耐藥結(jié)核桿菌原核類泛素蛋白(Pup)-蛋白酶體系統(tǒng)基因表達的研究①

何 麗 雷 英 吳 芳 章 樂 吳江東 曹旭東 朱 彬 鄔 博 李瑞山 張玉清 王 釗張萬江 (石河子大學醫(yī)學院病理生理學教研室/石河子大學《新疆地方與民族高發(fā)病》教育部重點實驗室，石河子 832002)

結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)導致的感染依然是世界范圍內(nèi)嚴重的公共衛(wèi)生問題，也是我國重點控制的疾病之一。Mtb 的高耐藥率和耐藥Mtb 菌株的不斷流行與傳播，加之HIV 患者伴有結(jié)核病的發(fā)生，使Mtb 感染成為僅次于AIDS 的致死性傳染性疾病。據(jù)WHO 資料顯示，中國現(xiàn)有的耐藥結(jié)核病患者數(shù)占全球20%左右，仍然面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。至今，Mtb 的耐藥機制尚不清楚，新疆地區(qū)Mtb 耐藥性較全國更為嚴峻復雜［1，2］，因此，研究和闡明Mtb 的耐藥機制仍值得關(guān)注。

Mtb 是一種已知的存在蛋白酶體的少數(shù)細菌之一，Pup-蛋白酶體在Dop、Mpa、PafA 等輔助因子的作用下，介導被標記蛋白質(zhì)的降解。Mtb 中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質(zhì)降解過程:Pup 的C 端在去酰胺酶Dop 催化和PafA 連接酶的作用下，通過水解ATP，Pup C 端磷酸化，并催化其與底物蛋白連接;Pup 標記的蛋白質(zhì)通過Pup C 端與Mpa N 端相互作用，Mpa 傳遞底物蛋白到蛋白酶體的核心區(qū)域，同時Dop 促使去Pup 化，使Pup 重復利用;底物經(jīng)由蛋白酶體被降解［3］。Mtb 中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的特異性及生物化學作用，不僅是Mtb 非復制階段持續(xù)存留在宿主體內(nèi)的決定因素，也是使蛋白質(zhì)可被針對性降解的重要參與者，同時Pup-蛋白酶體系統(tǒng)可調(diào)控Mtb 感知宿主微環(huán)境變化，并產(chǎn)生適當?shù)募毎磻?，使之更好的適應宿主微環(huán)境變化以及逃避宿主的免疫監(jiān)視和殺滅，在宿主體內(nèi)生存、繁殖和致病等。

目前尚未有Mtb Pup-蛋白酶體系統(tǒng)與Mtb 耐藥機制的相關(guān)性報道。本研究旨在通過對Mtb 藥物敏感 菌 株、INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、EB-Mtb 和MDR 分別在原始耐藥狀態(tài)下、經(jīng)低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物的選擇性壓力作用培養(yǎng)后，檢測各組Mtb菌株中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的Pup 基因、Dop 基因、Mpa 基因和PafA 基因的表達水平，探討分析經(jīng)不同濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用后，各組耐藥Mtb 臨床分離株中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的Pup 基因、Dop 基因、Mpa 基因和PafA 基因的表達與新疆地區(qū)廣泛流行的耐藥Mtb 臨床分離株耐藥性的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 結(jié)核桿菌國際標準強毒株H37Rv 菌株來源于中國食品藥品檢定研究院，由本實驗室培養(yǎng)傳代保存。單純耐異煙肼的Mtb 臨床分離株(INH-Mtb)、單純耐利福平的Mtb 臨床分離株(RFP-Mtb)、單純耐鏈霉素的Mtb 臨床分離株(SMMtb)、單純耐乙胺丁醇的Mtb 臨床分離株(EBMtb)、耐多藥的Mtb 臨床分離株(MDR)各5 株，共25 株均由本實驗室采集樣本并保存。

