fig.1 Symptom scores were documented in mice

圖2 顯微鏡下鼻黏膜HE 染色(×40)Fig.2 Hematoxylin-eosin(HE)staining(×40)

圖3 顯微鏡下鼻黏膜變色酸2R 染色(×100)Fig.3 Dye of chromotropic acid 2R(×100)

表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

表1 小鼠鼻黏膜變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)(±s)Tab.1 Count of EOS in nasal mucosa of mice after dye of chromotropic acid 2R(±s)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.05;Treatment A group compared with the model A group，2)P＜0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

表2 各組小鼠血清中OVA-sIgE 的OD 值(±s)Tab.2 OD value of OVA-sIgE in mice serum(±s)

Note:The OVA-sIgE concentration of control groups showed negative，other showed positive.

表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice，ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

表3 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 和IFN-γ 的濃度及IFN-γ/IL-4 的比值(±s)Tab.3 Concentration of IL-4 and IFN-γ in nasal lavage in mice，ratio of interferon-γ and interleukin-4(±s)

Note:Model group compared with the control group，1)P＜0.05;treatment A group compared with the model A group，2)P＜0.05.There was no difference between treatment B group and model B group.

2.4 小鼠外周血OVA-sIgE 在各組之間的變化趨勢(shì)見(jiàn)表2。

2.5 小鼠鼻腔灌洗液IL-4 和IFN-γ 的水平 見(jiàn)表3 和圖5～7。A、B 模型組各項(xiàng)指標(biāo)差異甚小，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A 治療組與A 模型組相比，IL-4和IFN-γ 濃度明顯的降低，IFN-γ/IL-4 的比值明顯的升高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明腹股溝皮下治療有效。而B(niǎo) 治療組與B 模型組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異非常小，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明背部皮下治療效果不佳。

圖4 小鼠鼻黏膜EOS 計(jì)數(shù)Fig.4 Count of EOS in nasal mucosa of mice

圖5 各組小鼠鼻腔灌洗液中IL-4 的濃度Fig.5 Concentration of IL-4 in nasal lavage

圖6 各組小鼠鼻腔灌洗液中IFN-γ 的濃度比較Fig.6 Concentration of IFN-γ in nasal lavage

圖7 IFN-γ/IL-4 的比值Fig.7 Ratio of interferon-γ and interleukin-4

3 討論

AR 嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，目前，SIT 是唯一可改變AR 自然進(jìn)程的對(duì)因治療方法。但SIT周期需要3～5 年，患者常常不能堅(jiān)持治療，所以希望有更好的治療方法，既有效療程又短。

應(yīng)用動(dòng)物模型是快捷研究AR 的SIT 的重要途徑。目前比較成熟的AR 動(dòng)物模型是OVA 致敏模型［10］。常見(jiàn)的OVA-SIT 方法包括頸背部皮下注射治療，例如，Yoon-Seok 等［11］在研究小鼠背部皮下免疫治療適宜的時(shí)間和劑量時(shí)證明，小鼠在OVA 320 μg/次，治療16～24 次時(shí)治療效果和安全性比較好，而超過(guò)OVA 600 μg/次時(shí)部分小鼠不太活躍;舌下含服治療，例如Mascarell 等［12］研究小鼠巨噬樣細(xì)胞在舌下免疫治療中的作用，模型建立方法是將小鼠麻醉后給予舌下含服OVA 500 μg/次，治療16 次。頸背部皮下治療方式相對(duì)比較簡(jiǎn)單，但治療周期長(zhǎng);舌下含服治療，需要將動(dòng)物麻醉，然后舌下給藥，整個(gè)過(guò)程比較繁瑣，需要掌握好麻醉劑的用量，而且舌下含服變應(yīng)原的利用率不穩(wěn)定，可能會(huì)被隨時(shí)吞咽，治療時(shí)間也長(zhǎng)。目前，對(duì)于AR 的SIT，腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射法逐漸得到認(rèn)可，例如Gabriela Senti 等［13］對(duì)貓過(guò)敏的AR 患者腹股溝淋巴管內(nèi)注射變應(yīng)原提取液進(jìn)行SIT，分3 次進(jìn)行，每月一次，治療后患者癥狀明顯好轉(zhuǎn)。但是需要超聲的引導(dǎo)才能進(jìn)行，操作較困難，至于起效的原理還不清楚，只能推測(cè)與淋巴結(jié)有關(guān)，可能由于免疫反應(yīng)發(fā)起在二級(jí)淋巴器官(Secondary lymphoid organs，SLOs)，包括淋巴結(jié)、脾白髓和組織與黏膜相關(guān)淋巴組織器官。SLOs 突出的特點(diǎn)是它們能夠幫助免疫細(xì)胞建立一個(gè)有效的免疫應(yīng)答［14］。所以我們推測(cè)腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富，進(jìn)行腹股溝皮下注射后變應(yīng)原會(huì)較快達(dá)到淋巴結(jié)進(jìn)而較快產(chǎn)生療效。綜合其他研究者頸背部皮下注射和舌下含服治療的用藥劑量，我們進(jìn)行了頸背部和腹股溝皮下注射治療。其中，IgE是判斷AR 的標(biāo)志性因子;EOS 是AR 主要效應(yīng)細(xì)胞，EOS 浸潤(rùn)的多少可以間接判斷AR 的嚴(yán)重程度;IFN-γ 是Th1 細(xì)胞標(biāo)志性的因子，IL-4 是Th2 標(biāo)志性的細(xì)胞因子，正常情況下，Th1/Th2 處于平衡狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生AR 時(shí)，兩者之間的比例失衡，即Th2 ＞Th1。而SIT 治療AR 的基本原理就是通過(guò)抑制Th2免疫反應(yīng)和刺激Th1 免疫反應(yīng)，達(dá)到治療目的。所以通過(guò)檢測(cè)IL-4/IFN-γ 的比值，可以反映SIT 的效果［15，16］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠的AR 癥狀評(píng)分大于5，血清中OVA-sIgE 和IL-4 明顯增高而IFN-γ 明顯下降，并且鼻黏膜EOS 數(shù)明顯增加，具有明顯的Th2 反應(yīng)優(yōu)勢(shì)，表明AR 建模成功。OVA 免疫治療30 d 后，A 治療組小鼠癥狀評(píng)分小于5，而B(niǎo) 治療組癥狀評(píng)分仍大于5，說(shuō)明A 治療比B治療有效且起效時(shí)間快。相對(duì)于模型組和B 治療組，A 治療組小鼠血清中IFN-γ/IL-4 的比值明顯增高，變色酸2R 染色EOS 計(jì)數(shù)出現(xiàn)明顯減少，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明A 治療有效抑制了Th2 免疫反應(yīng)而刺激了Th1 免疫反應(yīng)，達(dá)到了治療目的。A 治療組效果比較好的原因可能是腹股溝淋巴管和淋巴結(jié)豐富，變應(yīng)原會(huì)較快吸收達(dá)到SLOs 產(chǎn)生免疫應(yīng)答，相對(duì)縮短了治療時(shí)間，而B(niǎo) 治療組變應(yīng)原的注射部位遠(yuǎn)離淋巴結(jié)，所以起效慢。