1.1.2 儀器與試劑 SYBR GreenⅠ實時定量PCR儀(羅氏公司)，TC3000 PCR 儀(英國Techne 公司)，Gel Doc2000 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-RAD 公司產(chǎn)品)，紫外分光光度計Nanodrop 2000;細菌RNA提取試劑盒RNeasy Plus Universal Mini Kit(德國QIAGEN 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo 公司)，熒光定量試劑盒ULtraSYBR Mixture(北京康為世紀生物科技有限公司)，異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇、蛋白酶K、DEPC 均購自美國Sigma 公司，溶菌酶購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物誘導體系的建立 向7H9 液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期的各耐藥Mtb 菌株中，分別加入低濃度抗結(jié)核藥物(INH 的濃度為1 μg/ml，RFP 的濃度為50 μg/ml，SM 的濃度為10 μg/ml，EB的濃度為5 μg/ml)，和高濃度抗結(jié)核藥物(INH 的濃度為10 μg/ml，RFP 的濃度為250 μg/ml，SM 的濃度為100 μg/ml，EB 的濃度為50 μg/ml)，誘導培養(yǎng)72 h［4］，4 000 r/min 離心收集細菌，然后提取各耐藥Mtb 菌株總RNA。

1.2.2 Mtb 培養(yǎng)及總RNA 提取 將改良羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)至3～4 周的Mtb 菌株研磨成均勻的菌懸液，以0.4 個麥氏濃度接種至10 ml 的7H9 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期;4℃、4 000 r/min離心15 min，收集菌體。取4～5 次鉑金環(huán)的菌體加入300 μl 1 ×TE，混合吹懸，于80℃滅活30 min。加入80 μl、100 mg/ml 溶菌酶，20 μl、0.2 g/ml 蛋白酶K，渦旋震蕩10 min，靜置10 min，37℃水浴5 h。按照Rneasy Plus Universal Midi Kit 要求，加入600 μl QIAzol 裂解試劑，放置10 min。加入100 μl gDNA Elininator Solution，蓋上管蓋，強力混勻15 s。加入180 μl 氯仿，蓋上管蓋，強力混勻15 s，靜置3 min 后12 000 r/min，4℃離心15 min，液體分為3 層，將上層液相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入1 體積70%乙醇，槍頭吹打徹底混勻后將液體置于2 ml 收集管中的RNeasy Mini spin column 上，輕蓋上管蓋≥8 000 r/min 離心15 s，棄流出液。在RNeasy Mini spin column 上加入700 μl Buffer RWT，≥8 000 r/min 離心15 s 洗膜，棄流出液。在RNeasy Mini spin column 中加入500 μl Buffer RPE，≥8 000 r/min 離心15 s 洗膜，棄流出液。在RNeasy Mini spin column 中加入500 μl Buffer RPE，≥8 000 r/min 離心2 min，洗膜棄流出液。將RNeasy Mini spin column 置于新的2 ml 收集管，全速離心1 min。將RNeasy Mini spin column 置于一個新的1.5 ml 收集管，直接向膜上加入30～50 μl RNase-free 水，≥8 000 r/min 離心1 min 洗脫RNA，將洗脫液再加入到膜上，≥8 000 r/min 離心1 min 洗脫RNA。用Nanodrop2000 紫外分光光度計和瓊脂糖電泳的方法檢測各耐藥Mtb 菌株所提取的RNA 濃度及總RNA，置于-80℃保存。

1.2.3 總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄反應 Mtb 總RNA 在冰上解凍混勻，置于冰上，按照試劑盒要求依次將試劑加到無酶管中，RNA 3 μl，oliga(dT)primer 1 μl，water，nuclease-free 8 μl，65℃孵育5 min，在冰上迅速降溫1 min，輕輕混勻。按照指定順序加入以下試劑:4 μl 5 ×Reaction Buffer，1 μl Ribolock Rnase Inhibitor，2 μl 10 mmol/L dNTP Mix，1 μl RevertAid MMulv-Transcriptase(RT)，混勻后42℃孵育50 min，70℃孵育5 min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 于-20℃凍存。

1.2.4 實時熒光定量PCR 檢測Mtb Pup 基因、Dop基因、Mpa 基因和PafA 基因的表達 根據(jù)NCBI 上提供的Mtb H37RV 菌株P(guān)up 基因、Dop 基因、Mpa基因和PafA 基因的序列，使用Primer5 和Oligo 6 軟件設計Pup 基因、Dop 基因、Mpa 基因和PafA 基因以及內(nèi)參基因SigA 的寡核苷酸引物，具體引物見表1。循環(huán)參數(shù):95℃10 min ;95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min;72℃最后延伸5 min;共40個循環(huán)。每次實驗對照株和耐藥株P(guān)up 基因、Dop基因、Mpa 基因和PafA 基因cDNA 各設3 個平行反應孔。采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR 儀配套的SDS2.1 軟件完成數(shù)據(jù)采集。根據(jù)△△Ct 法［5］的要求，求出每份樣本的△△Ct 值，然后求每類樣本△△Ct 的均值和標準差，繼而根據(jù)基因表達量=2-△△CT的公式進行計算，求出標準對照組樣本(本研究為Mtb 原始狀態(tài)菌株)的目的基因表達量為1時實驗組樣本目標基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。對抗結(jié)核藥物敏感Mtb 菌株和各耐藥Mtb 菌株的△△Ct 值進行正態(tài)性檢驗以及方差齊性檢驗，采用±s 表示。比較原始耐藥的Mtb 菌株與經(jīng)不同濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用培養(yǎng)后的Mtb 菌株中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的Pup 基因、Dop 基因、PafA 基因和Mpa 基因相對表達量，統(tǒng)計分析上述各組耐藥Mtb 中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)基因表達水平是否有統(tǒng)計學差異，采用One-Way ANOVA 單因素方差分析。

表1 Pup 基因、Dop 基因、Mpa 基因和PafA 基因及內(nèi)參基因SigA 的引物序列Tab.1 Primer sequences of Pup gene，Dop gene Mpa gene，PafA gene and reference gene SigA

2 結(jié)果

2.1 各組Mtb 菌株總RNA 的鑒定 提取各耐藥Mtb 菌株的總RNA，使用Nanodrop2000 紫外分光光度計測量，吸光度比值(A260/A280)在1.7～2.0 之間，且A260 大于1，濃度為200～300 ng/μl，并利用1.2%的普通瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA 進行鑒定，23S RNA 和16S RNA 均清晰可見，說明提取的總RNA 完整。

2.2 各組Mtb 菌株P(guān)up 基因的相對表達量 各耐藥Mtb 菌株臨床分離株分別在原始狀態(tài)、低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用培養(yǎng)后，Pup 基因的相對表達量如圖1 所示，Pup 基因的△△Ct 值見表2 。

2.2.1 在低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Pup 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達分別下調(diào)74%、23%、28%、57%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中的表達下調(diào)87%倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2.2 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Pup 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達分別下調(diào)58%、37%、43%、78%(P＜0.05);EB-Mtb組中上調(diào)1.02 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2.3 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb相比，Pup 基因在RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 上調(diào)1.61、1.55、1.37 倍，在INH-Mtb 組中的表達下調(diào)78%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在EB-Mtb 組中的表達上調(diào)1.17 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3 各組Mtb 菌株Dop 基因的相對表達量 Mtb臨床分離株分別在原始狀態(tài)、低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用培養(yǎng)后，Dop 基因的相對表達量如圖2 所示，Dop 基因的△△Ct 值見表3 。

圖1 Pup 基因的mRNA 表達水平Fig.1 mRNA expression levels of Pup

表2 Pup 基因在不同菌株中的△△Ct 檢測結(jié)果(n=5)Tab.2 Pup gene in different strains of △△Ct test results(n=5)

表3 Dop 基因在不同菌株中的△△Ct 檢測結(jié)果(n=5)Tab.3 Dop gene in different strains of △△Ct test results(n=5)

2.3.1 在低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Dop 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達上調(diào)1.33、1.63、1.14、2.88倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中上調(diào)1.01 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3.2 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Dop 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達上調(diào)2.62、2.49、1.69、2.95 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中的表達上調(diào)1.02 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.3.3 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb相比，Dop 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb 組中表達上調(diào)1.98、1.52、1.47 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb、MDR 組上調(diào)1.01、1.03 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.4 各組Mtb 菌株P(guān)afA 基因的相對表達量 Mtb臨床分離株分別在原始狀態(tài)、低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用培養(yǎng)后，PafA 基因的相對表達量如圖3 所示，PafA 基因的△△Ct 值見表4 。