綜上所述，腹股溝皮下注射免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎效果好，周期短，操作簡(jiǎn)單，可行性好，是特異性免疫治療小鼠變應(yīng)性鼻炎的一種新方法。

［1］中華耳鼻喉科頭頸外科雜志編輯委員會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻喉科分會(huì).變應(yīng)性鼻炎的治療原則和推薦方案(2004 年，蘭州)［J］.中華耳鼻喉科頭頸外科雜志，2005，40(3):166-167.

［2］Larche M，Akdis CA，Valenta R，et al.Immunological mechanisms of allergen-specific immunotherapy［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(10):761-771.

［3］Wang M，Shi P，Chen B，et al.Super antigen induced glucoco-rticoid insensitivity in the recurrence of chronic rhinosinusitis with nasal polyps［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2011，145(5):717-722.

［4］Osamu K，Kazuya S，Akio M，et al.Effect of sublingual immunotherapy on antigen-induced bronchial and nasal inflammation in mice［J］.Int Arch Allergy Immunol，2010，152:75-78.

［5］Mascarell L，Saint-Lu N，Moussu H，et al.Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice［J］.Mucosal Immunol，2011，4(6):638-47.

［6］Chang YS，Kim YK，Kim SH，et al.Murine subcutaneous immunotherapy models with beneficial immunological and physiological effects［J］.Asia Pac Allergy，2013，3(1):50-58.

［7］劉曉宇，張 強(qiáng)，劉志剛，等.粉塵螨疫苗免疫治療過(guò)敏性鼻炎小鼠鼻黏膜的電鏡觀察［J］.江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，35(5):533-535.

［8］趙秀杰，董 震，楊占泉，等.鼻超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕ⅲ跩］.中華耳鼻咽喉科雜志，1993，28(1):17-18.

［9］劉畢超，張 羅.特殊染色法標(biāo)記鼻息肉中的嗜酸性粒細(xì)胞［J］.中國(guó)耳鼻咽喉頭頸科，2004，11(4):257-258

［10］程付偉，張維天，殷善開(kāi)，等.白細(xì)胞介素22 治療變應(yīng)性鼻炎小鼠的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2013，21(5):329-333.

［11］Yoon-Seok C，Yoon-Keun K，Sae-Hoon K，et al.Murine subcutaneous immunotherapy models with beneficial immunological and physiological effects［J］.Asia Pac Allergy，2013，3(1):50-58.

［12］Mascarell L，Saint-Lu N，Moussu H，et al.Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice［J］.Mucosal Immunol，2011，4(6):638-647.

［13］Senti G，Crameri R，Kuster D，et al.Intralymphatic immuno-therapy for cat allergy induces tolerance after only 3 injections［J］.J Allergy Clin Immunol，2012，129(5):1290-1296.

［14］Hylander T，Latif L，Petersson-Westin U，et al.Intralymphatic allergen-specific immunotherapy:An effective and safe alternative treatment route for pollen-induced allergic rhinitis［J］.J Allergy Clin Immunol，2013，131(2):412-420.

［15］Ebner C，Siemann U，Bohle B，et al.Immunological changes during specific immunotherapy of grass pollen allergy:reduced lymphoproliferative responses to allergen and shift from TH2 to TH1 in T-cell clones specific for Phl p 1，a major grass pollen allergen［J］.J Clin Exp Allergy，1997，27(9):1007-1015.

［16］尤少華，張 靜，籍靈超，等.變應(yīng)性鼻炎特異性免疫治療療效評(píng)價(jià)［J］.國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，37(3):176-180.