2.4.1 在低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，PafA 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR中的表達上調(diào)1.69、1.30、1.58、1.32 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中上調(diào)1.02 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.4.2 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，PafA 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 中的表達上調(diào)2.16、1.48、2.02、2.21 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);EB-Mtb 組上調(diào)1.12 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.4.3 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb相比，PafA 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR組中的表達分別上調(diào)1.28、1.14、1.28、1.67 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中表達上調(diào)1.10 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.5 各組Mtb 菌株Mpa 基因的相對表達量 Mtb臨床分離株分別在原始狀態(tài)、低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物的抗生素選擇壓力作用培養(yǎng)后，Mpa 基因的相對表達量如圖4 所示，Mpa 基因的△△Ct 值見表5。

圖2 Dop 基因的mRNA 表達水平Fig.2 mRNA expression levels of Dop

圖3 PafA 基因的mRNA 表達水平Fig.3 mRNA expression levels of PafA

表4 PafA 基因在不同菌株中的△△Ct 檢測結(jié)果(n=5)Tab.4 PafA gene in different strains of △△Ct test results(n=5)

2.5.1 在低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Mpa 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中表達上調(diào)3.05、1.79、1.31、2.27 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中的表達上調(diào)1.30 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

表5 Mpa 基因在不同菌株中的△△Ct 檢測結(jié)果(n=5)Tab.5 Mpa gene in different strains of △△Ct test results(n=5)

圖4 Mpa 基因的mRNA 表達水平Fig.4 mRNA expression levels of Mpa

2.5.2 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與原始狀態(tài)下Mtb 臨床分離株相比，Mpa 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達上調(diào)1.63、3.22、1.13、3.94 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb 組中的表達上調(diào)1.43 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.5.3 在高濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb，與低濃度抗結(jié)核藥物條件下培養(yǎng)的各組Mtb相比，Mpa 基因在RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達上調(diào)1.80、1.32、1.74 倍，在INH-Mtb 組中下調(diào)0.53 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);在EB-Mtb組中上調(diào)1.10 倍，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

3 討論

近年全球范圍內(nèi)，結(jié)核病的高耐藥率和耐藥Mtb 菌株的不斷流行與傳播已成為全球結(jié)核病控制工作中的一個值得關(guān)注的問題。全世界約有1/3的人口感染結(jié)核桿菌，全球新發(fā)結(jié)核病耐多藥患者幾乎有一半來自中國和印度。2000 年全國結(jié)核病流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，初始耐藥率和獲得性耐藥率分別為18.7%和46.5%，初始耐多藥率和獲得性耐多藥率分別為7.6%和17.1%［6］。

Mtb 的耐藥機制主要分為四種:①通過主動外排機制，將已經(jīng)進入菌體內(nèi)部的抗生素泵至菌體外，使菌體內(nèi)抗菌藥物含量減少。②通過產(chǎn)生滅活酶類改變藥物的化學組成結(jié)構(gòu)。③通過改變作用在細菌體內(nèi)藥物的靶位。④通過菌體組成成分阻斷藥物到達細菌體內(nèi)。近年研究發(fā)現(xiàn)，Mtb Pup-蛋白酶體系統(tǒng)主要介導和調(diào)控Mtb 蛋白質(zhì)的選擇性降解，對Mtb 在宿主體內(nèi)的生長、繁殖、滲透調(diào)節(jié)、毒性、致病性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

本實驗研究結(jié)果顯示:與原始狀態(tài)下耐藥Mtb菌株相比較，經(jīng)低濃度抗結(jié)核藥物壓力作用下培養(yǎng)后的各組Mtb 菌株，Pup 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達分別下調(diào)0.74、0.23、0.28、0.57 倍;Dop 基因表達分別上調(diào)1.33、1.63、1.14、2.88 倍;PafA 基因表達分別上調(diào)1.69、1.30、1.58、1.32 倍;Mpa 基因表達分別上調(diào)3.05、1.79、1.31、2.27 倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與原始狀態(tài)下耐藥Mtb 菌株相比較，經(jīng)高濃度抗結(jié)核藥物壓力作用下培養(yǎng)后的各組Mtb 菌株，Pup 基因在INH-Mtb、RFP-Mtb、SM-Mtb、MDR 組中的表達分別下調(diào)0.58、0.37、0.43、0.78 倍;Dop 基因表達分別上調(diào)2.62、2.49、1.69、2.95 倍;PafA 基因表達分別上調(diào)2.16、1.48、2.02、2.21 倍;Mpa 基因表達分別上調(diào)1.63、3.22、1.13、3.94 倍，差異有統(tǒng)計學意義;(P＜0.05)。并且在高濃度抗結(jié)核藥物(INH、RFP、SM)壓力作用下，各耐藥Mtb 菌株P(guān)up-蛋白酶體系統(tǒng)的Dop 基因、PafA 基因和Mpa 基因的表達水平均較低濃度抗結(jié)核藥物壓力作用下基因表達增加，表達存在差異。

抗結(jié)核藥物作為一種環(huán)境刺激信號，可使Mtb處于休眠狀態(tài)，降低自身的新陳代謝［7］，Mtb 在缺氧狀態(tài)時可處于休眠狀態(tài)從而維持生存。在抗結(jié)核藥物環(huán)境中，結(jié)核桿菌可通過調(diào)控菌壁通透性和細胞膜結(jié)構(gòu)降低結(jié)核桿菌胞內(nèi)氧濃度，使結(jié)核桿菌處于休眠狀態(tài)，休眠的結(jié)核桿菌能夠?qū)Χ喾N一線抗結(jié)核藥物產(chǎn)生惰性［8］，在此狀態(tài)下，結(jié)核桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)可能通過自身的蛋白酶體清除受損蛋白質(zhì)，并調(diào)控Dop 基因、PafA 基因和Mpa 基因表達上調(diào)來適應不利的生存環(huán)境刺激，從而存活并保持休眠狀態(tài)，提示上述原因均可能與耐藥有關(guān)。Mtb 蛋白酶體可通過對Mtb 的核酸、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)等的調(diào)控而影響體外的Mtb 正常生長狀態(tài)［9］。Mtb 底物蛋白FabD 可催化生物外膜的脂肪酸和分枝菌酸合成，分枝菌酸在降低疏水性、抗生素透過，以及使菌體在宿主體內(nèi)處于持留狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，持留菌會對抗結(jié)核藥物產(chǎn)生明顯的耐受［10］，在細菌的耐藥性的產(chǎn)生中具有重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛋白酶體降解包含F(xiàn)abD、PanB、Mpa、Ino1、Icl、MtrA 等［11］50 多種底物蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，高表達MtrA 底物蛋白可以加速Mtb 的清除，但體外培養(yǎng)中高表達MtrA的Mtb 菌株可以正常生長［12］。有研究表明，在高濃度藥物的誘導下，結(jié)核分枝桿菌為適應環(huán)境對其生存的不利影響，代謝途徑也向乙醛酸支路轉(zhuǎn)換進入持留狀態(tài)，由于代謝途徑的轉(zhuǎn)變，使得原來對細菌敏感的藥物變得無效，此時，可檢測到Icl 的高表達［13］。目前發(fā)現(xiàn)的這些底物蛋白與Mtb 耐藥性存在關(guān)系，仍需進一步研究。另一方面，為對抗抗生素壓力不利環(huán)境，Pup-蛋白酶體系統(tǒng)PafA 基因和Mpa基因產(chǎn)物可調(diào)控結(jié)核桿菌蛋白酶體系統(tǒng)的抗活性中間能力［14，15］，同時調(diào)控Mpa 基因上調(diào)編碼更多具有ATP 水解功能的蛋白質(zhì)，Mtb 在抗結(jié)核藥物壓力下生存有可能影響到底物蛋白累積，導致基因表達間接升高。

我們分析產(chǎn)生本研究結(jié)果的原因可能為:各耐藥Mtb 菌株為對抗抗結(jié)核藥物壓力作用的不利環(huán)境，通過調(diào)控Mtb 菌株中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的Dop基因、PafA 基因、Mpa 基因表達水平的上調(diào)，調(diào)控Mtb 菌株P(guān)up-蛋白酶體系統(tǒng)降解相關(guān)底物蛋白與靶蛋白的活性，從而調(diào)控結(jié)核桿菌的耐藥性的產(chǎn)生。本實驗結(jié)果中，與原始耐藥狀態(tài)相比較，Mtb 耐一線抗結(jié)核藥物菌株在低濃度和高濃度抗結(jié)核藥物選擇性壓力作用下，Pup 基因的表達水平均下調(diào)。這可能與Pup 基因受抗生素選擇性壓力作用，使Pup 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致出現(xiàn)Pup 蛋白不同的折疊方式，致使與其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)生上調(diào)有關(guān)。Pup 基因是否對Mtb 的耐藥性存在調(diào)控作用，需進一步研究。

但是，與低濃度藥物組相比，Pup 基因和Mpa 基因在高濃度組的NIH-Mtb 菌株中mRNA 的表達水平下調(diào)，可能與異煙肼耐藥相關(guān)的基因KatG 有關(guān)。有研究表明［16］，KatG 的增加，可以使異煙肼耐藥的結(jié)核桿菌恢復對藥物的敏感性，而該基因的缺失則可提高其對異煙肼的耐藥性。Pup 基因和Mpa 基因在高濃度抗生素藥物INH-Mtb 菌株中均為低表達狀態(tài)，可能與高濃度的藥物環(huán)境抑制了KatG 基因的表達，對藥物的敏感性降低，從而致使Pup 基因和Mpa 基因在高濃度抗生素壓力下的mRNA 表達水平降低。

本實驗研究結(jié)果表明，在不同濃度抗結(jié)核藥物選擇性壓力作用下，新疆地區(qū)流行的各耐一線抗結(jié)核藥物的Mtb 菌株中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的Pup 基因、Dop 基因、PafA 基因和Mpa 基因表達水平存在一定差異，提示Mtb 菌株的Pup-蛋白酶體系統(tǒng)可能與其耐藥性有關(guān)，其所作用的底物蛋白質(zhì)和靶蛋白是否是結(jié)核桿菌的潛在藥物靶點，仍需進一步研究。

［1］金 鑫.1979-2000 年新疆結(jié)核病流行狀況及防治對策［J］.地方病通報，2003，18(1):50-52.

［2］賈衛(wèi)，吳衛(wèi)東，張 偉，等.WHO 新疆結(jié)核病耐藥監(jiān)測報告［J］.中國防癆雜志，2008，30(4):307-310.

［3］汪春軍，林 進，張俊杰.原核生物類泛素蛋白Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，2011，38(12):1091-1098.

［4］Gupta AK，Katoch VM，Chauhan DS，et al.Microarray analysis of efflux pump genes in multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis during stress induced by common anti-tuberculosis drugs［J］.Micro Drug Resist，2010，16(1):21-28.

［5］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method［J］.Methods，2001，25:(4)402-408.

［6］全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查技術(shù)指導組，全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查辦公室.2000 年全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告［J］.中國防癆雜志，2002，24(2):65-108.

［7］Gonzalo-Asensio J，Mostowy S，Harders-Westerveen，et al.Phop:A missing piece in the intricate Puzzle of Mycobacterium tuberculosis virulence［J］.Plos One，2008，3(10):3496.

［8］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393(6685):537-544.

［9］Gandotra S，Schnappinger D，Monteleone M，et al.In vivo gene silencing identifies the Mycobacterium tuberculosis proteasome as essential for the bacteria to persist in mice［J］.Nat Med，2007，13(12):1515-1520.

［10］de Wit D，Wootton M，Dhillon J，et al.The bacteria DNA content of mouse organs in the Cornell model of dormant tubereulosis［J］.Tuber Lung Dis，1995，76(6):555-562.

［11］Pearce MJ，Arora P，F(xiàn)esta RA，et al.Identification of substrates of the Mycobacterium tuberculosis Proteasome［J］.EMBO J，2006，25(22):5423-5432.

［12］Fol M，Chauhan A，Niar NK，et al.Modulation of Mycobacterium tuberculosis proliferation by MtrA an essential two-component response regulator［J］.Mol Microbiol，2006，60(3):643-657.

［13］First-line chemotherapy in the retreatment of bacteriological relapses of Pulmonary tuberculosis following a Shortcourse regimen［J］.Lancet，1976，1(7952):162-163.

［14］Lamichhane G，Raghunand TR，Morrison E，et al.Deletion of a Mycobacterium tuberculosis proteasomal ATPase homologue gene produces a slow-growing stain that persists in host tissues［J］.J Infect Dis，2006，194(9):1233-1240.

［15］Cerda-Maira FA，Pearce MJ，F(xiàn)uortes M，et al.Molecular analysis of the prokaryotic ubiquitin-like protein(Pup)conjugation pathway in Mycobacterium tuberculosis［J］.Mol Microbiol，2010，77(5):1123-1135.

［16］Zhang Y，Heym B，Allen B，et al.The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis［J］.Nature，1992，358(6387):591-593.